一种贝类远缘杂交子代遗传鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于贝类远缘杂交子代遗传鉴定的方法，具体是一种利用EPIC-PCR法鉴定贝类远缘杂交子代的方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]杂交是动植物遗传改良的重要手段，根据杂交亲本的亲缘关系，杂交可分为近缘杂交和远缘杂交。近缘杂交是杂交育种常规方法，可操作性强，容易推广。但是由于动植物育种的广泛展开，使得近缘种间的杂交潜力越来越小，变异幅度受到限制。而远缘杂交的后代具有很大的潜在的遗传变异，远缘杂交可应用于动植物改良，基因和基因组作图，染色体行为研宄和进化研宄等各个动植物遗传育种学的研宄领域。
[0003]贝类远缘杂交起源于牡蛎的种间杂交，种间杂交牡蛎在抗逆性、生长存活等一些方面表现一定的杂种优势。Ibrra等研宄了蓝鲍(W1iis fulgens和红鲍(/Zrufescens )杂交子代的性腺发育情况，结果表明杂交子一代性腺能够发育成熟，并能够正常繁育。此外，扇贝、鲍、贻贝的远缘杂交研宄报道屡见不鲜，且能够充分显示远缘杂种优势。
[0004]但在实际贝类远缘杂交育种工作中，往往遇到杂交子代与亲本自繁子代混杂等现象，导致育种结果出现误差。Gaffney (1993)首次采用同工酶的方法鉴定了牡蛎的远缘杂交子代，并指出在以往的研宄中并没有确凿的证据证明存活下来的牡蛎杂交子代的真实性。自此以后，各国学者在开展牡蛎远缘杂交研宄，都必须采用不同的方法鉴定杂交子代，因此如何鉴定杂交子代的真实性是远缘杂交育种极为关键的一步。通常采用的方法是核糖体DNA ITS1、ITS2和线粒体DNA COI技术鉴定贝类杂交子代，但这些方法并不适用于ITS或COI扩增片段大小相近的两种贝类的杂交子代，比如香港巨牡蛎与近江牡蛎间的ITS2片段差距仅为65 bp，通过PCR扩增和凝胶电泳成像很难区分两者的杂交子代。虽然RAPD，AFLP，RFLP, SSR, SNP分子生物学技术已经广泛应用于贝类的遗传标记中。但这些标记都是基于外显子DNA片段来开发的，用于贝类远缘杂交子代鉴定的特异性不高。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明目的是提供一种操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、弓丨物通用性高、价格低廉的适用于贝类远缘杂交子代遗传鉴定的方法，以弥补现有技术的不足。
[0006]本发明采用EPIC (exon primer intron crossing)-PCR法鉴定贝类远缘杂交子代，该方法通过选择功能上保守的基因序列，在其外显子区域设计引物，扩增内含子片段，比对内含子长度多态性。本发明即在外显子上设计引物，扩增内含子片段，通过内含子扩增片段的长度多态性比对，鉴定贝类远缘杂交子代。
[0007]本发明采取的具体技术方案为:
一种贝类远缘杂交子代遗传鉴定方法，其特征在于，该方法是以EPIC (exon primerintron crossing)-PCR法为基础；首先使用工具软件装载两远缘杂交贝类亲本的相同基因序列作为目的基因，然后比对该目的基因中内含子的长度多态性，选择长度存在差异的内含子，并且在该内含子两端的外显子上设计引物，最后对两远缘杂交贝类亲本及杂交贝类子代采取常规DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳及染色成像分析，判断杂交贝类子代的电泳图谱有两条带，且均来自两亲本，即杂交子代中的一条带来自于父本，另一条带来自于母本，最终实现远缘杂交贝类子代的遗传鉴定，最终实现远缘杂交贝类子代的遗传鉴定。
[0008]该方法具体步骤包括:
(O目的基因中内含子长度多态性筛查
在Gene bank数据库中，下载两贝类亲本的相同基因序列，使用Atemis软件装载两亲本的相同全基因序列，进行序列比对，筛查两贝类亲本相同基因的内含子长度多态性差异，将具有长度差异的内含子，作为目的基因扩增片段；
(2)引物设计
使用引物设计软件，在上述步骤中筛查的内含子两侧的外显子上设计引物；
(3)基因组DNA提取
提取贝类两亲本及杂交子代的DNA ；
(4)PCR扩增引物退火温度的筛查
将(2)步骤中设计好的引物，进行梯度PCR扩增；PCR扩增反应体系和反应程序采用常规方法，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，条带清晰的实验组筛选为扩增引物的退火温度；
(5)PCR目的基因内含子片段扩增
将(4)步骤筛选好的PCR扩增引物的退火温度为标准，PCR扩增反应体系与PCR反应程序同(4)步骤，进行目的基因片段的扩增；然后取PCR扩增片段产物进行凝胶电泳，最后对电泳谱图分析判断，杂交贝类子代的电泳图谱有两条带，且均来自两亲本，即杂交子代中的一条带来自于父本，另一条带来自于母本，则证明该杂交子代为两亲本的杂交子代。
[0009]所述的贝类远缘杂交子代遗传鉴定方法还包括杂交贝类子代异源双链DNA的多条扩增条带现象解决办法:将PCR扩增片段产物稀释10倍，再对稀释的PCR产物进行PCR扩增；PCR反应体系同上述(4)步骤；PCR反应程序:在95°C条件下变性5分钟，在步骤(4)中筛选好的退火温度下，复性退火I分30秒，在72°C进行延伸，循环次数为3。
[0010]上述(2)步骤中的引物设计软件为oligo6.0或primer5.0软件。
[0011]上述(3)步骤中采用常规或试剂盒方法提取DNA。
[0012]本发明的优点:本发明操作简单、分辨率高，遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉；由于贝类外显子具有高度保守性，因此在外显子上设计引物，通用性高；且贝类的内含子长度多态性高，因此可以开发出丰富的EPIC-PCR分子遗传标记。本发明尤其适用于两贝类亲本核糖体DNA ITS1、ITS2和线粒体DNA COI扩增片段大小相近，无法采用传统的ITS1、ITS2及COI遗传标记技术鉴定的杂交子代；另外，提供了杂交贝类子代异源双链DNA的多条扩增条带现象的有效解决办法。本发明为贝类的远缘杂交遗传育种中的杂交子代遗传鉴定，提供了方便、可靠的分子鉴定方法。
【附图说明】
[0013]图1为茄红素第六内含子PCR电泳图谱。
[0014]图2为谷氨酰氨合成酶第一内含子PCR电泳图谱。
[0015]其中:M，标准marker ;1_3，香港巨牡蛎；4_6，近江牡蛎；7_9，香港巨牡蛎早X近江牡蛎?杂交子代；10-12，7-9PCR扩增产物稀释10倍后并进行PCR扩增后的条带。
【具体实施方式】
[0016]下面以香港巨牡蝴(Ao/?政近江牡蝴(Cariakensis)、香港巨牡蛎#与近江牡蛎?杂交子代为实施例进一步说明本发明，但以下具体实施例不构成对本发明的限制。
[0017]实施例1:
(1)在Genebank数据库中下载香港巨牡蛎，近江牡蛎茄红素的全基因序列，使用Ate