专利名称：一种用于检测甲肝病毒的分子马达生物传感器试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明是关于食源性病毒快速检测技术的一种。
背景技术：
传统甲肝病毒(HAV)的检测方法是通过细胞培养，但甲肝病毒不仅增殖时间长、增殖能力低，且不形成细胞病变，难以满足检测的要求。20世纪80年代建立的RT-PCR和ICC/PCR(integrated cell culture,PCR)等检测技术提高了检测的灵敏度和特异性,在甲肝病原监测中有很好的应用，但其检测时间仍需5-6h，且容易受PCR扩增产物污染而产生假阳性的可能，这类技术仍然需要依据放射性物质标记的RNA探针或通过凝胶电泳中的特定RNA条带来判断检测结果，且整个过程需要扩增、电泳等步骤，操作繁琐。不仅费时费力，给使用亦带来很大不便。因 此急需可靠有效的快速检测方法，缩短窗口期，避免因食源性甲肝病毒感染而引起的甲型肝炎的发生和流行。
发明内容
本发明核心技术是利用载色体Chromatophore上的FOFl-ATPase分子马达生物传感器，集成核酸探针识别、荧光探针标记与检测等技术，建立了一个全新概念的快速检测技术体系。利用ATP酶作为载体对目标物进行检测具有灵敏度高、特异性强、快速的特点。在FtlF1-ATPase分子马达连接上特异的核酸探针，可以实现对特定食品微生物的快速、特异性、高通量的检测。本发明可将检测时间缩短至lh，且检测灵敏度能达到0.01ng/mL，满足现有的食源性病毒检测范围。
附图1为分子马达生物传感器模式图(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均为ATP合酶亚基)，I为ε亚基抗体,2为链霉亲和素(Strptavidin), 3为N_biotin, 4为甲肝病毒特异性探针，5为甲肝RNA链。附图2为chix) HAV对不同种病毒的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的病毒种类。附图3为chro HAV对13个添加甲肝病毒食品样品和2个不含有甲肝病毒食品样品的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的样本，I 15为食品检测样本编号。
具体实施例方式根据甲肝病毒各型设计具有各型共有的特异性的核酸探针5’-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-3’，其中探针的5’用生物素进行标记。将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面，利用突光探针DHPE标记的载色体Chromatophore上的FtlF1-ATPase分子马达生物传感器即可对待测样本的RNA进行检测。当样品为甲肝病毒RNA时，检测时与生物传感器结合的同时启动ATP合成，体系的荧光值会发生明显的变化，通过这一变化即可判断样本为阳性。为此，我们设计了一个试剂盒，可以方便、快速对甲肝病毒进行检测。试剂盒组成:
权利要求
1.本发明要求保护的内容有:异性核酸探针与FtlF1-ATP合酶连接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亚基上依次连接ε亚基抗体、生物素、链霉亲和素、生物素标记的甲肝病毒特异性探针。
2.剂盒检测体系的反应条件:室温温育lOmin。
3.成buffer、启动buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化镁5mM,Tricine50mM,憐酸氢二钾 5mM ;启动 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化钠，2.7mM氯化钾， IOmM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾。
全文摘要
一种用于检测甲肝病毒的分子马达生物传感器试剂盒，属于食源性病毒快速检测领域，主要解决传统检测方法培养增殖周期长、增殖能力低，不形成细胞病变，难以满足检测要求。本发明的核心技术是利用载色体Chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋转，通过旋转它建立了催化位点与质子转运之间的偶联。首先在ATP合酶的ε亚基上连接甲肝病毒各型的共有序列特异性探针，将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化ATP合成10分钟后的ATP产生量，ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量，而H+的多寡通过H-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。本方法具有反应时间短，抗原抗体结合充分，操作使用方便等特点，缩短了反应时间，提高了检测灵敏度。本试剂盒可对待测食品样本中的甲肝病毒进行快速、灵敏、高通量的检测。
文档编号C12R1/93GK103088153SQ201210406050
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张捷, 许美玲, 张雷, 张惠媛, 刘岩, 卢晓宇, 顾德周, 汪琦, 张昕, 王佩荣, 陈广全, 乐加昌 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 临沂出入境检验检疫局