专利名称：一种早代鉴定转基因玉米纯合体的方法
技术领域：
本发明涉及农业育种技术领域，尤其涉及的是一种早代鉴定转基因玉米纯合体的简易方法。
背景技术：
玉米已成为全球种植面积最大的粮、经、饲三元谷类作物，随着分子生物学和生物技术的发展，玉米转基因技术已经成为研究玉米基因功能和创制高抗、优质、高产玉米新品种的重要手段之一。而鉴定目的基因纯合的玉米转化体是玉米转基因技术中一个必不可少的环节。由于转基因沉默现象的存在，人们往往选择目的基因以单拷贝或低拷贝形式插入 的转基因TO代进行下一步的纯合体筛选。常规的方法是对TO代(转基因当代)转化体自交获得Tl代转基因植株，然后对每个独立分离的Tl代转基因植株产生的T2代个体进行转基因分离比率的研究。通常采用PCR方法鉴定出T2代不再分离的转基因株系(即不再出现不含目的基因植株的株系)，被鉴定为纯合的转基因株系，此方法不仅工作量大、而且成本高、周期长，不利于快速获得纯合的转基因株系和转基因玉米新品种的育成。2009年刘楠等建立了一种利用4个PCR引物的多重PCR反应来鉴定转基因玉米纯合体的方法，用该方法鉴定玉米转基因纯合体的前提条件是目的基因在玉米基因组DNA中插入位点序列已知。而弄清楚某个外源目的基因在植物基因组中的插入位点则是转基因检测中另外一个技术难题，且操作繁琐，需要较长的周期，尤其是对一些研究体系不够完善的科研单位。对于很多转基因玉米而言，在Tl代尚未鉴定出目的基因在玉米基因组DNA的插入位点，因此该方法在早代鉴定出转基因玉米纯合体的应用上还受到很大的限制。2004年，杜春芳等提出了用基于TaqMan探针的双重定量PCR技术来鉴定Tl代转基因纯合体。该技术在定量PCR反应体系中，加入2对PCR引物和TaqMan探针。第I对为扩增目的基因的引物和探针，另I对为扩增参考基因的引物和探针。而目的基因和参考基因TaqMan探针5’端标记了不同的荧光报告基团，可在同一 PCR反应中同时扩增目的基因和参考基因，根据荧光信号的强弱分别计算出样品中目的就基因和参考基因的Ct值，继而得出二者间的比例，并以此鉴定出纯合的Tl代转基因植株。基于TaqMan探针的双重定量PCR技术的缺点主要表现在以下几个方面，一是探针设计难度大，既要避免二级结构，又要严格控制GC含量，避免重复的核酸序列，避免引物与探针形成互补，否则极大影响扩增效率导致检测结果不准确。其二，探针的合成和双荧光标记成本高，且不能通过溶解曲线判断扩增产物的特异性。其三，该方法主要用于鉴定双子叶植物烟草和拟南芥转基因纯合体。而在不依赖于已知目的基因插入位点及侧翼序列的情况下，如何快速、简易地鉴定出转基因玉米纯合体，目前还未见相关方法报道。
发明内容
为解决针对传统技术及现有相关技术的存在的缺点，发明了一种不依赖于目的基因在玉米基因组中插入位点，且低成本、高效率、操作简易的转基因玉米纯合体的早代检测方法，即基于SYBR Green I染料荧光定量PCR技术的转基因玉米纯合体早代鉴定方法。本发明技术方案如下
一种早代鉴定转基因玉米纯合体的方法，包括以下步骤A1、提取Tl代转基因玉米DNA ;A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性Tl代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效率;A5、计算目的基因在各Tl代植株中的相对含量;A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于I时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于O. 5时，该植株为杂合体。SYBR Green I是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，在PCR反应过程中随着扩增产物的积累荧光信号不断增强，可以根据荧光信号强弱分辨样品间仅2倍起始DNA和RNA水平上的差异。目前已广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化以及比较不同组织或细胞中的mRNA表达差异。鉴于Tl代单拷贝转基因株系中杂合体和纯合体最本质的区别是，在杂合体中目的基因只存在于同源染色体的中的一条染色体，而纯合体中目的基因则同时存在于同源染色体中的两条染色体，即纯合体中目的基因含量是杂合体中的2倍。这种差异可以被基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR技术灵敏地检出。本发明利用低成本的SYBR Green I作为荧光染料，建立了基于荧光定量PCR的快速转基因玉米纯合体检测技术。由于基于SYBG Green I的荧光定量PCR技术不需要设计复杂的特异探针，降低了整个技术的难度，同时也极大的减少了技术成本。另外，无须了解目的基因在植物基因组中的整合位点和侧翼序列，以玉米基因组中的单拷贝基因为参照基因，仅通过简单的普通PCR和荧光定量PCR等操作，同时对Tl代阳性植株中参考基因与目的基因Ct比值进行分析，即能对单拷贝转基因玉米在Tl代高效、简易地鉴定出纯合体。本发明适用于对单拷贝转基因玉米进行早代纯合体的鉴定。
图I :参考基因6觀2] 26167856标准曲线，扩增效率94.2%，相关系数0.998 ；图2 :目的基因bar标准曲线，扩增效率94.5%，相关系数O. 997 ；图3 :参考基因GRMZM2G167856的溶解曲线，溶解峰单一，产物Tm在80_90°C ；图4:目的基因bar的溶解曲线，溶解峰单一，产物Tm在80_90°C ；图5 :含bar基因的表达载体；图6 =Southern杂交鉴定TO代目的基因拷贝数；图7 :来自于同一 TO代植株的9个Tl植株PCR扩增出特异条带，方框处表示扩增出的特异性目的条带；图8 =Tl-I植株对应的T2代株系PCR扩增bar基因情况；图9 Τ1-3植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况；图10 Τ1-4植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况；图11 Τ1-8植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况，图中O表示未扩增出bar基因特异条带的植株，I表示扩增出bar基因特异条带的植株；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。2. 2. ITl代转基因玉米DNA提取对单个阳性TO转基因玉米进行人工套袋自交，获得TO代果穗。从每个TO代植株收获的一穗种子进行单粒播种，获得对应的Tl代转基因植株，并进行编号。对来自同一个TO代的Tl代植株，随机抽取20株左右，在3-4叶期分别提取叶片总DNA。I)取叶片2g，剪碎后于液氮中迅速研磨成粉(研磨后的叶片占离心管体积的1/4到 1/3)。 2)将上述冻粉迅速转入预冷的离心管中，迅速加入900 μ I已预热到65°C的CTAB提取液中，迅速混勻，于65°C水浴40min。期间轻柔混勻3 4次(每隔IOmin混勻一次)。3)取出离心管，冷至室温，加入等体积(ΙΟΟΟμ I)的氯仿-异戊醇(氯仿异戊醇=24 : I, ν/ν),在摇床上轻轻振荡摇勻lOmin。4)室温下离心IOmin (IOOOOrpm)，取上清液转至新的2ml离心管中，再加入ΙΟΟΟμ I的24 : I的氯仿-异戊醇，在摇床上轻轻振荡摇匀lOmin。5)室温下离心IOmin(IOOOOrpm),取上清液至新的2ml离心管中，加入等体积已预冷至_20°C的异丙醇，轻轻摇匀即可见絮状DNA沉淀，若产量低，于轻轻摇匀后放置于_20°C冰箱中Ih。6)用针头将絮状沉淀挑于新的I. 5ml离心管中，加入Iml的70%乙醇脱洗两次，再用Iml无水乙醇脱洗一次。7)将DNA自然晾干，或者真空干燥，加入100 μ I灭菌ddH20溶解，再加入I μ I RNA酶过夜。8)紫外分光光度仪测定DNA浓度，用灭菌的ddH20保存浓度调至500ng/ μ 1，工作浓度调至50ng/ μ I。取IOOngDNA用于0. 7 %的琼脂糖凝胶电泳检测质量，其余DNA保存于-20°C备用。2. 2. 2参照基因的选择及目的基因和参照基因PCR引物的设计选择 maizesequence 数据库(http://www.maizesequence.org)中公布的玉米内源的单拷贝基因(如 GRMZM2G167856、GRMZM5G861678、GRMZM2G093195、GRMZM2G024993 等)作为参考基因，使用引物设计软件Primer5. O根据基因序列设计特异普通PCR引物和荧光定量PCR引物。普通PCR引物和荧光定量PCR引物Tm值均控制在58-61 °C，避免引物发夹结构、弓I物二聚体、以及引物与模板DNA的错配，弓丨物长度均控制在17-24bp，预期扩增产物长度分别控制在300-600bp和120-250bp之间。例转基因玉米目的基因为bar，以GRMZM2G167856为参考基因，从Tl代转基因玉米中鉴定bar基因的纯合体。(I) bar基因的一对普通PCR引物如下，扩增产物大小约450bp Fb05/ GCACCATCGTCAACCACTACAT3'Rb05/ CTGCCAGAAACCCACGTCAT3'(2)bar基因的一对荧光定量PCR引物如下，扩增产物大小约为200bp Fb 5/ AGGGCTTCAAGAGCGTGGT3'，
Rb :5' ATTTAGGTGACGGGCAGGAC3'；(3)参考基因GRMZM2G167856的一对普通PCR引物如下，扩增产物大小约400bp FC0:5, AAGGACAGGAGCGACAGGC3,RC05/ TTCGGAAACCGGAGGACAT3,(4)参考基因GRMZM2G167856的一对荧光定量PCR引物如下，扩增产物大小约130bp FC 5/ CGTAAGCAGGTATGTATGAGGTT3;，RC 5/ GGCAGTGTTATGTGGGAATGT3'2. 2. 3普通PCR方法对阳性Tl代转基因植株进行预检测以上述获得的各个TI代植株的DNA (工作浓度)作为PCR模板，用引物Fbtl和Rb。进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下PCR Buffer 12. 5μ IdNTPs O. 4mMMgCl2 O. 4mMFb0 IOpmRb0 IOpmTemplate 200ngTaq DNA polymerase IU灭菌ddH20 upto25 μ IPCR反应程序如下第一步(预变性)94°C,4min第二步(PCR反应)94°C，40s ;60°C，40s ;72°C，lmin ;共 42 个循环第三步(延伸)72°C,6min第四步(保存)I2°C,forever重复扩增3次，将每一次均能扩增出450bp左右特异条带的植株用于下一步的鉴定。2. 2. 4证明基因特异扩增，获得基因扩增效率2. 2. 4. I标准曲线模版的制备对第2. 2. 3步鉴定出的阳性Tl代转基因植株，任选其一用于分别特异扩增目的基因bar和参考基因GRMZM2G167856。反应条件均同步骤2. 2. 3 ;反应体系为如下PCR Buffer 25 μ IDNA 模板200ngTaq 酶IUPrimer F 15pmPrimer R 15pmdNTP 0. 4mMMgCl2 0. 4mM灭菌ddH20 up to50 μ I(注此处扩增bar的反应体系中，引物F和引物R分别为Fbtl和Rbtl;扩增参考基因的反应体系中引物F和引物R分别为FCtl和RQ。)取2ul扩增产物，用O. 7%的琼脂糖凝胶检测二者扩增的特异性，并用PCR产物纯化试剂盒纯化其余PCR产物，然后均用ddH20定容至100 μ I。再用TE缓冲液将其逐级稀释成 10' 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7 等 7 个梯度模板。2. 2. 4. 2标准曲线的绘制分别以两个基因以上所述的7个梯度浓度(10' 10' 10' 10' 10' 10' 10〃)的扩增产物为模板，制备以下反应体系和反应程序进行首次荧光定量PCR(荧光定量仪选用Bio-Rad iQ52. O)，绘制参考基因和目的基因的标准曲线，确保扩增产物相关系数R2 >O. 99，扩增效率(E)在80% -120%之间(图I、图2)，且溶解曲线峰单一，产物Tm值在80-900C (图 3、图 4)。 荧光定量PCR反应体系如下SYBR Green I (TaKaRa) 10μ IROX O. 4 μ I引物F:8pm引物R:8pm梯度DNA 模板I μ IddH20 up to20 μ I(注此处扩增bar的反应体系中，引物F和引物R分别为Fb和Rb;扩增参考基因的反应体系中引物F和引物R分别为FC和RC。)荧光定量PCR反应程序第一步预变性Reps I95。。， 30s第二步PCR反应Reps 4095 °C, 5s60 °C, 34s第三步Meltcurve95。。， 15s60。。， 60s95 °C, 15s2· 2· 5目的基因的相对定量以步骤2. 2. 3中各阳性Tl代转基因植株总DNA(工作浓度)为模板，采用荧光定量PCR分别扩增其参考基因和目的基因，反应体系同步骤2. 2. 4.2,反应体系如下(注保证某一个Tl代植株的目的基因和参考基因扩增在同一台荧光定量PCR仪上同时进行)。荧光定量PCR反应体系SYBR Green I (TaKaRa) 10 μ IROX O. 4μ I引物F:8pm
引物R:8pmDNA 模板IOOngddH20 up to20 μ I(注此处扩增bar的反应体系中，引物F和引物R分别为Fb和Rb;扩增参考基因的反应体系中引物F和引物R分别为FC和RC。)每个样品设3次技术重复。通过iQ5程序读出各样品的3个Ct值，求其平均，代入下列公式，计算目的基因在各Tl代植株中的相对含量(Rel Q) 目的基因 _ (1+￡参考基因..>_
相对含童 _的基因
(1+E目雌因)2. 2. 6检出转基因玉米纯合体当目的基因相对含量(Rel Q)约等于I时，该植株为纯合体；iRel Q约等于O. 5时，该植株为杂合体。实施例2与常规转基因玉米纯合体鉴定方法相比，由于本发明在不需要对T2代个体进行目的基因分离比例分析的情况下，可以针对单拷贝转基因玉米直接在Tl代鉴定出转基因纯合体，缩短鉴定周期至少120天(一个玉米生育期)，加快了玉米转基因育种的进程。利用现有技术在Tl代植株中鉴定出纯合的转化体必须了解转基因插入位点，这本身则是一个转基因领域的技术难题，需花费大量的时间，特别是对于一些研究技术不够完善的科研单位实施起来更为困难。而基于SYBR Green I染料的荧光定量技术目前已在大多数分子生物学实验室得到普及使用，与基于TaqMan探针的基因定量技术相比，它成本低、难度小、操作简单、周期短。以玉米基因组中的单拷贝基因为参照基因，同时对Tl代阳性植株中参考基因与目的基因Ct比值分析，即能在Tl代转基因植株中高效、简易地鉴定出纯合的转基因玉米。该方法的检出效果已通过T2代株系目的基因分离情况得以验证，准确率为100%。例将含目的基因bar的表达载体(图5)经过农杆菌介导法导入玉米自交系18-599，经过Southern杂交检测已筛选出了 I个单拷贝TO代转基因植株(图6)。通过本发明技术对此TO代植株后代进行纯合体鉴定。随机选择TO代植株自交获得的16个Tl代个体，经3次重复PCR检测阳性植株9株(图7)，再从其中随机抽取4株编号分别为Tl-1，Tl-3，Tl-4，T1-8，鉴定bar基因纯合体。经SYBR Green I定量PCR分析，参考基因GRMZM2G167856和目的基因bar的相关系数分别为O. 998、O. 997，扩增效率分别为O. 942、O. 945 (图I、图2)。Ct值及根据上述公式计算的目的基因bar的相对含量Rel Q见表I 表4，其中T1-1、T1-4、T1_8的Rel Q值分别为O. 45、0. 50、0. 48均接近于或等于O. 5，表明三者均为杂合体；而Τ1-3的Rel Q值为1.07，接近于I. 0，表明其为bar基因的纯合体。另一方面，经过常规的T2代bar基因分离情况分析，表明Τ1-1、Τ1-4、Τ1-8等三个植株对应的Τ2代株系均存在分离现象(即Τ2代株系中一些植株不能扩增出bar基因特异片段)(图8、图10、图11)，而T1-3对应的T2代株系不存在分离现象(即T2代株系中所有植株均能扩增出bar基因特异片段)(图9)。本发明获得的结果与常规纯合体鉴定方法的结果完全吻合。表I Tl-I荧光定量结果
权利要求
1.一种早代鉴定转基因玉米纯合体的方法，其特征在于，包括以下步骤:Al、提取Tl代转基因玉米DNA ;A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性Tl代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效 率；A5、计算目的基因在各Tl代植株中的相对含量;A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于I时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于0. 5时，该植株为杂合体。
全文摘要
本发明公开了早代鉴定转基因玉米纯合体的方法，包括以下步骤A1、提取T1代转基因玉米DNA；A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性T1代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效率；A5、计算目的基因在各T1代植株中的相对含量；A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于1时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于0.5时，该植株为杂合体。仅通过简单的普通PCR和荧光定量PCR等操作，同时对T1代阳性植株中参考基因与目的基因Ct比值进行分析，即能对单拷贝转基因玉米在T1代高效、简易地鉴定出纯合体。
文档编号C12Q1/68GK102952879SQ20121040559
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者沈亚欧, 潘光堂, 彭焕伟, 葛飞, 张志明, 林海建, 江舟, 赵茂俊, 杨珊, 罗旭, 张兵 申请人:四川农业大学