专利名称：一种鉴定植物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段的方法
技术领域：
本发明涉及植物染色体涂染技术的建立及其在植物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段鉴定中的应用。具体地，本发明涉及一种利用染色体涂染技术鉴定植物远缘杂交种外源染色体和染色体片段的方法。
背景技术：
小麦(Triticum aestirum L.) (2n = 6x = AABBDD)是世界上重要的粮食作物之一，其种植面积和产量均居于谷类作物首位。在我国，小麦仅次于水稻，在农业上占有十分重要的地位。中国小麦品种的遗传基础较为狭窄，在很大程度上限制了小麦产量的提高和品质的改良。小麦的近缘种是一个巨大的、弥足珍贵的基因资源库，遗传变异非常丰富，具 有许多栽培小麦所不具有的优良特性，如抗病、抗逆、耐瘠薄，高营养、高蛋白和大穗多花多粒等。因此，运用远缘杂交、染色体工程的方法，将近缘种中的优良基因导入普通小麦基因组中，利用细胞分子生物学鉴定技术发掘、标记和利用近缘种染色体上潜在的抗病基因、营养高效基因、适应性和丰产性的基因，创制远缘杂交新种质基因资源，可进一步拓宽小麦的遗传基础，提高其生产潜力，培育出多抗、营养高效、广适、稳产型的小麦新品种，以保障我国的粮食安全。黑麦(Secale cereal L. ) (2n = 2x = 14)是最早也是最成功地用于改良小麦的近缘物种之一。黑麦具有许多普通小麦所不及的优良性状，如抗病虫性(锈病、白粉病、蚜虫等)、抗逆性(耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐盐碱、耐干热风等)、抗倒伏、分蘖力强且含有较高的赖氨酸等^2]。特别是黑麦IRS染色体片段上携带有抗叶锈病(Lr26)、抗条锈病(Yr9)、抗杆锈病(Srfl)、抗白粉病(Ρι·ο8)及抗飞虱(Gb2)等大量的抗性基因。据报道，黑麦的IR、2R、3R、6R染色体上分布的一些抗病基因已被导入小麦中[3]。中间偃麦草(Agropyromintermedium) (2n = 6x = 42)具有BYDV(Bailey yellowdwarf virus，大麦黄矮病)抗性，同时它具有许多可供小麦利用的优良农艺性状，对杆锈、条锈、叶锈、白粉病和腥黑穗病免疫，高抗根腐病、丛矮病，抗叶枯病，并具有根茎再生能力，耐盐能力强，是小麦育种的理想抗性来源之一。小冰麦异附加系TAI-27是将中间偃麦草(又称天蓝冰草)的两个染色体组14对染色体，分别附加到普通小麦中建立起来的两套小冰麦异附加系中的附加系之一 [4]，经人工接种鉴定，表现为高抗大麦黄矮病[5]，表明已将中间偃麦草的BYDV抗性基因转移到了 TAI-27中，为小麦的抗性育种提供了优质的抗源[4]。长 ill 麦草(Elytrigia elongate = Thinopyrum elongatum = Agropyronelongatum) (2n = IOx = 70)具有抗病、抗逆、高蛋白等多种优良性状,是小麦遗传改良中应用最为广泛的近缘野生种之一。中国科学院院士李振声等发现长穗偃麦草有很好的抗锈性，于是以长穗偃麦草为主系统开展远缘杂交研究。经过20多年的努力，成功地将长穗偃麦草的染色体组、染色体、染色体片段导入普通小麦中，创制了八倍体小偃麦(小偃68、小偃693、小偃784、小偃7430、小偃763)、附加系(小偃759)、代换系(小偃蓝粒)和易位系(小偃96)等小偃麦新种质，育成了小偃4号、小偃5号、小偃6号、小偃54和小偃81等高产、抗病的优质小麦品种[6-7]。通过远缘杂交将外源染色体或染色体片段成功导入到普通小麦背景后，需要对其进行准确的鉴定，才能有效地加以利用。目前已运用C分带、生化标记、分子标记、基因组原位杂交(Genome in situ hybridization,GISH)、多色基因组原位杂交(multicolor GISH)等方法来分析和鉴定小麦背景中的外源遗传物质。C分带方法对没有特异性带型或带纹少、颜色浅、片段小的染色体不太理想，同时C分带对环境条件非常敏感，使用不同的试剂、选择不同的材料往往会得出不同的结果。生化标记数目比较少，有些同工酶基因在进化过程中已丧失活性，这给外源染色质的鉴定带来了困难。PCR分子标记具有方便快速的优点，但在一些染色体区域的遗传标记只对跟踪特定的染色体或片段有效。基因组原位杂交技术利用基因渗入的不同物种基因组作为探针，对于鉴定小麦异源双二倍体中的外源染色质是一种非常有用的技术[8]。例如，用生物素标记的簇毛麦染色体DNA作为探针，以普通小麦染色体组DNA进行封阻，利用GISH技术可以成功检测导入小麦中的簇毛麦染色质， 而且清楚地显示出易位染色体断裂点的确切位置[9];同样，GISH技术可以成功地检测小麦遗传背景中的长穗偃麦草染色体或易位的片段[1°]。使用多个不同基因组作为探针，多色基因组原位杂交为同时鉴定多倍体中两个或多个基因组提供了另外一种可能。例如，GISH及多色-GISH技术被成功应用于鉴定小麦与中间偃麦草杂交获得的五个双二倍体系的细胞遗传学组成;同样，GISH和多色-GISH技术也被成功应用于鉴定小麦-长穗偃麦草附加、代换和易位系的分子细胞学特征[12]。但基因组原位杂交有一定的局限性，如单纯用GISH无法确定外源染色体或染色体片段属于哪个同源群、代换系所取代的特定染色体、易位系所发生的位置和断点。此外，当外源染色体与小麦染色体亲缘关系较近时，难以得到比较理想的杂交效果O相比而言，染色体涂染技术(chromosome painting)可以更好的鉴定杂交种中的外源染色体。染色体涂染技术即将整条染色体、某条染色体臂(长臂或短臂)或者染色体某个片段的DNA制备成探针，然后用荧光标记原位杂交的方法，将探针杂交到中期分裂相染色体上，利用荧光显微镜观察荧光素在染色体上的信号分布，从而分析和研究染色体的重组和畸变[13]。在人类和动物中，染色体涂染技术较为成熟，此技术具有很高的特异性和分辨力，可用来检测人类和动物的染色体畸变[14]、性别鉴定[15]、显微克隆[16]等。以微分离的染色体或染色体片段 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)扩增产物为探针，许多学者对小麦(Triticum aestivum)[17]、蚕豆(Vicia faba)[18]、大麦(Horeum vulgare)[18]、云杉(Picea abies)[18]、矮牵牛(Petunia hybrida)[19]、黑麦(Secalecereale) [2°]等中期分裂相染色体也进行了染色体涂染实验，但是结果表明不管有没有封阻，在所有染色体上均出现相同的杂交信号。Schubert等认为这可能由于与哺乳动物染色体相比，植物染色体之间发生经常性的转座、易位事件导致植物不同染色体基因组序列之间存在广泛的一致性_。不过，利用一些含有特殊序列的植物特异染色体DOP-PCR扩增产物作为探针，进行染色体涂染实验，却获得了成功。比如，利用微分离矮牵牛(Petuniahybrid)B染色体作为探针，对矮牵牛中期分裂相染色体进行涂染，结果表明B染色体上的杂交信号要比A组染色体杂交信号亮度强得多[21]。同样，利用微分离的酸模(Rumexacetosa) Y染色体DOP-PCR扩增产物为探针进行荧光原位杂交(FISH)，Y染色体由于含有特殊的重复序列，其很容易与常染色体区分开来[22]。但是，染色体涂染技术对于植物的常染色体(即，A染色体)的检测一直没有获得成功。与植物基因组原位杂交(GISH)相比而言，植物染色体涂染实验具有GISH所不具备的优点(I)植物染色体涂染实验可以区分植物远缘杂交种中外源染色体细微的结构变化，如缺失、重复、易位、倒位等，例如，本研究中对TAI-27附加染色体进行显微分离及DOP-PCR扩增，以其作为探针对TAI-27中期分裂相染色体进行涂染实验，结果表明在TAI-27中除了附加一对中间偃麦草染色体外，染色体涂染实验还能鉴定出有一对染色体发生了置换，并且其中最小的一对染色体是由于末端缺失而造成的(这一结果是植物基因组原位杂交所显示不出来的)；(2)利用植物染色体涂染实验，可以对特定的染色体进行显微分离，进而了解特定染色体含有的遗传信息，如前面提到的B染色体、Y染色体，本研究所涉及到的含有很多特性基因的黑麦IR染色体、TAI-27附加中间偃麦草染色体、7ES/CS附加长穗偃麦草染色体(7E的短臂)，对其进行成功的显微分离及DOP-PCR扩增，为了解其含有的遗传信息以及为克隆抗性相关基因奠定了基础
发明内容
本发明提供了一种利用染色体涂染技术鉴定植物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段的方法。具体地，本发明的方法包括下述步骤I)显微分离待测植物中待检测的染色体的单染色体或染色体片段；2)利用步骤I)分离的单染色体或染色体片段构建单染色体或染色体片段荧光探针；3)利用步骤2)构建的单染色体或染色体片段荧光探针对杂交种中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；和4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果，确定待测植物中待检测的染色体的荧光信号分布。在本发明的一个实施方案中，步骤I)通过制备植物远缘杂交种根尖中期分裂相，利用单染色体显微分离技术分离待检测的染色体的单染色体或染色体片段或与待检测的染色体至少部分同源的单染色体或染色体片段。与待测外源染色体同源的染色体的确定可根据GISH结果进行鉴定，具体的讲，利用待测外源染色体来源的基因组DNA构建荧光探针对远源杂交种进行荧光原位杂交，在显微镜下，观察荧光信号在染色体上分布情况，从而确定与待检测的外源染色体至少部分同源的染色体。“至少部分同源”一般指至少20%同源，本领域技术人员可以根据实际应用容易地确定所需要的同源性。在本发明的一个实施方案中，步骤2)通过对步骤I)分离的单染色体或染色体片段进行DOP-PCR扩增，借助切口平移方法对所述分离的单染色体或染色体片段DOP-PCR扩增产物进行荧光探针构建。其中步骤2)对微分离的单染色体进行两轮DOP-PCR扩增。本发明的方法适用于多种植物品种，例如，小麦、黑麦、中间偃麦草、长穗偃麦草、水稻、玉米等单子叶植物，同时也适用于棉花、大豆等双子叶植物，优选适用于单子叶植物，更优选适用于禾本科植物。在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供一种利用植物染色体涂染技术鉴定小麦远缘杂交种中外源染色体的方法，其特征在于I)显微分离小麦远缘物种中待检测的染色体的单染色体或染色体片段，如黑麦的IR染色体、7ES/CS附加的长穗偃麦草染色体、TAI-27中附加的中间偃麦草染色体等；2)利用步骤I)分离的单染色体或染色体片段构建单染色体或染色体片段荧光探针；3)利用步骤2)构建的单染色体或染色体片段荧光探针对杂交种中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；和4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果，确定待测植物中所述待检测的染色体的突光信号分布。在本发明的一个具体实施方案中，所述待检测的染色体和染色体片段选自黑麦IR 染色体、中间偃麦草-小麦附加系TAI-27附加染色体、长穗偃麦草-小麦附加系7ES/CS附加染色体。本发明的方法适用于检测植物中的常染色体、特殊的B染色体和性染色体，特别地，本发明的方法首次成功地以高灵敏度检测植物中的常染色体，克服了现有技术中植物常染色体检测效果不理想的问题，是一种技术突破。具体地讲，本发明的方法有以下几点技术突破1)染色体制片技术的改进，本发明的方法采用了比较先进的染色体制片技术，对根尖预处理采用笑气(N2O)而非传统的化学试剂秋水仙素、八羟基喹啉、对二氯苯等化学试齐U，主要优点体现在无毒害、分散效果好；2)荧光探针构建及荧光原位杂交技术与同类方法相比较也体现了快捷、高效、信号强等特点；3)单染色体涂染技术的突破，与动物染色体涂染技术相比，植物染色体染色体涂染特别是植物常染色体涂染技术发展处于非常落后的阶段，主要表现为信号不清晰、特异性差，很难达到实际应用的要求，而采用本发明的方法，荧光原位结果显示荧光杂交信号非常清晰、特异性非常强，可以很好的应用到远缘杂交种中外源染色体的鉴定，这对植物染色体涂染技术的发展具有很好的推动作用。虽然上述技术中的一种或几种在相关的研究中得到了应用，但是综合应用这样几种技术构成完整的实验方案，并应用到植物远缘杂交种中外源染色体或染色体片段的鉴定中未见到相关研究报道。本发明首次利用该套研究方案成功地以高灵敏度检测远缘杂交植物中的外源常染色体，克服了现有技术中植物常染色体检测效果不理想的问题，是一种技术突破，体现了该研究方法具有较好的先进性、创新性和实用性。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图I.黑麦IR染色体的显微分离及利用IR染色体探针在小麦-黑麦附加系1R/CS和小麦-黑麦易位系1RS/1BL鉴定黑麦来源的染色体和染色体片段A.黑麦IR染色体的显微分离过程(左黑麦细胞中期分裂相，箭头示IR染色体；右IR染色体被分离后的黑麦细胞中期分裂相)；B.黑麦IR染色体第二轮DOP-PCR扩增电泳图(M =Marker ；CK 阴性对照；I :分离的IR单染色体扩增产物);C.利用IR单染色体荧光探针对1R/CS (左图)、1RS/1BL(右图)中期分裂相染色体进行荧光原位杂交结果(箭头示荧光信号所在染色体，结果表明只有IR单染色体和IRS染色体片段上有荧光信号)。图2. TAI-27附加中间偃麦草染色体的显微分离及其对TAI-27附加中间偃麦草染色体的染色体涂染鉴定A.TAI-27附加中间偃麦草染色体的显微分离过程(左细胞中期分裂相，箭头示附加中间偃麦草染色体；右附加的小染色体被分离后的细胞中期分裂相)；B. TAI-27附加中间偃麦草染色体第二轮D0P-PCR扩增电泳图(M =Marker ；CK :对照；1、2、3、4代表分离的附加单染色体)；C.左图显示以中间偃麦草基因组为探针进行的基因组原位杂交(GISH)结果，右图显示利用TAI-27附加中间偃麦草单染色体荧光探针对TAI-27中期分裂相染色体进行荧光原位杂交结果(箭头示荧光信号所在染色体，与基因组原位杂交相比，染色体涂染结果 表明在TAI-27中，一对外源染色体替换了小麦的一对染色体，并且小麦附加了一对外源小染色体，这对小染色体的产生是由于附加的一对染色体端部发生断裂而产生的)；D.利用TAI-27附加中间偃麦草染色体荧光探针对中间偃麦草中期分裂相染色体进行荧光原位杂交结果(结果显示多数染色体近着丝粒区域均出现相似的荧光信号)。图3. 7ES/CS附加长穗偃麦草染色体的显微分离及其对7ES/CS附加长穗偃麦草染色体的染色体涂染鉴定A. 7ES/CS附加长穗偃麦草染色体的显微分离过程(左细胞中期分裂相，箭头示附加长穗偃麦草染色体；右附加的小染色体被分离后的细胞中期分裂相)；B. 7ES/CS附加长穗偃麦草染色体第二轮D0P-PCR扩增电泳图(M =Marker ;1、2、3、4代表分离的附加单染色体)；C.利用7ES/CS附加长穗偃麦草染色体荧光探针对7ES/CS中期分裂相染色体进行荧光原位杂交结果(箭头示荧光信号所在染色体，结果表明只有小麦附加的一对染色体上有突光信号)
具体实施例方式下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。另外，本领域技术人员还应该理解，除非另外具体说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。实施例I.黑麦IR染色体的显微分离及对小麦-黑麦附加系1R/CS和小麦-黑麦易位系1RS/1BL黑麦来源的附加染色体和染色体片段的涂染鉴定I.黑麦有丝分裂中期分裂相的制备所用黑麦(Secale cereal) king II，购自美国农业部牧草与畜牧研究室(USDA，ARS，FRRL，UT,USA)。DN2O处理根尖用镊子在I. 5ml离心管的盖子上扎一个孔，打开盖子，用喷雾瓶向离心管中喷水至管壁有一层水珠，切取l_2cm的根尖放入管中，盖上盖子后放入N2O气室中处理 l_3h，压强为 lOATMd. OlMpa)；2)根尖固定用90%乙酸冰上固定根尖10分钟(不超过Ih)(可向原来的带孔的1.5ml管中直接加90%乙酸，或转移根尖至新管中固定)；固定后的根尖转入70%的乙醇中放入-20°C可保存多年；3)水洗用水洗根尖10分钟(换2-3次H2O)，放于冰上；4)转移根尖至干滤纸上，轻轻转动根尖去除根尖表面的粘稠物；酶解切下2mm长的生长点部分转入20 μ L冰冷的酶液中(2-3个根尖/管)(酶解液配制把一个塑料培养皿放到天平上，向里面加入IX柠檬酸缓冲液(IOmM柠檬酸钠+IOmM EDTA，pH 5. 5) 4. 85g，取出置于冰上，称取50mg果胶酶Y-23 (购自北京华绿源科技有限公司，l%w/w)和IOOmg纤维素酶Onozuka R-10 (购自北京华绿源科技有限公司，2% w/w)加入缓冲液中，用枪头吹吸助溶，酶溶解后用分液器分装到O. 5ml薄壁PCR管中，放入干冰中迅速冷冻一下，_20°C保存)，放入37°C的水浴中30-50分钟；5)取出离心管放冰上，加入500 μ L 70%乙醇，混匀，倒掉乙醇后，加入500μ L新的70%乙醇，再倒出乙醇，留40 μ L乙醇，用解剖针捣碎根尖，涡旋几秒钟或用手指弹击管壁几次悬浮细胞，在小离心机上离心10-20秒，转速不超过2000rcf，小心倒置PCR管于滤纸或吸水纸至乙醇完全流尽；6)放离心管于冰上，加30 μ L无水乙酸，涡旋或用枪头轻轻吹吸混匀，吸5-8 μ L滴片，载玻片已摆放在保湿盒中，滴片后盖住保湿盒，放置5分钟后即可利用光学显微镜物镜20 X下观察染色体。2.黑麦IR染色体的显微分离首先将直径为I. Omm的微细玻璃棒，在酒精灯下，利用Leitz拉针仪手工拉制成直径为Iym左右的微细玻璃针。在倒置显微镜下(OlympuslM)用手工拉制的玻璃针借助Leitz显微操作仪(code-No. 93314,购自德国莱卡公司)对识别的染色体进行前后左右的划动，轻轻刮取。将粘附有IR染色体(带有随体的小染色体，可在不染色的情况下识别确认，图1A，左箭头所示；图1A，右为IR染色体被分离后的图像)的针尖折断于预先装有
10μ L 蛋白酶 K (Proteinase K, recombinant PCR Grade 03115887001Roche, 50ng/μ L,由IXTaq DNA聚合酶缓冲液配制)反应缓冲液的O. 2mlEppend0f管中，室温高速(离心速率4000rpm)离心30s，_20°C放置待用。3.黑麦 IR 染色体 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)扩增首先将含有按实施例I. 2得到的微分离染色体的PCR管放于37°C进行酶解去蛋白反应，2h后90°C处理IOmin失活蛋白酶K，用作第一轮DOP-PCR反应的模板。将DOP-PCR 引物(5，-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ) (N 表示 A，G，T 或 C)、水、缓冲液(D0P-PCR扩增试剂盒所带，DOP-PCR扩增试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司)在紫外灯下照射30min，操作均在超净操作台上操作。第一轮DOP-PCR扩增反应体系
权利要求
1.一种利用染色体涂染技术鉴定植物远缘杂交种外源染色体和染色体片段的方法，其包括下述步骤 1)显微分离待测植物中的待检测的染色体的单染色体或染色体片段； 2)利用步骤I)分离的单染色体或染色体片段构建单染色体或染色体片段荧光探针； 3)利用步骤2)构建的单染色体或染色体片段荧光探针对杂交种中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；和 4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果，确定待测植物中所述待检测的染色体的荧光信号分布。
2.权利要求I所述的方法，其中步骤I)通过制备植物远缘杂交种根尖中期分裂相，利用单染色体显微分离技术分离待检测的染色体的单染色体或染色体片段。
3.权利要求I所述的方法，其中步骤2)通过对步骤I)分离的单染色体或染色体片段进行DOP-PCR扩增，借助切口平移方法对所述分离的单染色体或染色体片段DOP-PCR扩增产物进行荧光探针构建。
4.权利要求3所述的方法，其中步骤2)对微分离的单染色体进行两轮DOP-PCR扩增。
5.权利要求I所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述单子叶植物为禾本科植物。
7.权利要求5所述的方法,其中所述植物选自小麦、黑麦、中间偃麦草-小麦附加系TAI-27、长穗偃麦草-小麦附加系7ES/CS。
8.权利要求7所述的方法，其中所述待检测的染色体和染色体片段选自黑麦IR染色体、中间偃麦草-小麦附加系TAI-27附加染色体、长穗偃麦草-小麦附加系7ES/CS附加染色体。
全文摘要
本发明提供了一种利用染色体涂染技术鉴定植物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段的方法，所述方法包括下述步骤1)显微分离待测植物中的待检测的染色体的单染色体或染色体片段；2)利用步骤1)分离的单染色体或染色体片段构建单染色体或染色体片段荧光探针；3)利用步骤2)构建的单染色体或染色体片段荧光探针对杂交种中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；和4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果，确定待测植物中所述待检测的染色体的荧光信号分布。利用本发明提供的方法不但可以用来对小麦远缘杂交种中外源染色体和染色体片段进行鉴定，也可以应用到对其他农作物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段的鉴定工作中。
文档编号C12Q1/68GK102876801SQ20121040285
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者胡赞民, 邓传良, 符书兰, 韩方普, 尹维波, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所