专利名称：一种鲤春病毒血症病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。
背景技术：
趣春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV),属单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales),弹状病毒科(Rhabdoviridae),水泡性口炎病毒属(Vesiculovirus)的暂定种，目前仅有一个血清型。SVCV引起的鲤春病毒血症(SpringViraemia of Carp, SVC)是一种急性、出血性并有高度传染的流行病，严重危害渔业生产并 能造成毁灭性打击。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报的重要疫病。2008年我国新颁 布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病，是新中国成立以来第一个也是唯一一个鱼类病毒疫病被列为一类传染病。SVC对水产养殖特别是鲤科鱼类养殖的危害巨大。由于暂时没有较好的防治药物和方法，对该病的防控需要依赖实验室的诊断，因此建立快速准确的检测方法至关重要。SVCV检测的“金标准”是通过细胞培养分离病毒，利用免疫学技术或分子生物学技术进行鉴定，这个过程耗时长，程序复杂。另外制备高效价抗血清困难，也限制了免疫学方法的使用。OIE水生动物疾病诊断手册、我国关于SVCV检测的国标和行标，已经将RT-PCR列为诊断方法。在现有的关于RT-PCR检测SVCV的公开文献中，绝大多数是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的鲤春病毒血症病毒G基因序列(AY527273，EF593133至EF593150, AY842484 至 AY842489, DQ227500 至 DQ227504, EU370915, Z37505),设计并筛选了一对引物，从分子水平对鲤春病毒血症病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本发明的另一个目的是在于提供了一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。，本方法可在3小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，也能检测SVCV感染的细胞(例如EPC细胞)，非常适用于SVCV的快速检测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分
该试剂盒包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶。SVCVF:5， -ggaatccccatatttgttccatc-3，；SVCVR:5， -tcacaagttgttttccattcagc-3，；一种利用鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRIzol 或TRIzd LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。2、RT-PCR 扩增采用25μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5yL，5XAMV buffer·(25mM) 0. 5 μ L,引物(10 μ Μ)各0.5 μ L，AMV酶0.5 μ L，Taq酶0.5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行 RT-PCR 反应，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。模板RNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。3、检测结果判定取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在210bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。一种鲤春病毒血症病毒的检测方法(最佳条件)，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRfed 或TRIzol LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RM,模板RNA在950C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。2、RT-PCR 扩增采用25μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物(10 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶0· 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR 反应，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。3、检测结果判定取扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在210bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本发明具有以下优点I、本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，能够检测出目前分离的所有SVCV病毒株；特异性好，能有效检测出SVCV病毒；2、全部采用国产试剂，大大降低了检测成本；3、一步法提高了检测效率，缩短了检测时间。
图I为一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR试剂盒检测结果的特异性的示意图的总RNA、GCRV-104 株感染 CIK 细胞的总 RNA、SVCV 感染 EPC 细胞的总 RNA、DL2, OOOMarker0
具体实施例方式下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。实施例I :一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒它包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶。实施例2 鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测方法所用缓冲液的优化 一、取待检样品提取病毒RNA:培养鲤上皮乳头瘤细胞(EPC细胞)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O. I的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的鲤春病毒血症病毒(张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011,33(4):305-308.)细胞毒材料，添加 10 μ L 的 Polybrene(终浓度 10 μ g/ml)，置于 26°C培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL 2%胎牛血清(V/V)的培养液，置26 V培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80 °C至室温(20-25°C )反复冻融 3 次，5000r/min 离心 30min,取上清 250 μ 1，用TRIzol LS( Invitrogen)试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_80°C保存备用。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L (预处理的方法模板RNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度，以下同。)，5 X AMVbuffer，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) ,MgC12 (25mM) 2 μ L, dNTPs (25mM) O. 5 μ L,引物(10 μ Μ)各0.5 μ L，AMV酶0.5 μ L，Taq酶0.5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行 RT-PCR 反应，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。其中5XAMVbuffer 和 Taq 酶 IOXPCRbuffer (Mg2+free)米用不同的组合I) 5 X AMV buffer O μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L2) 5 X AMV buffer I μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+ffee) 2 μ L3) 5 X AMV buffer 2 μ L, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) I. 5μ L4) 5 X AMV buffer 3 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) I μ L5) 5 X AMV buffer 4 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 0. 5 μ L6) 5 X AMV buffer 5 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) OyL三、检测结果判定取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示 5XAMV buffer I μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L 时结果最好。实施例3
鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化一、取待检样品提取病毒RNA:待SVCV感染的EPC细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min,取上清250 μ 1，用TRi/οΓ LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_80°C保存备用。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L, Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM)，dNTPs (25mM) 0. 5 μ L,弓 I 物(10 μ Μ)各O. 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶0· 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR 反应，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。 其中MgCl2 (25mM)添加量分别为 O μ L、0. 5 μ L、I μ L、I. 5 μ L 和 2 μ L。三、检测结果判定取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgCl2 (25mM)添加量为I μ L时结果最好。实施例4 鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测方法的特异性—、取待检样品提取病毒RNA:SVCV (张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011，33 (4) :305-308.)感染的EPC细胞、CRV (曾令兵、徐进、李艳秋，等.斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病毒的分尚与鉴定[J]，病毒学报，2009, 25(6) =460-466.)感染的 CCO 细胞、GCRV-104 株(CCTCC N0:V201217)感染的 CIK 细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同SVCV)，于-80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心301^11，取上清25(^1，用11112()_1^试剂按照说明书提取1 ^，最后溶于5(^1灭菌水，-80°C保存备用。二、RT-PCR扩增的反应体系采用25μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5yL，5XAMV bufferI μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物(10 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶0· 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，补加灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR 反应，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_55°C 20s_72°C 20s 作 35 个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置空白对照。三、检测结果判定取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示能够检测出SVCV，而GCRV-104、CRV和空白对照均无法检出(图I)。
权利要求
1.一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 该试剂盒包括以下成分5XAMV缓冲液，无镁Taq酶IOXPCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，引物 SVCVF 和 SVCVR，AMV 酶，Taq 酶；SVCVF: 5’ - ggaatccccatatttgttccatc - 3f ；SVCVR: 5’ - tcacaagttgttttccattcagc - 3’。
2.利用权利要求I所述的一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是 1)、病毒RNA的获取 采用TRIzof或TRIzofLS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA ； 2)、RT-PCR扩增: 采用25 μ I反应体系在PCR管中加入步骤I)中获得的总RNA 5 μ L，5XAMV缓冲液I μ L，无镁 Taq 酶 IOXPCR buffer 缓冲液 2yL，25mM MgCl2 I μ L,25mM dNTPs O. 5 μ L,10μ M 引物 SVCVF 和 SVCVR 各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 yL，Taq 酶 0.5 μ L，补加灭菌水至 25 μ L ;放入 PCR 仪进行 RT-PCR 反应，先 45°C 30 min，95°C 3min，再按 95°C 20s -55°C 20s -72°C20s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温，同时设置阳性对照和阴性空白对照； 所述的引物SVCVF为SEQ ID NO. I所示，SVCVR为SEQ ID NO. 2所示； 3)、检测结果判定，采用下述方式 取扩增产物，用2% w/v的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在210bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，属于鱼类病毒检测技术领域，一种鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分5×AMV缓冲液，无镁Taq酶10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，引物SVCVF和SVCVR，AMV酶，Taq酶。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，可在3小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，也能检测SVCV感染的细胞，非常适用于SVCV的快速检测。
文档编号C12Q1/70GK102876810SQ20121040295
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者张辉, 曾令兵, 周勇, 范玉顶, 徐进 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所