专利名称：一种章鱼肠道产蛋白霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种章鱼肠道产蛋白霉菌株及其应用。
背景技术：
章鱼属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)JUig(Octopoda)、章鱼科(octopodidae)，学名“蛸”，俗称“八爪鱼”、“八带鱼”。其体短，卵圆形，无鳍，头上生八腕，腕间有膜相连，腕长短相等或不相等，腕上吸盘无柄。广泛分布世界各海域，从寒带至热带海域均有分布，全球大约有140种，大部分为浅海性种类，也有少数深海性种类。章鱼广泛分布于我国南北沿岸海域，主要有8种，分别为短蛸、卵蛸、双点蛸、真蛸、环蛸、长蛸、纺锤蛸、嘉庚蛸。最常见为短蛸、长蛸和真蛸[12]。本实验所选用的章鱼为长蛸。长蛾(Octopus variabilis)俗称长腿蛾、马蛾、石拒、长爪章,属软体动物头足纲、章鱼科、蛸属[13]。在我国南北各海区均有广泛分布，其中北部海区略多。长蛸个体大、肉质肥厚鲜美、营养丰富，富含蛋白质和氨基酸，可食用部分占总体的90%以上。肉除鲜食外，还可以加工成干制品，食用方式多种多样。长蛸具有较高的经济价值[14]。春季长蛸多在低潮线以上活动，夏秋两季多在潮间带中区，冬季则在潮下带深潜，具有短距离的生殖和越冬洄游习性。其多利用腕足在海底爬行，也能凭借漏斗喷水的反作用短暂游行于底层海水中。长蛸可用其腕足挖洞栖居。天然海区长蛸多将卵产在自挖的洞中孵化，少数产在礁石缝隙及海螺壳中。长蛸食性较凶猛，以蟹类、贝类、虾类等贝壳类生物为主食，肠道中存在的微生物菌群能够分泌各种酶类，帮助章鱼消化食物，将食物中的蛋白质转化为自身的蛋白质。
章鱼最主要的消费国家和地区为日本、韩国，其次是阿根廷、中国和中国台湾省、摩洛哥等。近些年，我国对章鱼的消费量有了大幅度的提高，随着中国经济的快速发展和中国人喜爱海产的饮食习惯，使中国对章鱼的消费大有超过日韩的势头；同时，由于廉价而高素质的劳动力，使中国成为世界的章鱼加工厂，原本在摩洛哥、日本的章鱼加工厂，逐渐向中国转移，我国从事章鱼加工的工厂数量有了大幅提高。随着章鱼加工厂规模和数量的增力口,加工过程中产生的下脚料(主要是章鱼的内脏)约占个体总重的50% [15]，年产量巨大，仅山东一家水产品公司章鱼内脏的年产量达近千吨。而这些内脏常占用企业大量的库存，最后作为废弃物丢弃于海中，这不仅造成了海洋环境的污染，而且增加了企业的经济负担，这些下脚料中含有丰富的蛋白资源，如果能够将这些下脚料通过适当的方法转化成高附加值的产品，不仅解决了环境污染问题，同时能够为企业创造更大的经济效益。以往人们用市售蛋白酶对下脚料进行水解以获得高附加值的产品，成本过高，本研究从章鱼自身肠道中分离筛选出高产蛋白酶的菌株，对其进行鉴定，并将菌株应用于发酵章鱼下脚料，获得具有抗氧化活性的多肽，既降低了成本，又可获得高附加值产品，更具有工业化应用的价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种章鱼肠道内的产蛋白酶菌株。本发明的另一目的在于公开了该菌株在生产用于发酵章鱼下脚料的蛋白酶方面的应用。本发明的技术方案如下一种章鱼肠道产蛋白酶菌株，其中，所述菌株为Bacillus sp. QDV-3, CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株为革兰氏阳性菌，杆状，两端钝圆，有芽孢；菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型小菌落。Bacillus sp. QDV-3菌株在生产用于发酵章鱼下脚料的蛋白酶方面的应用，Bacillus sp. QDV-3菌株的液体发酵条件为液体培养基中各物质的质量浓度为果糖
O.5 %，蛋白胨O. 5 %，酵母膏O.1 %，磷酸高铁O. 01 %培养基初始pH8. O,培养温度30°C的条件下振荡培养3. 5天。上述技术方案所述的Bacillus sp. QDV-3菌株在生产用于发酵章鱼下脚料的蛋白酶方面的应用，其中，培养基中还加入金属离子Mn2+或Ba2+。本发明具有以下有益效果1、本发明从章鱼肠道内筛选了一种产蛋白酶菌株Bacillus sp. QDV-3，有效地发酵章鱼下脚料，避免了海洋环境的污染，减轻了企业的经济负担。
图1为各发酵液的蛋白酶活力图；图2为菌株Bacillus sp. QDV-3经革兰氏染色后图；图3为不同碳源对Bacillus sp. QDV-3菌株产蛋白酶的影响；
图4为不同氮源对Bacillus sp. QDV-3菌株产蛋白酶的影响；图5为培养基起始pH值对Bacillus sp. QDV-3菌株产蛋白酶的影响；图6为培养温度对Bacillus sp. QDV-3菌株产蛋白酶活力的影响；图7为培养时间对Bacillus sp. QDV-3菌株产蛋白酶活力的影响。菌株保藏信息本发明Bacillus sp. QDV-3，分类命名为弯曲芽孢杆菌Bacillusflexus，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 6561，保藏日期为2012年9月11日。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对对本发明作进一步的说明。实施例1 jBacillus sp. QDV-3 菌株的制备一、材料与培养基1、材料章鱼2、培养基选择培养基2216E培养基和VNSS培养基，两个培养基的制备方法见ChristerO.1ntestinal Colonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)-andDab(Limanda Iimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against VibrioanguiIlarum[J]. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1992 (58) :551-556.；酪蛋白培养基酪蛋白1%，酵母膏0. 1%，琼脂1.5%，pH7. 2，海水配制，以上为质量浓度，即酪蛋白为lg/100mL ；液体发酵培养基果糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0.1%，磷酸高铁0.01%，培养基起始PH8. 0，该培养基用海水配制，以上为质量浓度，即果糖为0. 5g/100mL ；固体培养基称取3. 3g LB营养琼脂培养基溶解于100ml海水中。二、章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选选用酪蛋白培养基作为筛选培养基的主要原理是该菌种在酪蛋白培养基中生长时，利用自己产的蛋白酶来水解培养基中的酪蛋白，产生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小来进行产蛋白酶菌株的筛选。1、初筛将活章鱼解剖，取其肠道，用无菌海水冲洗数次，去掉肠道杂物，将肠道剪碎，加入无菌海水研磨，得到菌液原液，将原液稀释成10—1，10_2浓度梯度，分别涂布于2216E培养基和VNSS培养基上，于25 °C恒温培养箱中培养。挑取培养基上的单菌落，稀释划线培养于固体培养基上，25°C培养ld，得到纯的单菌落，将单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况。结果酪蛋白培养基上水解透明圈直径与菌落直径的比值(D% d值)越大说明产酶能力越强。菌株的初筛结果如表1所示，共得到6株在酪蛋白培养基上产透明圈的菌株，其中VNSS培养基筛选出来的有2株，分别为命名QDV-1和QDV-3。2216E培养基筛选出来的菌株为4株，分别为QDE-1，QDE-2，QDE-5，QDE-7。其中QDV-3和QDE-5菌株所产透明圈直径和菌落直径比值较大。表I章鱼肠道产蛋白酶菌株初筛结果
权利要求
1.一种章鱼肠道产蛋白酶菌株，其特征在于所述菌株为Bacillus sp. QDV-3，CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株为革兰氏阳性菌，杆状，两端钝圆，有芽孢；菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型小菌落。
2.Bacillus sp. QDV-3菌株在生产用于发酵章鱼下脚料的蛋白酶方面的应用，Bacillus sp. QDV-3菌株的发酵条件为液体培养基中各物质的质量浓度为果糖O. 5%，蛋白胨O. 5%，酵母膏O.1 %，磷酸高铁O. Ol % ;培养基初始pH8. O,培养温度30°C的条件下振荡培养3. 5天。
3.根据权利要求2所述的Bacillussp. QDV-3菌株在生产用于发酵章鱼下脚料的蛋白酶方面的应用，其特征在于培养基中还加入金属离子Mn2+或Ba2+。
全文摘要
本发明一种章鱼肠道产蛋白酶菌株及其应用，属于生物工程技术领域。该章鱼肠道产蛋白酶菌株Bacillus sp.QDV-3，CGMCC No.6561，为革兰氏阳性菌，杆状，两端钝圆，有芽孢，菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型小菌落。该菌株用于章鱼下脚料发酵中产蛋白酶方面的应用，其液体发酵条件为液体培养基中各物质的质量浓度为果糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸高铁0.01％；培养基初始pH8.0，培养温度30℃的条件下振荡培养3.5天。本发明筛选得到的Bacillus sp.QDV-3菌株具有有效地发酵章鱼下脚料，避免了海洋环境的污染，减轻了企业的经济负担的优点。
文档编号C12N9/54GK103060226SQ20121040246
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者朴美子, 王凤舞, 金玉兰 申请人:青岛农业大学