专利名称：一种鸽腺病毒的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鸽腺病毒的检测试剂盒。
背景技术：
鸽腺病毒感染是由腺病毒(Pigeon adenovirus，FADV)感染引起的急性传染病，在健康和发病的鸽子中均能分离到腺病毒[1]。1953年，Rowe等首次从扁桃体组织块培养物中分离出该病毒。此后众多生物科技工作者相继发现不同生物体的腺病毒[2]。1984年，Cousement首次叙述了比利时的纟鸟腺病毒感染[3]。鸽腺病毒对外界恶劣环境有较强的抵抗力，对脂溶剂也有抵抗力，抗热耐酸能力强，但不耐甲醛[4_5]。在4°C可以保存70天，50°C则可以保存10-20分钟，在56°C 2. 5-5分钟内会很快死亡[6]。鸽腺病毒必须在其致病因子诱导下才会致病，没有致病因子的影响，受 腺病毒感染的鸽子不会发病。鸽腺病毒在单独发病时一般不致死，但大多数感染的病鸽同时也会并发有其他的一些疾病[7_9]。目前鸽腺病毒没有十分有效的疫苗，不同生物的腺病毒有各自的特异性，不会交叉感染，所以不同动物的腺病毒疫苗也不可交叉使用。该病毒主要在鸽消化道和呼吸道中进行自我复制，在细胞内复制也会形成包涵体。肉眼可见病变以卡他性肠炎为主要病征。病鸽表现精神萎顿、沉郁、腹泻、排浅黄色黏液状粪便，贫血，黄疸，大腿肌肉出血严重的甚至会突然死亡。在早期有轻度呼吸道症状[1°]。对于成年鸽群，会造成鸽群产蛋量下降。主要的病理症状是肾脏肿胀、出血、心包积水、法氏囊及胸腺萎缩变小[1°_12]。鸽腺病毒的传播方式主要是垂直传播，由亲代传给子代。水平传播主要通过粪便，饲料，鸽笼等途径进行传播。一旦传入鸽群，则会迅速在鸽群中传播开来，通常在首次见到本病例后2d内全群发病。临床症状通常会在I周内消失，因为随着腺病毒很快地被清除，肠道上皮几天后可再生。但是如继发大肠埃希菌感染则导致更加严重和持久的疾病[3]。常规的诊断依靠电镜、免疫染色或病毒分离，但是这些技术费时、费力，而且敏感性也差。参考文献[I]De Herdt P，Ducatelle Rj Lepoudre C，et al. An epidemic of fatalhepatic necrosis of viral origin in racing pigeons(Columba livia)[J]. AvianPathol, 1995，24(3) :475-483[2]张俊峰，王之磊，周晓玲·禽的腺病毒病[J]. 2003. 6. 20:20-21[3]胡青海，黄建芳.鸽腺病毒感染[J]· 1999,21 (3) :67-68[4]Freick M，Muller H, RaueR. Rapid detection of pigeon herpesvirus, fowladenovirus and pigeon circovirus in young racing pigeons by multiplex PCR[J]. JVirol Methods, 2008，148(1-2):226-231[5]Vereecken M，de Herdt P，Ducatelle R. Adenovirus infections inpigeons:A review[J]. Avian Pathol，1998，27 (4):333-338[6]王兆平，沈建华，张海晓·鸽腺病毒病[J]· 2008，9 :41-43[7]Goryo M，Ueda Y，Umemura T，et al. Inclusion body hepatitis due toadenovirus in pigeons[J]. Avian Pathol, 1988，17(2):391-401[8]Hess M, Prusas C, Monreal G. Growth analysis of adenoviruses isolatedfrom pigeons in chicken cells and serological characterization of theisolates[J]. Avian Pathol, 1998, 27(2):196-199[9]Hess M, Prusas C, Vereecken M, et al. Isolation of fowl adenovirusesserotype 4 from pigeons with hepatic necrosis[J].Berl Munch Tierarztlffochenschr, 1998，111(4):140-142[10]智海东，王云峰，解生亮，等.禽腺病毒感染及其诊断[J]. 2010:33-35[IlJffada Y, Kondo H, Nakazawa M, et al. Natural infection with attaching and effacing Escherichia coli and adenovirus in the intestine of a pigeon withdiarrhea[J], J Vet Med Sci,1995, 57(3):531-533[12]Wang CH, Chang CM. Pathogenicity and gene analysis of adenovirus frompigeons with inclusion body hepatitis[J]. J Vet Med Sci, 2000，62 (9):989-99
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鸽腺病毒的检测引物。本发明还要解决的技术问题是提供上述鸽腺病毒的检测试剂盒，以快速、准确的检测出鸽腺病毒，及时隔离受病鸽，避免传染。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种用于检测鸽腺病毒的引物对，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。一种鸽腺病毒检测试剂盒，包含上述的引物对。一种鸽腺病毒检测试剂盒，包括(I)鸽腺病毒阳性和阴性对照；(2)鸽腺病毒特异性引物对上游引物Pl :如SEQ ID NO 1所示；下游引物P2 :如SEQ ID NO 2所示；(3) DNA提取试剂采用Geneaid公司生产的病毒核酸提取试剂盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)；(4)PCR 反应试剂:由上游引物 Pl 15 μ L(IOmM)，下游引物 P215 μ L(IOmM)，2XPCRMaster Mix 200 μ L, ddH20 (超纯水)100 μ L 组成；(5)电泳检测试剂由50 X TAE电泳缓冲液20mL，GoldView 100 μ L组成。采用上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤(I )DNA的提取采用Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)，根据说明书提取病毒的DNA ;(2) PCR 扩增25“1^体系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl I μ L ;下游引物P21yL和模板2yL ;；PCR反应条件94°C 5min，90°C lmin，61°C lmin，72°C lmin，36个循环；72°C IOmin ；4°C保存。( 3 )琼脂糖凝胶电泳将PCR扩增产物加样到1%的琼脂糖中，将琼脂糖放在电泳仪中进行电泳40分钟左右，使用成像系统记录结果；(4)判断结果如果扩增出一条600bp特异性片段，则表明待检组织鸽腺病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织鸽腺病毒阴性。有益效果由于本发明采用的引物来自鸽腺病毒基因中高度保守的区域，采用该 引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有鸽圆环病毒，灵敏度达O. 04 μ L的模板DNA ;本研究针对鸽腺病毒基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测鸽腺病毒的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测鸽腺病毒的方法，填补了国内空白。
图I =FADV 的 PCR 检测结果。其中，I =Marker, 2-4 PCR product。图2 :不同的退火温度检测结果。其中，I. Marker，2.55 °C，3.61 °C，4.59 °C，5. 63°C,6. 57°C, 7. 65。。。图3 :特异性鉴定检测结果。其中，l.Marker，2.PiCV，3.PIHV，4.FADV。图4 :敏感性试验检测结果。其中，I. Marker，2. 1:1,3. 1:2,4. 1:4,5. 1:8,6. 1:16,7.1:32,8.1:64,9. 1:128,10. 1:256,11. 1:512。图5 :部分临床病料检测结果(5、6、7为阴性)。其中，I. Marker，2_7 :PCRproduct。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :试剂盒的制备。I、病料。从浙江、江苏、安徽、山东、上海、福建等地的鸽场采取病鸽的135份血清；病料由金陵科技学院预防兽医学教研室保存。2、试剂。DNA提取试剂盒(Viral nucleic acid extraction kit II) ；2xTaq Master Mix,南京博尔迪生物科技有限公司生产Aoldview核酸染料，赛百盛公司生产；琼脂糖，北京拜尔迪生物科技有限公司；10xTBE ;Marker，上海科兴生物技术有限公司。3、引物的设计和合成。根据已发表的腺病毒的基因序列，利用primer premier 5. O设计引物，由上海英俊公司合成。预计大小为600bp。上游引物pFADV15’ -CAATAGCATCTCCGGGGTGG-3’ ；下游引物pFADV25，-TTCGTAGCCGTCGTTGTTGA-3，。4、试剂盒中其他成分的制造。
4. IDNA提取试剂购自Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(ViralNucleicAcid Extraction Kit II)。4. 2超纯水(ddH20)的制备。购自Takara 公司，ImL/ 管。4. 32XPCP master Mix 的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 4 50XTAE电泳缓冲液的制备。O. 5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(ρΗ8· O)配制
EDTA18.61 g
灭_双蒸水80mL
M氧化钠调pH至8.0
灭菌双蒸水加至100mL。50 X TAE电泳缓冲液配制
三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g
冰乙酸57. ImL
0.5nio 1/L EDTA 溶液(pHS.O)IOOmL
灭菌双蒸水加至IOOOmLo使用时灭菌双蒸水稀释50倍。4. 5Glodview核酸染料的制备。购自上海赛百盛基因技术有限公司，ImL/管。4. 6上样缓冲液的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 7引物的制备。引物由上海英俊合成，20D/管。实施例2 :检测方法。主要仪器如下PCR仪，西安天隆科技有限公司制造；电泳槽，北京鑫科奥商贸有限公司；成像系统，厦门亿辰科技有限公司。具体方法如下(I) DNA 的提取米用 DNA 提取试剂盒(Viral nucleic acid extraction kitII )，根据说明书提取病毒的DNA (la)移取200 μ I血清样品到I. 5mlEP管中，如果样品不足200 μ 1，用PBS缓冲液调整至200 μ I。加400 μ I的VB lysis buffer到样品中混匀。在室温下放置lOmin。(lb)加450 μ I的AD buffer到样品中立即混匀。移取上面600 μ I的混合液到VBcolumn。以13000rpm转速离心lmin。离心后弃去下面的液体,再加上剩下的混合液到同一个VB column中。以13000rpm转速离心lmin,弃去收集管中的液体,然后将VBcolumn转移到新的2ml的收集管中。(Ic)加 400 μ I 的 Wlbuffer 到 VB column 中，以 13000rpm 转速离心 lmin。弃去收集管中的液体。加600 μ I的Wash buffer到VB column中，以13000rpm转速离心lmin,弃去收集管中的液体，以13000rpm转速离心lmin。(Id)将干燥的VB column放到一个干净的I. 5ml的EP管里。加50 μ I的无RNA酶水到VB column管膜中心,静置3min,直至水被完全吸收，以13000rpm转速离心lmin。
(2) PCR 扩增25“1^体系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl I μ L ;下游引物Ρ21 μ L和模板2 μ L ;PCR反应条件94°C 5min，90°C lmin，61°C lmin, 72°C lmin，36 个循环；72°C IOmin ；
4°C保存。( 3 )琼脂糖凝胶电泳将PCR扩增产物加样到1%的琼脂糖中，将琼脂糖放在电泳仪中进行电泳40分钟左右，使用成像系统记录结果；(4)判断结果如果扩增出一条600bp特异性片段，则表明待检组织鸽腺病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织鸽腺病毒阴性。实施例3 =PCR扩增条件的优化。对退火温度进行优化，分别在其它条件都一致的情况之下，设定了 6个不同的退火温度，分别是55°〇、571、591、611、631、651。用优化的条件对三个阳性鸽腺病毒的DNA进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，扩增出一条大小为600bp左右的特异性片段，大小与预期相符，结果如图I。对PCR条件的优化是通过六个不同的退火温度实现的，六个不同的退火温度所得的结果都很理想，结果如图2，因为在多次的验证中，ere具有更强的稳定性，所以现在把ere作为优化的最终结果。实施例4 :特异性试验。用相同的方法提取鸽疱疹病毒(PIHV)、鸽圆环病毒的DNA，并和鸽腺病毒(FADV)的DNA —起作为模板，用设计的引物进行PCR扩增，对优化的PCR条件的特异性进行检测。并将PiAV的PCR产物送到测序公司进行测序，测得的基因序列与已发表的PiAV的基因序列进行比对。用相同的方法提取PIHV、PiCV的DNA，并以此为模板，用设计的引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3。实施例5 :敏感性试验。将鸽腺病毒的阳性DNA进行倍比稀释，共做10^1:2°,1:2\1:22,1:2\1:2\1:25、1:26、1:27、1:28、1:29，然后用设计的引物进行扩增，对优化的PCR条件的敏感性进行检测。
以提取的DNA为模板，从20 μ IDNA开始倍比稀释，共做10管I: I、1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32、1:64、1: 128、1:256、1:512，用设计的弓丨物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳。结果表明PCR方法可检测出O. 04 μ I的模板DNA，具有很高的敏感性。同时由于病料来自于六个不同的省份，说明其发病率较高，致死率也较高，结果如图4。实施例6 :试剂盒稳定性的研究。试剂盒保存于_20°C，每隔3个月取出，重新以鸽腺病毒阳性DNA为模板进行PCR检测，以电泳结果作为判断依据，连续做该项研究一年时间。将PCR反应试剂混合后保存于-20°C。经过一年的保存和反复冻融后，用FADV模板进行检测，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，一年之后仍然具有很高的检出率，说明可以长期保存。实施例7 临床病料检测。 使用实施例2的方法对135份临床病料进行检测。135份鸽子血清所提的DNA中，其中有61份检测为阳性，感染率很高，同时由于病料来自于六个不同省份的鸽场，说明其发病率较高，致死率也较高，部分结果如图5。
权利要求
1.一种用于检测鸽腺病毒的引物对，其特征在于如SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
2.一种鸽腺病毒的检测试剂盒，其特征在于，它包含权利要求I所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的鸽腺病毒的检测试剂盒，其特征在于包括 (1)鸽腺病毒阳性和阴性对照； (2)鸽腺病毒特异性引物对 上游引物Pl :如SEQ ID NO 1所示； 下游引物P2 :如SEQ ID NO 2所示； (3)DNA提取试剂采用南京博尔迪生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒；(4)PCR反应试剂由2x Taq Master Mix 12. 5 μ L，上游引物P12 μ L，超纯水6· 5 μ L组成； (5)电泳检测试剂:由50X TAE电泳缓冲液20mL, GoldView 100 μ L组成。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测鸽腺病毒的引物对，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本发明还公开了包含上述引物对的试剂盒。由于本发明采用的引物来自鸽腺病毒基因中高度保守的区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有鸽圆环病毒，灵敏度达0.04μL的模板DNA；本研究针对鸽腺病毒基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测鸽腺病毒的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测鸽腺病毒的方法，填补了国内空白。
文档编号C12R1/93GK102876812SQ20121040410
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者张志成, 戴鼎震, 孙海林 申请人:金陵科技学院