一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外诊断领域，涉及一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，具体涉及一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞胞外体核酸的方法。
【背景技术】
[0002]外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，简称CTC)是指自发或诊疗操作时而进入外周血的肿瘤细胞。具有高度活力和高度转移潜能的CTC可以在循环系统中存活，并在合适的环境中增殖，导致肿瘤的复发和转移。对CTC的监测能够为肿瘤的临床进展、疗效判断和预后评估等提供极具价值的科学依据。
[0003]胞外体(exosome，E0)是真核细胞在正常和病理状态下分泌的一种具有双层膜结构的微小囊泡，包含有蛋白、脂质、RNA及多种其他生物大分子。由于其在细胞之间的信号交流、肿瘤免疫微环境调节方面的作用显著而受到广泛关注。研宄表明，肿瘤细胞分泌EO的组成和数量与正常细胞存在差异，因此其在肿瘤形成和进展、免疫状态调节中的功能也具有多样性。而且，EO可能在肿瘤预测、分期、诊断和治疗中具有极大的潜在价值。
[0004]现有技术中，传统CTC检测的方法为过滤法、梯度密度法和免疫磁珠法，但是这些方法存在敏感性低、纯度差以及细胞毒性大等问题。
【发明内容】
[0005]为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，意在提供一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的技术，具体涉及一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞胞外体核酸的方法。
[0006]一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包括捕获探针Capture ProbeCSEQ ID N0.1)辅助探针Signal Probe I (SEQ ID N0.2)和 Signal Probe2(SEQ ID N0.3)0
[0007]本发明所述的一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，检测体液(例如血液)中的循环的或扩散的活细胞，或混有液体的组织样本，检测方法包括括以下步骤:a)外周血的获得及循环肿瘤细胞胞外体核酸的提取；b)胞外体核酸的检测；c)结果的判读。
[0008]进一步的，本发明所述试剂盒制备及检测应用的方法为:
1)设计不完整的DNAzyme (SEQ ID N0.4)及完整的 DNAzyme (SEQ ID N0.5),DNAzyme的底物，用于分离单链产物的捕获探针Capture Probe (SEQ ID N0.1)、辅助探针SignalProbe I (SEQ ID N0.2)和 Signal Probe2 (SEQ ID N0.3)；
所述Capture Probe可捕获目的片段(miR-105) ( SEQ ID N0.6)单链产物的5’端，Signal Probe I可与单链产物的3’端互补为双链，Signal Probe2又可与Signal ProbeI的3’端互补为双链，最终形成长的双链结构；
2)将不完整的DNAzyme、铜离子、抗坏血酸和样本加入反应液中，混匀，在样本MiRNA存在的情况下，T4连接酸将不完整的DNAzyme修补成为完全的DNAzyme ； 3)在反应液中加入DNAzyme的底物，底物被裂解成为两条单链DNA；
4)采用连接有链霉亲和素(SA)的磁珠(SA-MBs)将产物单链DNA分离，清洗去除其他游离DNA链；
5)将清洗后的带分离的单链DNA、辅助探针SignalProbe I和Signal Probe2，加入反应液，反应完全以形成自组装双链；
6)加入SybrGreen I，检测焚光信号。
[0009]所述胞外体核酸的提取，其特征在于通过差速离心方法完成，所述差速离心法通过实验验证最佳条件为:2000rpm/min离心去除细胞残骸，8000rpm/min离心收集胞外体后加入RNA保护剂，即可得到纯化的胞外体核酸。
[0010]有益效果:
本发明所述试剂盒，具有准确、重复性及特异性高、灵活的特点，有效解决本发明通过对外周血循环肿瘤细胞的监测能够为肿瘤的临床进展、疗效判断和预后评估等提供极具价值的科学依据。
【附图说明】
[0011]图1一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞技术的胞外体核酸的检测及结果的判读示意图。
[0012]A:A图为不完整的DNAzyme在待检目的片段存在的时候组装成完整的DNAzyme
B:B图为完整的DNAzyme在添加二价铜离子与抗坏血酸的时候DNAzyme对底物进行反应，切断底物形成捕获探针
C:C图为结果判读示意图，在信号探针I与信号探针2存在的时候与捕获探针形成连续的双链结构，在添加SYBR Green I的时候进行荧光染色。
【具体实施方式】
[0013]—种外周血循环肿瘤细胞基因检测芯片，所述芯片包括捕获探针Capture Probe辅助探针 Signal Probe I 和 Signal Probe2。
[0014]所述芯片的具体构建方法及检测应用:
1)设计不完整的DNAzyme及完整的DNAzyme，DNAzyme的底物，用于分离单链产物的捕获探针 Capture Probe、辅助探针 Signal Probe I 和 Signal Probe2 ；
所述Capture Probe可捕获单链产物的5’端，Signal Probe I可与单链产物的3’端互补为双链，Signal Probe2又可与Signal Probe I的3’端互补为双链，最终形成长的双链结构；
2)将不完整的DNAzyme、铜离子、抗坏血酸和样本加入反应液中，混匀，在样本MiRNA存在的情况下，T4连接酸将不完整的DNAzyme修补成为完全的DNAzyme ；
3)在反应液中加入DNAzyme的底物，底物被裂解成为两条单链DNA；
4)采用连接有链霉亲和素(SA)的磁珠(SA-MBs)将产物单链DNA分离，清洗去除其他游离DNA链；
5)将清洗后的带分离的单链DNA、辅助探针SignalProbe I和Signal Probe2，加入反应液，反应完全以形成自组装双链； 6)加入Sybr Green I，检测焚光信号。
【主权项】
1.一种外周血循环肿瘤细胞基因检测芯片，所述芯片包括捕获探针Capture Probe(SEQ ID N0.1)辅助探针Signal Probe I (SEQ ID N0.2)和Signal Probe2(SEQ ID N0.3)。2.如权利要求1所述的基因芯片，其检测应用的方法为: 外周血的获得及循环肿瘤细胞胞外体核酸的提取；b)胞外体核酸的检测；c)结果的判读。3.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于:所述肿瘤细胞胞外体核算的提取方法为差速离心方法，所述差速离心法2000rpm/min离心去除细胞残骸，8000rpm/min离心收集胞外体后加入RNA保护剂，即可得到纯化的胞外体核酸。
【专利摘要】本发明属于体外诊断的领域，公开了一种用于快速检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，通过设计的三种探针，检测体液(例如血液)中的循环的或扩散的活细胞，或混有液体的组织样本，其包括以下步骤：a)外周血的获得及循环肿瘤细胞胞外体核酸的提取，b)胞外体核酸的检测，c)结果的判读。本发明通过对外周血循环肿瘤细胞的监测能够为肿瘤的临床进展、疗效判断和预后评估等提供极具价值的科学依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104928363
【申请号】CN201510190133
【发明人】冯文峰, 黄鹏, 昌芒
【申请人】广州思丹福生物科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年4月21日