用于检测肠癌的标记物及其应用
【专利说明】
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请号为201410403598. 9,申请日为2014年8月15 日，发明名称为"用于检测肠癌的标记物及其应用"。
技术领域
[0002] 本发明属于生物学和医学检验领域，涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标 记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0003] 肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠 与乙状结肠交界处，占60%。随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死 亡率呈逐年上升的趋势，发病多在40岁以后，男女之比为2:1。目前.结直肠癌早期诊断的 方法包括大便隐血检测（Fecal occult blood test, F0BT)、结肠镜检测（Colonoscopy)、 奠便DNA突变检测和奠便RNA特异性基因检测等，钡灌肠（Double-contrast barium enema，DCBE)等。结肠镜检测被认为是诊断结直肠癌的金标准，但是它为侵入性检查，需要 肠道准备，检查过程中有发生并发症如出血及穿孔危险，患者接受性不高，且花费较大。大 便隐血检测虽然为非侵入性检测，但是检查结果容易受饮食等因素的影响，并且对于筛查 结直肠癌而言.粪便隐血检测的灵敏度和特异性不够理想。
[0004] 成熟的microRNA (miRNA)是一类不编码蛋白质的单链的RNA，由18 - 24个碱基 组成，与相应的mRNA结合导致mRNA分解或沉默，从而起到对基因的调节作。近年来的研宄 显示，miRNA的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，某些miRNA甚至可以起到抑癌基因或 癌基因的作用。环氧化酶（COX)是前列腺素合成过程中的重要限速酶，C0X2在正常组织 中不表达，但可在各种刺激因素的作用下诱导表达，故又被称为诱导型早期反应基因，与肿 瘤的发生、发展密切相关，近年来的研宄发现，C0X2在大部分头颈肿瘤中过表达，Cox2也 是肠癌的生物标志之一。因此，如果能够研发出的相应的肠癌试剂盒使之能够应用于科研 领域，将极大地促进肠癌筛查研宄及科研成果的转化，对于肠癌的诊疗必将起到巨大的推 动作用。
【发明内容】
[0005] 本发明人研宄发现，miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、 miRNA-223、miRNA-301a的上调表达与人类多种肿瘤（如肠癌）的发生、发展相关，提示对 检测粪便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a的表达检测可以成为肿瘤如肠癌检测的指标之一。
[0006] 本发明提供用于检测肠癌的引物、探针和试剂盒（尤其是用于检测粪便和血清 miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2)的核酸及检测方法。
[0007] 本发明包括以下技术方案： 1.肠癌检测试剂盒，其包含选自SEQ ID NO: 9-27所示的引物和/或探针。
[0008] 2.上述1所述的试剂盒，其包含选自SEQ ID NO: 9-15所示的一种或多种引物。
[0009] 3.上述1或2所述的试剂盒，其包含SEQ ID NO: 23所示的引物。
[0010] 4.上述1 - 3中任一项所述的试剂盒，其包含SEQ ID NO: 24和/或27所示的 探针。
[0011] 5.上述1 - 4中任一项所述的试剂盒，其包含选自SEQ ID NO: 16 - 22和25 - 26所示的一种或多种引物。
[0012] 6.上述1 一 5中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下的一组或多组引物和探 针： SEQ ID NO: 9、16、23 和 24 ; SEQ ID NO: 10、17、23 和 24 ; SEQ ID NO: 11、18、23 和 24 ; SEQ ID NO: 12、19、23 和 24 ; SEQ ID NO: 13、20、23 和 24 ; SEQ ID NO: 14、21、23 和 24 ; SEQ ID NO: 15、22、23 和 24 ;和 SEQ ID NO: 25-27〇
[0013] 7.上述1 一 6中任一项所述的试剂盒，其中所述探针带有荧光标记。
[0014] 8.上述7所述的试剂盒，其中所述探针的5'用FAM标记，而所述探针的3'用 TAMRM标记。
[0015] 9.试剂在制备肠癌检测试剂盒中的用途，其中所述试剂用于测定选自以下的一 种或多种标记物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、 miRNA-301a和C0X2,所述试剂优选选自SEQ ID NO: 9-27所示的一种或多种引物和/或探 针。
[0016] 10.肠癌检测方法，包括检测样品中选自以下的一种或多种标记物的水平： miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a 和 C0X2,所述样品优选为粪便和/或血清样品，优选使用选自SEQ ID NO: 9-27所示的一种或 多种引物和/或探针检测所述标记。
[0017] 本发明的试剂盒和方法采用水解探针法TaqMan技术的设计方法（图1)，除了一对 特异性引物，用TaqMan探针法增加一条与模版互补的基因特异性探针(通常20-30bp)，特 异性高。此外，探针上5'端和3'端还可以分别标记一个荧光报告基团，增强灵敏度。本发 明的引物、探针、试剂盒和方法适用肠癌患者的检测和诊断。
[0018] 用于肠癌检测的引物和探针优选为： (1)用于检测miRNA-92a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-92a-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CAGGCC-3' ； miRNA-92a_F : 5'-CTGCTGCTATTGCACTTGTCC-3' ； 通用下游引物（miRNA-92a-R ): 5， 一 GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-92a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (2) 用于检测miRNA-135b的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-135b-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCACAT-3' ； miRNA-135b-F ： 5'-TGCTGCTATGGCTTTTCATTCCT-3' ； 通用下游引物（miRNA-135b-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-135b-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (3) 用于检测miRNA-lSa的逆转录引物、探针及检测引物逆转录引物如下所示； miRNA-18a-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC CTATCT-3' ； miRNA-18a-F(检测用上游引物）： 5'-CTGCTGTAAGGTGCATCTAGTGC-3' ； 通用下游引物（miRNA-18a-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miRNA-18a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (4) 用于检测miR-221的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miR-221-RT(逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GAAACC-3' ； miR-221-F(上游引物）： 5'-GCTGCAGCTACATTGTCTGCTG-3' ； 通用下游引物（miR-221-R ): 5,-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3，； 通用探针（miR-221-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (5) 用于检测miRNA-19的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-19-RT(逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TCAGTT-3' ； IiiiRNA-I9-F(上游引物）：5'-TGCTGCTGTGCAAATCTATGCAA-3' ； 通用下游引物（miRNA-19-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-19-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (6) 用于检测miRNA-223的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-223-RT (逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC TGGGGT-3' ； miRNA-223-F(上游引物）：5'-CTGCTGCTGTCAGTTTGTCAAAT-3' ； 通用下游引物（miRNA-223-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-223-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' ； (7) 用于检测miRNA-301a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示： miRNA-301a-RT(逆转录引物）： 5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGC GCTTTG-3' ； miRNA_3〇la-F(上游引物）：5'-CTGCTGCCAGTGCAATAGTATTGT_ 3' ； 通用下游引物（miRNA-301a-R ):5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3' ； 通用探针（miRNA-301a-B): 5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3' T ; (8) 用于检测C0X2的引物和探针如下所示： C0X2-B (探针）： 5'-TCCTCAAAAGATTCATAGGGCTTCAGC-3' ； C0X2-F(上游引物）：5'-CACTTGACCAGAGCAGAGAGATGA-3' ； C0X2-R(下游引物）：5' -TAGAGCGCTTCTAACTCTGCAGC-3'。
[0019] microRNA 所述引物的序列是根据 microRNA 数据库（http://www. mirbase. org/)中报道的核苷酸序列 miRNA-92a (MIMAT0000092)、miRNA-135b (MIMAT0000758)、 miRNA-18a (MIMAT0000072), miRNA-221 (MIMAT0000278), miRNA-19 (MIMAT0000073), miRNA-223 (MIMAT0000280)、miRNA-301a (MIMAT0000688)以及 GeneBank 数据库中的 C0X2 序列（JN793538 )为模板设计的。表1列出了所述miRNA的核苷酸序列。
[0020] 表 1
C0X2序列（序列号：JN793538 )如下： CACTTGACCAGAGCAGAGAGATGAAATACCAGTCTTTTAATGAGTATCGCAAACGTTTTCTGCTGAAGCCCTA TGAATCTTTTGAGGAACTTACAGGAGAGAAGGAAATGGCTGCAGAGTTAGAAGCGCTCTA (SEQ ID NO: 8)。
[0021] 本文的试剂盒可以检测的样品为来自肠癌疑似患者（如病人）的粪便、咽喉拭子、 泄殖腔拭子、组织样本、血清或血浆、疱瘆液、脑脊液或病毒分离培养物标本，优先为粪便， 其次优先选择血清。
[0022] 本发明提供的技术方案通过对少量miRNA和C0X2的检测即可实现对肠癌的准确 诊断，为生产出准确、高效和经济的检测产品提供了可能。建立的肠癌检测模型能较好地区 分肠癌个体和健康个体，对于肠癌患者的及时治疗和预防具有重要的临床实际意义。
[0023] 本领域技术人员知晓，可以根据相关标记物（所述miRNA和C0X2)的序列，对本发 明的引物序列和探针序列作出适当调整和修改，这些经过修改的引物序列和探针序列仍可 以用于检测所述的标记物。本发明也包括这些等同的技术方案。