与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽的制作方法

专利名称：与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地涉及癌症研究领域。本发明具体涉及与细胞增殖机制有关的新基因WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1以及由这些基因编码的多肽。本发明的基因和多肽可用于例如诊断细胞增殖性疾病，以及用作靶分子来开发针对所述疾病的药物。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)和结肠癌是世界范围内癌症死亡的诱因(Akriviadis et al.，Br J Surg 85(10)1319-31(1998))。尽管最新的医学进展已在诊断和治疗策略方面取得很大进步，但大量癌症患者在确诊时已到晚期，完全治愈晚期癌症是人们迫切关心的事情。最新的分子研究进展揭示出肿瘤抑制基因和/或癌基因的改变与癌症发生有关，然而，其精确的机理仍有待阐明。
最新分子生物学进展表明包含多个步骤的过程构成肝癌发生的基础，同时也构成结肠肿瘤发生和发展的基础。这些过程包括多个基因产物性质和数量上的改变。据报道B-连环蛋白/Tcf信号传导途径参与发育过程中的形态发生(Wodarz and Nusse，Annu Rev Cell Dev Biol 1459-88(1998)；Polakis，Genes Dev 141837-51(2000)；Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2000))。癌症研究的最新进展强调信号传导途径在人类肿瘤发展过程中的重要性，所述肿瘤可出现在结肠、肝脏、前列腺、胃、脑、子宫内膜或其它位置(Bullions and Levine，Curr Opin Oncol 1081-7(1998))。多发性结肠腺癌基因(APC)是一种肿瘤抑制基因，它与β-连环蛋白、Axin、conductin和糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)相互作用，促进β-连环蛋白经由遍在蛋白-蛋白体系统发生降解(Polakis，Genes Dev 141837-51(2000))。大多数散布的结肠肿瘤因APC，AXIN1或AXIN2(conductin)中的失活突变，或因CTNNB1(β-连环蛋白)中的稳定致癌突变而在胞质和/或细胞核中积累β-连环蛋白，从而导致β-连环蛋白/Tcf转录复合物的组成型激活(Polakis，Genes Dev 141837-51(2000)；Korinek et al.，Science 2751784-7(1997))。随后，复合物激活靶基因，如c-myc，细胞周期蛋白D1，matrilysin(MMP-1)，c-jun，fra-1，尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)，连接蛋白43，CD44，PPAR-，AF-17和ENC-1(He et al.，Science 2811509-12(1998)；Shtutman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 965522-7(1999)；Brabletz et al.，Am J Pathol 1551033-1038(1999)；Crawford et al.，Oncogene 182883-91(1999)；Mann et al.，Proc Natl Acad Sci USA 961603-8(1999)；van der Heyden et al.，J Cell Sci 1111741-9(1998)；Wielenga et al.，AmJ Pathol 154515-23(1999)；He et al.，Cell 99335-45(1999)；Lin et al.CancerRes 616345-9(2001)；Fujita et al.，Cancer Res 617722-6(2001))。然而，通过激活该途径的结肠癌肿瘤发生的精确机理仍有待阐明。
已知另一种蛋白质驿蛋白(stathmin)也与多种癌症有关(Hanash et al.，JBiol Chem 26312813-5(1988)；Roos et al.，Leukemia 71538-46(1993)；Nylander et al.，Histochem J 27155-60(1995)；Friedrich et al.，Prostate 27102-9(1995)；Bieche et al.，Br J Cancer 78701-9(1998))。驿蛋白(Sobel et al.，JBiol Chem 2643765-72(1989)Sobel et al.，Trends Biol Sci 16301-5(1991))是由148个氨基酸残基构成的胞质磷蛋白(19kD)，也被称为p19，prosolin，Lap18，癌蛋白18，metablastin和Op18。在多种多能胚胎癌性细胞和小鼠胚泡内细胞团的多能细胞中，驿蛋白的表达量很高(Doye et al.，Differentiation 5089-96(1992))。驿蛋白以几种非-磷酸化和磷酸化形式存在于细胞中，其存在形式依赖于多个生物系统中细胞的增殖、分化或激活状态(Sobel et al.，Trends Biol Sci 16301-5(1991))。另外，已知驿蛋白的微管解聚活性受其磷酸化水平变化的调节，据报道驿蛋白的微管解聚活性对于在细胞周期的不同时期调节微管的动态不稳定性起着关键作用(Marklund et al.，EMBO J 155290-8(1996)；Horwitz et al.，J Biol Chem 2728129-31(1997))。驿蛋白的充分磷酸化发生在有丝分裂期间(Strahler et al.，Biochem Biophy Res Commun185197-203(1992)；Luo et al.，J Biol Chem 26910312-8(1994)；Brattsand etal.，Eur J Biochem 220359-68(1994))，这似乎是细胞周期进程所必需的。然而，驿蛋白磷酸化的精确机理及其与癌症发生的关系仍有待阐明。
cDNA微阵列技术使人们获得正常和恶性细胞中基因表达的全面分布图(Okabe et al.，Cancer Res 612129-37(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。该方法披露了癌症细胞的复杂性质，有助于人们了解癌症发生的机理。鉴定出肿瘤中的失控基因能够更准确地诊断个体癌症，并可开发新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103311-20(2000))。为了从整个基因组的角度揭示肿瘤发生的机理，并且找出用于诊断和新型治疗药开发的靶分子，本发明人使用23040个基因的的cDNA微阵列来分析肿瘤细胞的基因表达分布图(Okabe et al.，CancerRes 612129-37(2001)Kitahara et al.，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 627012-7(2002))。
被设计用于揭示癌症发生机理的研究推动了抗-肿瘤药剂分子靶的鉴定。例如，最初被开发用于抑制与Ras有关的生长-信号传导途径、其激活依赖于翻译后法尼基化的法尼基转移酶抑制剂(FTI)能在动物模型中有效治疗Ras-依赖型肿瘤(He et al.，Cell 99335-45(1999))。联合使用抗癌药物和抗-HER2单克隆抗体trastuzumab对人进行了临床试验，以抵销原癌基因受体HER2/neu的作用；在乳腺癌患者身上已获得改善的临床反应和整体存活率(Lin et al.，Cancer Res 616345-9(2001))。选择性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571被开发用于治疗慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的组成型激活对白细胞转化起决定性作用。这些类型的药剂被设计用于抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita et al.，Cancer Res 617722-6(2001))。
发明概述本发明的目的是提供与肝细胞癌或结肠癌细胞的增殖机理有关的新蛋白质和编码所述蛋白质的基因，以及所述蛋白质和基因的制备方法和使用它们诊断和治疗肝细胞癌(HCC)或结肠癌的方法。
为了揭示肝细胞癌和结肠癌的癌症发生机理，并鉴定出新的诊断标记和/或治疗这些肿瘤的药物靶，本发明人使用含有23040个基因的全-基因组cDNA微阵列分析了基因在肝细胞和结肠癌症发生中的表达分布图。从药物学的观点看，在实际操作中抑制致癌信号比激活肿瘤-抑制效应更加容易。因此，本发明人检索了在肝细胞和结肠癌症发生过程中被上调的基因。
从在肝细胞癌中一般被上调的转录物中，将新的人基因WDRPUH(在HCC中被上调的WD40重复蛋白)和KRZFPUH(在HCC中被上调的Kruppel-型锌指蛋白)分别定位于染色体带17p13和16p11。WDRPUH或KRZFPUH的基因转移促使细胞增殖。另外，通过转染其特异性的反义S-寡核苷酸来降低WDRPUH或KRZFPUH表达即可抑制HCC细胞生长。很多抗癌药物，如DNA和/或RNA合成抑制剂、代谢抑制因子和DNA嵌入剂不仅对癌细胞有毒，对正常生长的细胞也有毒。然而，抑制WDRPUH和KRZFPUH表达的药剂对其它器官却没有不利的作用，这是因为这些基因的正常表达分别局限于睾丸以及胎盘和睾丸，因此所述药剂对治疗癌症非常重要。
另外，从在结肠癌中一般被上调的转录物中，鉴定出定位于染色体带6p21.1的基因PPIL1(肽基脯氨酸异构酶-样1)。另外，免疫沉淀试验揭示出PPIL1蛋白与参与维生素D受体转录活性的蛋白质SNW1(SKI相互作用蛋白)和参与细胞周期进程的胞质磷蛋白驿蛋白结合。本发明人还检索了调节β-连环蛋白/Tcf4复合物的基因，所述基因在肝癌和结肠癌中被异常上调，并且鉴定出定位于染色体带18p11.2的新基因APCDD1(被多发性结肠腺癌下调)。所述基因的表达因转导野生型APC而降低，并在绝大多数结肠癌组织中有所升高。PPIL1或APCDD1的基因转移促使缺乏任一种所述基因的内源性表达的细胞增殖。另外，通过转染针对PPIL1或APCDD1的特异性反义S-寡核苷酸降低PPIL1或APCDD1表达即可抑制结肠癌细胞生长。
因此，本发明提供了分离的新基因WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1，这些基因是候选的癌症诊断标记，并且是可用于开发新诊断策略和有效抗癌剂的理想的潜在靶。另外，本发明提供了由这些基因编码的多肽及其制备方法和用途。更具体地，本发明提供了下述内容本申请提供了新的人多肽WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1或其功能等同物，所述多肽能促进细胞增殖，并且在如HCC和结肠癌的细胞增殖疾病中被上调。
在优选实施方案中，WDRPUH多肽包括推定的由SEQ ID NO1的开放阅读框编码的620个氨基酸长的蛋白质，所述蛋白质具有11个WD40重复结构域。WDRPUH多肽优选包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本申请还提供了由WDRPUH多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ ID NO1所示序列至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
另一方面，在优选实施方案中，KRZFPUH多肽包括推定的与大鼠基因锌指蛋白HIT-39(GenBank登录号AF277902)具有同源性的500个氨基酸长的蛋白质，并包括由SEQ ID NO3的开放阅读框编码的Krupple-型锌指蛋白结构域(KRAB)。KRZFPUH多肽优选包括SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。本申请还提供了由KRZFPUH多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ IDNO3所示序列至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
另外，在优选实施方案中，PPIL1多肽包括推定的由SEQ ID NO5的开放阅读框编码的166个氨基酸长的蛋白质，所述蛋白质与Ppil1的同一性为98.1％，与PPIA的同一性为41.6％，与Cyp2的同一性为57.4％，与CypE的同一性为50％。PPIL1多肽优选包括SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。本申请还提供了由PPIL1多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ ID NO5所示序列至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
另外，在优选实施方案中，APCDD1多肽包括推定的由SEQ ID NO7的开放阅读框编码的514个氨基酸长的蛋白质，所述蛋白质与解木聚糖热杆菌(Themobacillus xylanilyticus)的内切-1，4-β-木聚糖酶有31％的同一性。APCDD1多肽优选包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。本申请还提供了由APCDD1多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ ID NO7所示序列至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
本发明还提供了新的人基因WDRPUH和KRZFPUH，与相应的非癌肝组织相比，在绝大多数HCC中，所述基因的表达显著升高。分离的WDRPUH基因包括SEQ ID NO1所述的多核苷酸序列。WDRPUH cDNA特别地包括2152个核苷酸，其中含有1860个核苷酸长的开放阅读框。本发明还包括能与SEQ ID NO1所示多核苷酸序列杂交并与其至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码WDRPUH蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO1的简并和等位突变体。另一方面，分离的KRZFPUH基因包括SEQ ID NO3所述的多核苷酸序列。KRZFPUH cDNA特别地包括2744个核苷酸，其中含有1500个核苷酸长的开放阅读框。本发明还包括能与SEQ ID NO3所示多核苷酸序列杂交并与其至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码KRZFPUH蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ IDNO3的简并和等位突变体。
另外，本发明提供了新的人基因PPIL1，与相应的非癌组织相比，在绝大多数结肠癌中，所述基因的表达显著升高。分离的PPIL1基因包括SEQ ID NO5所述的多核苷酸序列。PPIL1 cDNA特别地包括1734个核苷酸，其中含有498个核苷酸长的开放阅读框。本发明还包括能与SEQ ID NO5所示多核苷酸序列杂交并与其至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码PPIL1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO5的简并和等位突变体。
另外，本发明提供了新的人基因APCDD1，与相应的非癌组织相比，在绝大多数原发性结肠癌中，所述基因的表达显著升高，将野生型APC1转导至结肠癌细胞后，所述基因对其作出反应而被下调。分离的APCDD1基因包括SEQ ID NO7所述的多核苷酸序列。APCDD1 cDNA特别地包括2607个核苷酸，其中含有1542个核苷酸长的开放阅读框。本发明还包括能与SEQ ID NO7所示多核苷酸序列杂交并与其至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码APCDD1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO7的简并和等位突变体。
本文所用的分离基因是一种多核苷酸，其结构与任何天然多核苷酸结构或横跨三个以上分离基因的天然基因组多核苷酸的任何片段的结构都不相同。因此，该术语包括例如(a)具有生物体基因组中的天然基因组DNA分子的部分序列的DNA，所述DNA天然存在于所述生物体中；(b)以所得分子不同于任何天然载体或基因组DNA的方式掺入原核或真核载体或基因组DNA的多核苷酸；(c)分离的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链反应(PCR)产生的片段或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因，即编码融合多肽的基因的一部分。
因此，本发明一方面提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选分离的多核苷酸包括与SEQ ID NO1，3，5或7所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选分离的核酸分子与SEQ ID NO1，3，5或7所示核苷酸序列的同一性至少为65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。当分离的多核苷酸的长度长于或等于参照序列，如SEQ ID NO1，3，5或7时，与参照序列的全长进行比较。当分离的多核苷酸的长度短于参照序列，如短于SEQ ID NO1，3，5或7时，与相同长度的参照序列的区段进行比较(排除同源性计算所需的任何环)。
本发明还提供了生产蛋白质的方法，所述方法是用编码WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并且表达所述多核苷酸序列。另外，本发明提供了含有编码WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的核苷酸序列的载体，和携有编码WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸的宿主细胞。所述载体和宿主细胞可用于生产WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白。
本申请还提供了识别WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的抗体。在某种程度上还提供了WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的反义多核苷酸(如反义DNA)、核酶和siRNA(小的干扰RNA)。
本发明还提供了诊断细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括测定样本生物样品中基因的表达水平，将WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平与正常样品中的相比较，将样品中WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的高表达水平定义为患有细胞增殖性疾病，如癌症。适于通过WDRPUH或KRZFPUH的表达水平诊断的疾病是肝细胞癌；适于用PPIL1或APCDD1的表达水平检测的是结直肠癌。
另外，还提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法。所述方法包括使WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽与受试化合物接触，并选择与WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽结合的受试化合物。
本发明还提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括使WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽与受试化合物接触，并选择能抑制WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽的表达水平或生物活性的受试化合物。
本发明还提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在适于表达报道基因的条件下，使受试化合物、β-连环蛋白/Tcf 4复合物和具有APCDD1的转录调节区、含有两个Tcf/LEF结合基元的报道基因接触，并选择抑制报道基因表达的受试化合物。
另外，本发明提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受试化合物的存在下使PPIL1与驿蛋白或SNW1接触，并选择抑制PPIL1与驿蛋白或SNW1结合的受试化合物。
本申请还提供了用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症的药物组合物。药物组合物可以是例如抗癌剂。药物组合物可被描述为分别如SEQ ID NO1，3，5或7所示和所述的WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。适当的反义S-寡核苷酸具有选自SEQ ID NO16，37，44或89的核苷酸序列。包括具有SEQ ID NO16所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的WDRPUH反义S-寡核苷酸适用于治疗肝癌和胃癌；包括具有SEQ ID NO37所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的KRZFPUH反义S-寡核苷酸适用于治疗肝癌、胃癌和肺癌；包括具有SEQID NO44所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的PPIL1反义S-寡核苷酸适用于治疗结肠癌；而包括具有SEQ ID NO89所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的APCDD1反义S-寡核苷酸适用于治疗结肠癌。药物组合物也可以含有通过本发明的治疗细胞增殖性疾病的化合物的筛选方法所选择的化合物。
药物组合物的作用过程需要抑制癌细胞的生长。可将所述药物组合物施用于哺乳动物，包括人和家养的哺乳动物。
本发明还提供了使用本发明提供的药物组合物治疗细胞增殖性疾病的方法。
另外，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽的步骤。预期施用WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽能引发抗肿瘤免疫力。因此，本发明还提供了引发抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括施用WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽，以及含有WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1多肽的治疗或预防癌症的药物组合物的步骤。
应理解不论是上文的发明概述还是下文的详细描述都是优选的实施方案，而不是对本发明或本发明的其它可替换实施方案的限制。


图1a至1d显示出WDRPUH和KRZFPUH在HCC中的表达。图1a显示出通过cDNA微阵列检测获得的WDRPUH在20个HCC中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器(Cy3和Cy5信号都大于25,000)的12个HCC中，11个HCC中的WDRPUH表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图1b显示出KRZFPUH在20个HCC中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器的14个HCC中，11个HCC中的KRZFPUH表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图1c和1d提供照片显示出使用额外的10个HCC病例，经半-定量RT-PCR分析获得的WDRPUH(c)和KRZFPUH(d)的表达情况(T，肿瘤组织；N，正常组织)。将GAPDH的表达用作内部对照。
图2a和2b显示出WDRPUH在多种人组织中的表达以及WDRPUH的推定蛋白质结构和蛋白质基元。图2a提供照片显示出经多组织Northern印迹分析获得的WDRPUH在多种人组织中的表达。图2b显示出WDRPUH的推定蛋白质结构。
图3提供照片显示出WDRPUH的亚细胞定位，所述定位是通过免疫细胞化学在经pcDNA3.1myc/His-WDRPUH转染的SNU475细胞上观察得到的，其中特别地使用了抗-myc单克隆抗体，为了进行观察还使用了与FITC偶联的抗-小鼠IgG第二抗体。细胞核用DAPI复染。
图4a和4b显示出WDRPUH对NIH3T3细胞的细胞生长的影响。图4a提供照片显示出被WDRPUH，WDRPUH的反义核酸和单独的载体转染的NIH3T3细胞的集落形成试验结果。图4b显示出经电光密度法计数的集落数目。(*)表示经Student’s t试验测定的与对照细胞的显著性差异(p＜0.05)。
图5a和5b显示出被指定用于抑制WDRPUH的反义S-寡核苷酸的生长抑制作用。图5a提供照片显示出WDRPUH和GAPDH(对照)在用有义(WDRPUH-S4)或反义(WDRPUH-AS4)寡核苷酸处理12小时的SNU475细胞中的表达。图5b显示出用寡核苷酸处理72小时后，经MTT试验测定的SNU475细胞的细胞生存力。
图6A和6B显示出WDRPUH-siRNA的生长抑制作用。图6A提供照片显示出WDRPUH和GAPDH(对照)在被WDRPUH-siRNA转染的HepG2细胞中的表达。图6B提供照片显示出用对照-siRNA或WDRPUH-siRNA处理的存活细胞的Giemsa染色结果。
图7提供照片显示出经FLAG-标记的WDRPUH蛋白使用抗-WDRPUH抗血清(#1，#2和#3)，预-免疫血清(pre-immune sera)和抗-FLAG抗体的狭线印迹(slot blot)分析结果。
图8a和8b显示出KRZFPUH在多种人组织中的表达以及KRZFPUH的推定蛋白质结构和蛋白质基元。图8a提供照片显示出经多组织Northem印迹分析获得的KRZFPUH在多种人组织中的表达。图8b显示出KRZFPUH的推定蛋白质结构。
图9提供照片显示出KRZFPUH的亚细胞定位，所述定位是通过免疫细胞化学在经pcDNA3.1myc/His-KRZFPUH转染的SNU475细胞上观察得到的，其中特别地使用了抗-His单克隆抗体，为了进行观察还使用了与罗丹明偶联的抗-小鼠IgG第二抗体。细胞核用DAPI复染。
图10a和10b显示出KRZFPUH对COS7细胞的细胞生长的影响。图10a提供照片显示出被KRZFPUH转染，和被KRZFPUH的反义核酸转染的COS7细胞的集落形成试验结果。图10b显示出经电光密度法计数的集落数目。(*)表示经Student’s t试验测定的与对照细胞的显著性差异(p＜0.05)。
图11a和11b显示出被指定用于抑制KRZFPUH的反义S-寡核苷酸的生长抑制作用。图11a提供照片显示出WDRPUH和GAPDH(对照)在被有义(KRZFPUH-S4)或反义(KRZFPUH-AS4)寡核苷酸转染的Alexander细胞中的表达。图11b显示出KRZFPUH在用KRZFPUH-S4或KRZFPUH-AS4处理12小时的SNU475细胞中的表达。(*)表示经Student’s t试验测定的与对照细胞的显著性差异(p＜0.05)。
图12A至12D显示出KRZFPUH-siRNA对Huh7细胞中KRZFPUH表达的生长抑制作用。图12A表示使用提取自Huh7细胞的RNA进行的半定量RT-PCR的结果，其中所述细胞被psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)，psiU6BX-EGFP(EGFP)或模拟载体(Mock)转染。将GAPDH用作内部对照。图12B显示出在转染的第5天，用对照质粒(Mock和EGFP)或表达KRZFPUH-siRNA的质粒转染的存活细胞的MTT试验结果。(*)表示经Fisher’s protected least显著性差异试验测定的显著性差异(p＜0.01)。图12C显示出在转染的第10天，用对照质粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)转染的存活细胞的MTT试验结果。(*)表示经Fisher’s protected least显著性差异试验测定的显著性差异(p＜0.01)。图12D提供照片显示出在转染的第10天，用对照质粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)转染的存活细胞的Giemsa染色结果。
图13A至13C显示出KRZFPUH-siRNA对多种细胞生存力的影响。图13A显示出在转染的第10天，使用经对照质粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)转染的Alexander细胞进行的MTT试验的结果。图13B显示出在转染的第10天，使用经对照质粒(Mock和EGFP)或psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)转染的SNU449细胞进行的MTT试验的结果。图13C显示出经MTT试验测定的KRZFPUH-siRNA对HepG2细胞生存力的影响。(*)表示经Fisher’s protected least显著性差异试验测定的显著性差异(p＜0.01)。
图14a和14b显示出PPIL1在结肠癌中的表达。图14a显示出通过cDNA微阵列检测获得的PPIL1在11个结肠癌病例中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器的6个病例中，6例中的PPIL1表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图14b提供照片显示出使用额外的20个结肠癌病例，经半-定量RT-PCR分析获得的PPIL1的表达情况(T，肿瘤组织；N，正常组织)。将GAPDH的表达用作内部对照。
图15显示出PPIL1(人(Homo sapiens))，Ppil1(鼠(Mus musculus))，Cyp2(粟酒裂殖糖酵母(Schzosaccharomyces pombe))和CypE(Dictiostelium discoideum)之间的相似性。
图16显示出PPIL1对NIH3T3和HCT116细胞的细胞生长的影响。图16a提供照片显示出被PPIL1转染的NIH3T3细胞的集落形成试验结果。图16b提供照片显示出被PPIL1转染的HCT116细胞的集落形成试验结果。在这两个实验中，将pcDNA-LacZ和表达PPIL1编码区的互补链的pcDNA3.1-antisense用作阴性对照。
图17a至17c显示出PPIL1的反义S-寡核苷酸在人结肠癌细胞系SW480中的生长抑制作用。图17a提供照片显示出PPIL1和GAPDH(对照)在用有义(PPIL1-S2)、反义(PPIL1-AS2)或scramble(PPIL1-SCR2)S-寡核苷酸处理的SW480细胞中的表达。图17b提供照片显示出PPIL1-AS2的生长抑制作用。图17c显示出用寡核苷酸处理72小时后，经MTT试验测定的SE480、SNUC4和SNUC5细胞的细胞生存力。
图18提供照片表示PPIL1在体外与SNW1结合。用pFLAG CMV-PPIL1和pcDNA3.1myc/His-SNW1共转染COS7细胞。将细胞裂解物与抗c-Myc多克隆抗体或抗FLAG单克隆抗体一起进行免疫沉淀，分别用抗-FLAG单克隆抗体或抗c-Myc多克隆抗体进行免疫印迹。
图19a至19d提供照片显示出经FLAG标记的PPIL1和经myc-标记的SNW1蛋白的亚细胞定位。图19a提供照片显示出用pFLAG CMV-PPIL1转染、并用抗-FLAG M2单克隆抗体染色的COS7细胞。使用经罗丹明标记的抗小鼠IgG抗体观察到经标记的蛋白质。图19b提供照片显示出用pcDNA3.1myc/His-SNW1转染、并用抗c-Myc抗体染色的COS7细胞。使用经FITC标记的抗兔IgG抗体观察到经标记的蛋白质。图19c是细胞的照片，其中细胞核被DAPI复染。图19d是(a)，(b)和(c)的合并图。PPIL1和SNW1共同定位于细胞核中。
图20提供照片显示出经多组织Northern印迹分析获得的PPIL1在多种人组织中的表达。
图21A和21B显示出PPIL1-siRNA对SNUC4和SNUC5细胞的生长抑制作用。图21A提供照片显示出PPIL1和GAPDH(对照)在被PPIL1-siRNA转染的SNUC4和SNUC5细胞中的表达。图21B提供照片显示出用对照-siRNA或PPIL1-siRNA处理的存活细胞的Giemsa染色结果。
图22A和22B显示出PPIL1重组蛋白质在大肠杆菌中的表达。图22A提供照片显示出与GST-融合的PPIL1蛋白的表达。图22B提供照片显示出经His-标记的PPIL1蛋白的表达。
图23A和23B显示出在酵母双杂合系统(yeast two-hybrid system)中，PPIL1和驿蛋白之间的相互作用。图23A提供照片显示出在双杂合系统中PPIL1与驿蛋白的相互作用。图23B提供照片显示出PPIL1与驿蛋白在体内的相互作用。
图24显示出PPIL1和驿蛋白共同定位于被pFLAG-PPIL1和pCMV-HA-STMN共转染的COS7细胞的胞质中。图24提供照片显示出对COS7细胞胞质中PPIL1和驿蛋白的荧光免疫组化染色结果。
图25A和25B显示出驿蛋白的多个缺失突变体与PPIL1在体内的相互作用。图25A图解显示了驿蛋白的多个缺失突变体结构。图25B提供照片显示出驿蛋白的表达以及PPIL1与缺失突变体在体内的共沉淀。
图26A和26B显示出驿蛋白突变体与PPIL1在体内的相互作用。图26A图解显示了驿蛋白突变体，其中Ser被Ala所取代。图26B提供照片显示出驿蛋白的表达以及PPIL1与突变体在体内的共沉淀。
图27a至27c提供照片显示出APCDD1的表达。图27a提供照片阐明了被Ad-APC或Ad-Axin转染的SW480细胞中APCDD1表达的降低。从以MOI100被所示腺病毒感染的SW480细胞中分离RNA和蛋白质提取物并保温72小时。图27b提供照片显示出经Northem印迹分析得到的APCDD1在成人组织中的表达。APCDD1在心脏、胰腺、前列腺和卵巢中显著表达，而在肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺、结肠和外周血细胞中几乎不表达。图27c提供照片显示出经半定量RT-PCR测定的APCDD1在结肠癌组织(T)和相应的非癌粘膜(N)中的表达。在所检查的30个病例的20例中观察到增加的表达(67％)。将GAPDH的表达用作内部对照。
图28显示出使用多种APCDD1质粒进行的报道子试验(reporter assay)的结果。图28a图解显示了APCDD1 5’侧翼区中的推定Tcf4-结合元件和多种APCDD1报道质粒。加号和减号表示自推定的转录起始位点起的核苷酸位置。图28b表示被报道质粒和表达质粒(pcDNA-mock，pcDNA-mut β-catenin，pcDNA-wtTcf-4，或pcDNA-dnTcf4)以多种组合共转染的HeLa细胞的萤光素酶活性。转染后48小时，同时进行三份报道试验。线条表示SD。(*)表示经Scheffé’s F试验测定的显著性差异(P＜0.01)。
图29提供照片表示EMSA的结果，图中显示出含有TBM1或TBM2的元件与β-连环蛋白/Tcf4复合物之间的相互作用。加入抗-β-连环蛋白抗体(泳道2)而不是抗-P53-抗体(泳道3)之后，观察到代表复合物的带的超级位移。通过加入未经标记的野生型探针特异性封闭对应于Tcf4-探针和β-连环蛋白/Tcf4-探针的带(泳道5)。
图30显示出APCDD1在体外对LoVo细胞的细胞生长的影响。图30a提供照片显示出LoVo细胞集落-形成试验的结果。用pcDNA3.1-APCDD1、pcDNA或pcDNA-antisense转染细胞。图30b提供照片显示出APCDD1在表达外源性APCDD1的LoVo细胞(LoVo-APCDD1)和对照(LoVo-载体)细胞中的表达。图30c显示出LoVo-APCDD1和LoVo-载体细胞的生长。图30d显示出在裸鼠中两克隆LoVo-APCDD1细胞和两克隆LoVo-载体细胞内的肿瘤生长。
图31A至31C显示出被指定用于降低APCDD1表达的反义S-寡核苷酸的生长抑制作用。图31A提供照片显示出APCDD1在用有义(APCDD-S2)或反义(APCDD-AS2)S-寡核苷酸处理24小时的SW480细胞中的表达。将GAPDH的表达用作内部对照。图31B提供照片显示出APCDD-AS2的生长抑制作用。图31C显示出用寡核苷酸处理之后，经MTT试验测定的SW480细胞的细胞生存力。线条表示SD。(*)表示经Scheffé’s F试验测定的显著性差异(P＜0.01)。
图32提供照片显示出用APCDD1、用或不用pFLAG-APCDD1转染的COS7细胞，以及结肠癌细胞系的Western印迹分析结果。
图33提供照片显示出APCDD1蛋白在SW480细胞中的亚细胞定位。
图34提供照片显示出结肠的非癌粘膜(A)和腺癌(B)中APCDD1的荧光免疫组化染色结果。
图35提供照片显示出结肠癌组织中APCDD1的免疫组化染色结果。
图36提供照片显示出结肠腺瘤中APCDD1的免疫组化染色结果。
发明详述除非另有说明，本文所用术语“一个”、“一种”指的是“至少一个”和“至少一种”。
本申请鉴定出新的人基因WDRPUH和KRZFPUH，与相应的非癌肝组织相比，所述基因在HCC中的表达显著升高。WDRPUH cDNA由2152个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO1所示的1860个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的620个-氨基酸长的蛋白质，其中含有11个WD40重复结构域。因此，将该蛋白质命名为WDRPUH(在HCC中被上调的WD40重复蛋白质)。另一方面，KRZFPUH cDNA由2744个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO3所示的1500个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的500个-氨基酸长的蛋白质，其中含有Kruppel-型锌指蛋白结构域。因此，将该蛋白质命名为KRZFPUH(在HCC中被上调的Krupple-型锌指蛋白)。
此外，本发明包括新的人基因PPIL1和APCDD1，与相应的非癌组织相比，所述基因在结肠癌中的表达显著升高。PPIL1 cDNA由1734个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO5所示的498个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的166个-氨基酸长的蛋白质。PPIL1与参与维生素D受体转录活性的蛋白质，即SKI相互作用蛋白(SNW1)以及参与细胞周期进程的胞质磷蛋白，即驿蛋白直接结合。另一方面，APCDD1 cDNA由2607个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO7所示的1542个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的514个-氨基酸长的蛋白质，其中不含已知的基元。该基因被称为APCDD1(被APC1下调)。另外，β-连环蛋白/Tcf4复合物通过与APCDD1转录调节区中的两个Tcf/LEF结合基元结合来增强APCDD1的表达。
WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1在细胞内的外源性表达总能使细胞生长增强，而用反义S-寡核苷酸或小的干扰RNA(siRNA)抑制其表达会导致对癌细胞的显著生长-抑制作用。这些发现表明WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1为癌细胞提供了致癌活性，抑制这些蛋白质的活性不失为一种治疗癌症的理想策略。
本发明包括新的人基因WDRPUH，其包括SEQ ID NO1所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码WDRPUH蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其功能等同物。与WDRPUH蛋白功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人WDRPUH蛋白相对应的同源蛋白质以及人WDRPUH蛋白的突变体。
本发明包括新的人基因KRZFPUH，其包括SEQ ID NO3所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码KRZFPUH蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO4所示氨基酸序列或其功能等同物。与KRZFPUH功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人KRZFPUH蛋白相对应的同源蛋白质以及人KRZFPUH蛋白的突变体。
另外，本发明包括新的人基因PPIL1，其包括SEQ ID NO5所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码PPIL1蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO6所示氨基酸序列或其功能等同物。与PPIL1功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人PPIL1蛋白相对应的同源蛋白质以及人PPIL1蛋白的突变体。
本发明包括新的人基因APCDD1，其包括SEQ ID NO7所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码APCDD1蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO8所示氨基酸序列或其功能等同物。与APCDD1功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人APCDD1蛋白相对应的同源蛋白质以及人APCDD1蛋白的突变体。
在本发明中，术语“功能等同”指的是所述多肽具有类似于WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的促进细胞增殖的活性，并能赋予癌细胞以致癌活性。通过将编码所述多肽的DNA导入表达各个多肽的细胞，并检测对细胞增殖的促进作用或集落形成活性的提高，即可判断所述多肽是否具有细胞增殖活性。所述细胞包括例如针对WDRPUH的NIH3T3，SNU475和HepG2；针对KRZFPUH的COS7和Alexander细胞；针对PPIL1的NIH3T3，HCT116，SW480，SNU-C4和SNU-C5；以及针对APCDD1的LoVo细胞和SW480。或者，可通过检测其与SNW1或驿蛋白的结合能力来判断所述多肽是否与PPIL1功能等同。
与给定蛋白质功能等同的多肽的制备方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括在蛋白质中导入突变的已知方法。例如，本领域技术人员通过定点诱变(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152271-275(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154350-367(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-492(1985)；Kunkel，Methods Enzymol852763-2766(1988))在人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列中导入适当的突变，即可制备出与所述的任一种蛋白质功能等同的多肽。氨基酸突变也可自然发生。本发明的多肽包括具有人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列的蛋白质，其中一个或多个氨基酸已经突变，条件是所得突变多肽与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的功能等同。所述突变体中突变氨基酸的数目一般为10个氨基酸或更少，优选为6个氨基酸或更少，更优选为3个氨基酸或更少。
已知经突变或修饰的蛋白质能保留原始的生物活性，其中所述蛋白质具有因在某个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 815662-5666(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 106487-6500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 796409-6413(1982))。
优选将待突变的氨基酸残基突变成不同的氨基酸，其中氨基酸侧链的特性是保守的(已知为保守的氨基酸取代过程)。氨基酸侧链特性的例子为疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及具有下述官能团或共有特性的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱基侧链(R，K，H)和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。需说明的是括号中的字母表示氨基酸的单字母代码。
在人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基所得多肽的例子是含有人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白与其它肽或蛋白质的融合蛋白，本发明包括所述融合蛋白。通过本领域技术人员众所周知的技术即可制备融合蛋白，例如将编码本发明的人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接，使得读码框匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述融合DNA。对于与本发明的蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。
可用于与本发明的蛋白质融合的已知肽包括例如FLAG(Hopp et al.，Biotechnology 61204-1210(1988))、含有6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标记、HSV-标记、E-标记、SV40T抗原片段、lck标记、α-微管蛋白片段、B-标记、C蛋白片段等。可与本发明的蛋白质融合的蛋白质包括例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。
通过将编码上述融合肽或蛋白质的商购DNA与编码本发明多肽的DNA融合，并表达所制备的融合DNA即可制备出融合蛋白。
另一种本领域已知的分离功能等同多肽的方法是例如使用杂交技术的方法(Sambrook et al，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本领域技术人员能容易地分离出与编码人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的DNA序列(即SEQ ID NO1，3，5或7)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且能从分离的DNA中分离出人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的功能等同多肽。本发明的多肽包括由能与编码人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的DNA序列的全部或部分杂交的DNA编码、并且与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括对应于人源蛋白质的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。当从动物中分离与编码人WDRPUH蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自睾丸的组织。或者，当从动物中分离与编码人KRZFPUH蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自胎盘或睾丸的组织。另外，当从动物中分离与编码人PPIL1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自心脏、骨骼肌、睾丸、甲状腺或肾上腺的组织；当从动物中分离与编码人APCDD1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，优选使用得自心脏、胰腺、前列腺、卵巢、肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺、结肠或外周白细胞的组织，特别优选使用得自心脏、胰腺、前列腺或卵巢的组织。
本领域技术人员可以常规选择分离DNA所用的杂交条件，所述DNA编码与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽。例如，可通过于68℃使用“Rapid-hyb缓冲液”(Anersham LIFE SCIENCE)进行预杂交达30分钟或更长时间，加入经标记的探针并于68℃加热1小时或更长时间来进行杂交。例如，可在低严紧条件下进行下述洗涤步骤。低严紧条件是例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或优选为50℃，2×SSC，0.1％SDS。更优选使用高度严紧条件。高度严紧条件是例如室温下用2×SSC，0.01％SDS洗涤3次，每次20分钟，然后于37℃用1×SSC，0.1％SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50℃用1×SSC，0.1％SDS洗涤2次，每次20分钟。然而，几个诸如温度和盐浓度的因素可影响杂交的严紧度，本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需的严紧度。
可以使用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法替代杂交来分离DNA，所述DNA编码与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽，所述方法使用基于编码蛋白质的DNA序列信息(SEQ ID NO1，3，5或7)所合成的引物。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽一般与人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。“高度同源性”一般指的是同源性为40％或更高，优选为60％或更高，更优选为80％或更高，甚至更优选为95％或更高。根据“Wilbur andLipman，Proc Natl Acad Sci USA 80726-730(1983)”中的算法即可测定多肽的同源性。
本发明多肽的氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在或缺乏、或形式可以有所不同，这取决于用于产生所述多肽的细胞或宿主或所使用的纯化方法。无论如何，只要其功能等同于本发明的人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白，就落入本发明的范围。
通过本领域技术人员众所周知的方法可将本发明的多肽制备成重组蛋白质或天然蛋白质。通过下述方法即可制备重组蛋白质，即将编码本发明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，通过对提取物进行层析来纯化多肽，所述层析包括例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、或利用固定有抗本发明蛋白质之抗体的层析柱的亲和层析，或一种以上所述柱的组合。
另外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中将本发明的多肽表达成与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白或添加有多个组氨酸的重组蛋白质时，可使用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化所表达的重组蛋白质。或者，当将本发明的多肽表达成被c-myc，多个组氨酸或FLAG标记的蛋白质时，可分别使用抗c-myc，His或FLAG的抗体来检测和纯化所述蛋白质。
纯化融合蛋白之后，必要时也可以通过凝血酶或Xa因子切割来切除非目的多肽区域。
通过本领域技术人员已知的方法，例如通过使结合有能与WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白结合的下述抗体的亲和柱与表达本发明多肽的组织或细胞提取物接触，即可分离出天然蛋白质。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还包括本发明多肽的部分肽。部分肽具有本发明多肽所特有的氨基酸序列，并由至少7个氨基酸，优选为8个或更多个氨基酸，更优选为9个或更多个氨基酸组成。部分肽可用于例如制备抗本发明多肽的抗体，筛选与本发明多肽结合的化合物，以及筛选本发明多肽的促进剂或抑制剂。
通过基因工程，通过已知的肽合成法或通过用适当的肽酶消化本发明的多肽，即可产生本发明的部分肽。例如，可以使用固相合成或液相合成来进行肽合成。
另外，本发明提供了编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于体内或体外产生如上所述的本发明多肽，或者可用于因编码本发明蛋白质的基因中的基因异常所致疾病的基因治疗。可以使用任何形式的本发明的多核苷酸，只要它能编码本发明的多肽即可，其包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA和化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列及其简并序列的DNA，只要所得DNA能编码本发明的多肽即可。
通过本领域技术人员已知的方法即可制备本发明的多核苷酸。例如，可通过下述方法制备本发明的多核苷酸由表达本发明多肽的细胞制备cDNA文库，并使用本发明DNA(如SEQ ID NO1，3，5或7)的部分序列作为探针进行杂交。例如，通过Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中所述的方法即可制备cDNA文库；或者也可以使用商购的cDNA文库。也可通过下述方法制备cDNA文库从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，基于本发明DNA的序列(如SEQ ID NO1，3，5或7)合成寡DNA，使用寡DNA作为引物进行PCR，并扩增编码本发明蛋白质的cDNA。
另外，通过对所得cDNA的核苷酸进行测序，即可常规测定由cDNA编码的翻译区，并能容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。另外，通过使用所得cDNA或其部分作为探针筛选基因组DNA文库，即可分离出基因组DNA。
更具体地，可首先从表达本发明目的多肽的细胞、组织或器官中制备mRNA(WDRPUH睾丸；KRZFPUH胎盘或睾丸；PPIL1心脏、骨骼肌、睾丸、甲状腺或肾上腺；APCDD1心脏、胰腺、前列腺、卵巢、肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺、结肠或外周白细胞，优选为心脏、胰腺、前列腺或卵巢)。可使用已知方法分离mRNA；例如，通过胍超速离心(Chirgwin et al.，Biochemistry 185294-5299(1979))或AGPC法(Chomczynskiand Sacchi，Anal Biochem 162156-159(1987))即可制备总RNA。另外，可使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中纯化mRNA，或者使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。
使用逆转录酶，用所得mRNA合成cDNA。可使用商购的试剂盒，如AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)合成cDNA。或者，可以根据5’-RACE法(Frohman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 858998-9002(1988)；Belyavsky et al.，Nucleic Acids Res 172919-2932(1989))合成和扩增cDNA，所述方法使用本文所述的引物、5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链反应(PCR)。
由PCR产物制备所需DNA片段，并与载体DNA连接。使用重组载体转化大肠杆菌等，由选定菌落制备所需重组载体。通过常规方法，如双脱氧核苷酸链终止法证实所需DNA的核苷酸序列。
考虑到用于表达的宿主中的密码子使用频率，将本发明多核苷酸的核苷酸序列设计成能够更有效地表达(Grantham et al.，Nucleic Acids Res 943-74(1981))。可通过商购试剂盒或常规方法改变本发明多核苷酸的序列。例如，可通过用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或适当的多核苷酸片段、添加接头或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或TAG)来改变序列。
具体地说，本发明的多核苷酸包括含有核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7的DNA。
另外，本发明提供了能在严紧条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7的多核苷酸杂交、并且编码与上文所述的本发明WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可适当选择严紧条件。例如，可使用低度严紧条件。更优选使用高度严紧条件。这些条件与上文所述的相同。上述杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。
本发明还提供了载体，其中插入了本发明的多核苷酸。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的多核苷酸，尤其是DNA，从而表达本发明的多肽，或者可用于施用本发明的多核苷酸以进行基因治疗。
当宿主细胞为大肠杆菌，并且在大肠杆菌(如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)中大量扩增和制备载体时，载体应具有欲在大肠杆菌中扩增的″ori″和用于选择转化的大肠杆菌的标记基因(例如用药物进行选择的药物-抗性基因，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等)。例如，可使用M13-系列载体、pUC-系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，也可使用pGEM-T、pDIRECT和pT7亚克隆和提取cDNA以及上述载体。当使用载体制备本发明的蛋白质时，表达载体特别有用。例如，欲在大肠杆菌中表达的表达载体应具有欲在大肠杆菌中扩增的上述特征。当将大肠杆菌，如JM109，DH5α，HB101或XLlBlue用作宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中有效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward etal.，Nature 341544-546(1989)；FASEB J 62422-2427(1992))、araB启动子(Better et al.，Science 2401041-1043(1988))或T7启动子等。在此方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(此时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体也可含有多肽分泌所用的信号序列。介导多肽分泌至大肠杆菌周质的信号序列的例子为pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 1694379(1987))。将载体导入靶宿主细胞的方法包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，也可使用下述载体制备本发明的多肽，即得自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，得自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，得自植物的表达载体(例如pMH1，pMH2)，得自动物病毒的表达载体(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，得自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)，得自酵母的表达载体(例如“毕赤氏酵母表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)以及得自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)。
为了在动物细胞，如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 185322(1990))、CMV启动子等，优选还具有选择转化子所用的标记基因(例如用药物进行选择的药物抗性基因(如新霉素、G418))。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
另外，可使用一些方法在稳定表达基因的同时在细胞内扩增基因的拷贝数。例如，可将含有互补DHFR基因的载体(如pCHO I)导入核酸合成途径缺失的CHO细胞，然后通过氨甲蝶呤(MTX)进行扩增。另外，当瞬时表达基因时，可以使用这样一种方法，其中含有SV40复制起点的载体(pcD等)被转化至染色体上含有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞。
按上述方法获得的本发明多肽可分离自宿主细胞的内部或外部(如培养基)，并被纯化成基本上纯的均质多肽。本文所用的与给定多肽有关的术语“基本上纯”指的是多肽基本上不含其它生物大分子。基本上纯的多肽是指干重至少75％(如至少80，85，95或99％)纯。通过任何适当的标准方法皆可测定纯度，所述方法包括例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。分离和纯化多肽的方法不局限于任何特定的方法；实际上，可使用任何标准方法。
例如，可以适当选择柱层析、过滤、超滤、盐沉淀、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶，并将它们组合用于分离和纯化多肽。
层析的例子包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。通过液相层析，如HPLC和FPLC即可进行这些层析。因此，本发明提供了通过上述方法制备的高度纯化的多肽。
通过在纯化前或纯化后用适当的蛋白质修饰酶处理本发明的多肽，即可对其进行任意修饰或部分缺失。有用的蛋白质修饰酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
本发明提供了与本发明的多肽结合的抗体。本发明的抗体可以任何形式被使用，如单克隆或多克隆抗体，并且包括通过用本发明的多肽免疫动物，如兔获得的抗血清、所有类别的多克隆和单克隆抗体、人抗体和通过基因重组产生的人源化抗体。
可用作抗原以获得抗体的本发明多肽可得自任何动物，但优选得自哺乳动物，如人、小鼠或大鼠，更优选得自人。人源多肽可得自本文公开的核苷酸或氨基酸序列。
根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可含有例如本发明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。在本文中，抗体被定义为与本发明多肽的全长或片段反应的蛋白质。
可将编码本发明多肽或其片段的基因插入已知表达载体，然后按本文所述用所述载体转化宿主细胞。通过任何标准方法从宿主细胞的外部或内部回收所需多肽或其片段，随后将其用作抗原。或者，将表达多肽的完整细胞或其裂解物或化学合成的多肽用作抗原。
可用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与细胞融合所用亲代细胞的相容性。一般使用啮齿类、兔形目(Lagomorpha)或灵长类动物。啮齿类动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长类动物包括例如Catarrhini猴(old world猴)，如食蟹猴(Macaca fascicularis)，恒河猴(rhesus monkey)，sacred狒狒和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体地，可稀释抗原，将其悬浮于适当量的磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。必要时，可将抗原悬浮液与适当量的标准佐剂，如弗氏完全佐剂混合，制成乳剂，然后施用给哺乳动物。优选随后按照4至21天的间隔数次施用与适当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原。适当的载体也可用于免疫。按上文所述进行免疫之后，通过标准方法检查血清中所需抗体量的增加。
通过从经检查后确定血清中所需抗体量有所增加的经免疫哺乳动物体内收集血液，并通过使用任何常规方法从血液中分离出血清，即可制备抗本发明多肽的多克隆抗体。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，可以从血清中分离含有多克隆抗体的组分。可以使用例如与本发明多肽偶联的亲和柱获得仅识别本发明多肽的组分，并使用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化该组分，从而由所述组分制备免疫球蛋白G或M。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物体内收集免疫细胞，按上文所述检查血清中水平有所增加的所需抗体，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选得自脾脏。其它可与上述免疫细胞融合的优选亲代细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选为具有用药物选择融合细胞时所需的获得型特性的骨髓瘤细胞。
可根据已知方法，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein，MethodsEnzymol 733-46(1981))融合上述免疫细胞和骨髓瘤细胞。
通过在标准的选择培养基，如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养即可选择出通过细胞融合获得的杂交瘤。一般在HAT培养基中维持细胞培养物数天至数周，维持的时间应足以使除所需杂交瘤以外的所有其它细胞(非融合细胞)死亡。然后进行标准的有限稀释以筛选和克隆能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上文所述的用抗原免疫非人动物以制备杂交瘤的方法外，也可在体外用多肽、表达多肽的细胞或其裂解物免疫人淋巴细胞，例如被EB病毒感染的人淋巴细胞。然后，使经免疫的淋巴细胞与得自人的能够无限分裂的骨髓瘤细胞，如U266融合，从而产生能生成所需人抗体的杂交瘤，所述抗体能结合所述多肽(未审公开的日本专利申请(JP-A)Sho 63-17688)。
随后，将所得杂交瘤移植到小鼠腹腔中并抽取腹水。可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明多肽的亲和柱来纯化所获得的单克隆抗体。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的多肽，还可用作本发明多肽的候选激动剂和拮抗剂。另外，所述抗体还可用于与本发明多肽相关之疾病的抗体治疗。当给人体施用所得抗体时(抗体治疗)，优选人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，可以用选自多肽、表达多肽的细胞或其裂解物的抗原免疫携有人抗体基因的转基因动物。然后从动物体内收集产生抗体的细胞并与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤，从中可制备出抗所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，可通过癌基因无限增殖化能产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞，并将其用于制备单克隆抗体。
也可使用基因工程技术重组制备如此获得的单克隆抗体(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可从能产生抗体的免疫细胞，如杂交瘤或经免疫的淋巴细胞中克隆编码抗体的DNA，将其插入适当载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了按上文所述制备的重组抗体。
另外，本发明的抗体可以是抗体片段或经修饰的抗体，只要它们能结合本发明的一种或多种多肽即可。例如，抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中通过适当接头连接得自H和L链的Fv片段(Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 855879-5883(1988))。更具体地，通过用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体即可产生抗体片段。或者，可构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在适当宿主细胞中表达(参见例如Coet al.，J Immunol 1522968-2976(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol178476-496(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux et al.，Methods Enzymol 121663-669(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9132-137(1991))。
通过与多种分子，如聚乙二醇(PEG)偶联即可修饰抗体。本发明提供了这种经修饰的抗体。通过对抗体进行化学修饰即可获得经修饰的抗体。这些修饰方法是本领域的常规技术。
或者，本发明的抗体可以是得自非人抗体的可变区与得自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者是含有得自非人抗体的互补决定区(CDR)、得自人抗体的构架区(FR)和恒定区的人源化抗体。使用已知技术即可制备出所述抗体。
可将按上文所述获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当选择和组合使用柱层析，如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等可以分离抗体(AntibodiesA Laboratory Manual.EdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作亲和柱。可以使用的蛋白A柱的例子包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除亲和层析以外的层析例包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。可通过液相层析，如HPLC和FPLC进行层析过程。
例如，可以使用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光来测定本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在培养板上，将本发明的多肽上样于板上，然后上样含有所需抗体的样品，如产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化抗体样品。然后上样能识别第一抗体并被酶，如碱性磷酸酶标记的第二抗体，并保温培养板。接着，在洗涤之后，在培养板中加入酶底物，如对硝基苯磷酸，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可用作多肽。可使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的活性。
上述方法通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明多肽的样品，并检测或测定抗体和多肽形成的免疫复合物，可以检测或测定本发明的多肽。
由于检测或测定本发明多肽的方法可特异性检测或测定多肽，因此，所述方法可用于多种使用所述多肽的实验。
本发明还提供了含有至少15个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸能与编码人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO1，3，5或7)或其互补链杂交。优选本发明的多核苷酸是能与编码本发明多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。本文所用术语“特异性杂交”指的是在通常的杂交条件下，优选在严紧杂交条件下不与编码其它蛋白质的DNA发生显著交叉杂交。所述多核苷酸包括能与编码本发明多肽的DNA或其互补链特异性杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反义寡核苷酸和核酶)。另外，所述多核苷酸可用于制备DNA芯片。
本发明包括能与核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7内的任何位点杂交的反义寡核苷酸。优选所述反义寡核苷酸针对的是核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7中的至少15个连续核苷酸。甚至更优选上述反义寡核苷酸在上述至少15个连续核苷酸中含有起始密码子。更具体地，所述反义寡核苷酸包括含有SEQ ID NO16的核苷酸序列的反义寡核苷酸用于抑制WDRPUH表达；含有SEQ ID NO37的核苷酸序列的反义寡核苷酸用于抑制KRZFPUH的表达；含有SEQ ID NO44的核苷酸序列的反义寡核苷酸用于抑制PPIL1的表达；和含有SEQ ID NO89的核苷酸序列的反义寡核苷酸用于抑制APCDD1的表达。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物可用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基磷酸酯修饰，如甲基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型修饰，硫代磷酸酯修饰和氨基磷酸酯修饰。
本文所用术语“反义寡核苷酸”不仅意味着其中与构成DNA或mRNA特定区域的核苷酸相对应的核苷酸能够完全互补，还意味着其中可含有一个或多个核苷酸错配，只要DNA或mRNA和反义寡核苷酸能与核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7特异性杂交即可。
“至少15个连续核苷酸序列区域”中所包含的这种多核苷酸的同源性至少为70％或更高，优选为80％或更高，更优选为90％或更高，甚至更优选为95％或更高。可以使用本文提及的算法测定同源性。所述多核苷酸可用作探针以按照下文实施例所述分离或检测编码本发明的多肽，或用作扩增所用的引物。
本发明的反义寡核苷酸衍生物通过下述机制对产生本发明多肽的细胞发挥作用，即与编码多肽的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA降解并抑制本发明多肽的表达，从而导致多肽功能受抑制。
通过与对衍生物无活性的适当基质混合，可将本发明的反义寡核苷酸衍生物制成外用制剂，如涂抹剂(liniment)或泥罨敷剂(poultice)。
必要时，也可通过加入赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂等，将衍生物配制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。通过下述的一般方法即可制备所述制剂。
通过直接施用于病痛部位或注射至血管以使其到达病痛部位，将反义寡核苷酸衍生物施用给患者。也可使用反义寡核苷酸-固定介质增加持久性和膜-通透性。所述介质如脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂，或其衍生物。
可根据患者的身体状况适当调整本发明的反义寡核苷酸衍生物的剂量，并按所需的量使用所述剂量。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选为0.1至50mg/kg。
本发明还包括siRNA，其含有核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7的有义链核酸和反义链核酸组合。术语″siRNA″指的是能防止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括将DNA用作模板，由其转录RNA的技术。siRNA含有编码人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO1，3，5或7)的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA使得单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列，如发夹结构。
该方法被用于改变细胞中的基因表达，其中在所述细胞中，作为例如细胞恶性转化的结果，WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的表达被上调。siRNA与靶细胞中WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1转录物的结合导致细胞产生的蛋白质减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，并且可以与天然转录物一样长。优选寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。最优选寡核苷酸长度少于75，50或25个核苷酸。能抑制其在哺乳动物细胞中的表达的WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1 siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO93-103中的任一个的寡核苷酸。这些序列分别是下述siRNA序列的靶序列。
SEQ ID NO93，SEQ ID NO24和25(WDRPUH)；SEQ ID NO94，SEQ ID NO26和27(WDRPUH)；SEQ ID NO95，SEQ ID NO28和29(WDRPUH)；SEQ ID NO96，SEQ ID NO30和31(WDRPUH)；SEQ ID NO97，SEQ ID NO104和105(KRZFPUH)；SEQ ID NO98，SEQ ID NO106和107(KRZFPUH)；SEQ ID NO99，SEQ ID NO108和109(KRZFPUH)；SEQ ID NO100，SEQ ID NO110和111(KRZFPUH)；
SEQ ID NO101，SEQ ID NO47和48(PPIL1)；SEQ ID NO102，SEQ ID NO49和50(PPIL1)；和SEQ ID NO103，SEQ ID NO51和52(PPIL1)。
使用可得自Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的siRNA设计计算机程序设计siRNA的核苷酸序列。计算机程序基于下述方案选择siRNA合成所用的核苷酸序列。
选择siRNA靶位点1.自目标转录物的AUG起始密码子开始，扫描下游的AA二核苷酸序列。记录每个AA和3′方向邻接的19个核苷酸的出现，以作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等推荐针对5′和3′非翻译区(UTR)和起始密码子附近的区域(75个碱基以内)设计siRNA，因为所述区域中的调节蛋白结合位点较多。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。
2.将潜在的靶位点与人基因组数据库进行比较，无需考虑任何与其它编码序列具有显著同源性的靶序列。可使用能在NCBI服务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中找到的BLAST进行同源性检索。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion网站，优选沿着需评价之基因的长度选择几个靶序列。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA能抑制本发明多肽的表达，从而可用于抑制本发明多肽的生物活性。含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达-抑制剂也可用于抑制本发明多肽的生物活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症。
另外，本发明提供了使用本发明多肽的表达水平作为诊断标记以诊断细胞增殖性疾病的方法。
该诊断方法包括步骤(a)检测本发明的WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平；和(b)将表达水平的升高与细胞增殖性疾病，如癌症相关联。
通过定量与WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因相对应的mRNA或由所述基因编码的蛋白质，即可估计特定样品中WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平。本领域技术人员已知定量mRNA的方法。例如，通过Northern印迹或RT-PCR即可估计出与WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因相对应的mRNA的水平。由于WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的全长核苷酸序列示于SEQ ID NO1，3，5或7，本领域的任何技术人员都可设计探针或引物的核苷酸序列以定量WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因。
也可基于基因所编码蛋白质的活性或量来分析WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平。下文将描述测定WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白量的方法。例如，免疫测定法可用于测定生物材料中的蛋白质。任何生物材料都可用于测定蛋白质或其活性。例如，可分析血样以估计由血清标记编码的蛋白质。另一方面，可选择适当方法，以根据每种待分析蛋白质的活性测定WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因所编码蛋白质的活性。
估计样品(检测样品)中WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平，并与正常样品中的表达水平相比较。当比较结果表明靶基因的表达水平高于正常样品中的表达水平时，可以判断受试者患有细胞增殖性疾病。可同时测定得自正常样品和受试者的样本中的WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因的表达水平。或者，以分析先前从对照组收集的样品中的基因表达水平所得的结果为基础，通过统计学方法测定表达水平的正常范围。通过将受试者的样品与正常范围相比较得出结果；当结果未落入正常范围时，可判断受试者患有细胞增殖性疾病。在本发明中，被诊断的细胞增殖性疾病优选为癌症。更优选地，当估计出WDRPUH或KRZFPUH基因的表达水平并与正常样品中的表达水平相比较时，诊断出的细胞增殖性疾病是肝细胞癌；而当估计出PPIL1或APCDD1基因的表达水平时，诊断出的疾病是结肠癌。另外，当估计出KRZFPUH基因的表达水平并与正常样品中的表达水平相比较时，诊断出的细胞增殖性疾病除了可以是肝细胞癌外，还可以是胃癌或肺癌。
在本发明中，还提供了诊断细胞增殖性疾病所用的诊断试剂，所述疾病如癌症，包括肝细胞癌和结肠癌。本发明的诊断试剂含有与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸或与本发明多肽结合的抗体可用作所述化合物。
另外，本发明还提供了使用本发明的多肽筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法。所述筛选方法的实施方案包括步骤(a)使受试化合物与本发明的多肽接触，(b)检测本发明多肽与受试化合物之间的结合活性，和(c)选择与本发明多肽结合的化合物。
用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或得自天然的蛋白质，或其部分肽。可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。与受试化合物接触的本发明多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
至于使用本发明的多肽筛选蛋白质，例如与本发明多肽结合的蛋白质的方法，可以使用多种本领域技术人员众所周知的方法。通过例如免疫沉淀法，特别是按照下述方式即可进行所述筛选。通过将基因插入外源基因的表达载体，如pSV2neo，pcDNAI和pCD8，在动物细胞等中表达编码本发明多肽的基因。用于表达的启动子可以是任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))、EF-1α启动子(Kim et al.，Gene 91217-223(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108193-200(1991))、RSVLTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))、SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8466(1988))、CMV即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 843365-3369(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1385-394(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9946(1989))、HSV TK启动子等。可根据任何方法将基因导入动物细胞以表达外源基因，所述方法如电穿孔法(Chu etal.，Nucleic Acids Res 151311-1326(1987))、磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 72745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata et al.，NucleicAcids Res 125707-5717(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 4642-1643(1985))、脂质转染法(Derijard，B Cell 71025-1037(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 522-30(1993)Rabindran et al.，Science 259230-234(1993))等。通过在本发明多肽的N-或C-末端导入特异性已被揭示的单克隆抗体表位，可将本发明的多肽表达成含有单克隆抗体识别位点(表位)的融合蛋白。可以使用商购的表位-抗体系统(Experimental Medicine 1385-90(1995))。利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体可以商购。
本文还报道了通过仅导入由几个至十几个氨基酸组成的小表位而制备的融合蛋白，以致于融合不会改变本发明多肽的特性。诸如聚组氨酸(His-标记)、流感病毒聚集体HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标记)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标记)、E-标记(单克隆噬菌体上的表位)等的表位和识别它们的单克隆抗体可用作表位-抗体系统，用于筛选与本发明多肽结合的蛋白质(ExperimentalMedicine 1385-90(1995))。
在免疫沉淀中，通过在使用适当去污剂制备的细胞裂解物中加入这些抗体以形成免疫复合物。免疫复合物由本发明的多肽、能与所述多肽结合的多肽和抗体组成。除了使用抗上述表位的抗体外，还可使用可按上文所述制备的抗本发明多肽的抗体进行免疫沉淀。
当抗体是小鼠IgG抗体时，可通过例如蛋白A Sepharose凝胶或蛋白GSepharose凝胶沉淀免疫复合物。如果本发明的多肽被制备成与表位，如GST的融合蛋白，可按照与使用抗本发明多肽的抗体相同的方式，使用与这些表位特异性结合的物质，如谷胱甘肽-Sepharose 4B形成免疫复合物。
可根据或按照例如文献中所述的方法(Harlow and Lane，Antibodies，511-552，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))进行免疫沉淀。
SDS-PAGE常用于分析被免疫沉淀的蛋白质，使用具有适当浓度的凝胶，通过蛋白质的分子量可分析结合的蛋白质。由于通过普通的染色法，如考马斯染色或银染难以检测与本发明多肽结合的蛋白质，通过在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质并检测蛋白质即可改善蛋白质的检测敏感性。当已揭示出蛋白质的分子量时，可直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中纯化靶蛋白质并测定其序列。
至于使用本发明多肽筛选与所述多肽结合的蛋白质的方法，可以使用例如West-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 6583-90(1991))。具体地说，可通过下述步骤获得与本发明多肽结合的蛋白质使用噬菌体载体(如ZAP)，由有望表达与本发明多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(例如，筛选与WDRPUH结合的蛋白质时，所述组织如睾丸；筛选与KRZFPUH结合的蛋白质时，所述组织为胎盘或睾丸；筛选与PPIL1结合的蛋白质时，所述组织为心脏、骨骼肌、睾丸、甲状腺或肾上腺；筛选与APCDD1结合的蛋白质时，所述组织为心脏、胰腺、前列腺、卵巢、肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺、结肠或外周白细胞)或经培养细胞制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白质，将表达的蛋白质固定于滤膜上，使经纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应，以及根据标记检测表达与本发明多肽结合的蛋白质的噬斑。利用生物素和亲和素之间的结合，或利用与本发明多肽特异性结合的抗体，或与本发明多肽融合的肽或多肽(如GST)，可以标记本发明的多肽。也可利用使用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双-杂合系统(“MATCHMAKER双-杂合系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双-杂合试验试剂盒”，“MATCHMAKER单-杂合系统”(Clontech)；“HybriZAP双-杂合载体系统”(Stratagene)；参见文献“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-292(1994)”)。
在双-杂合系统中，本发明的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。cDNA文库制备自有望表达与本发明多肽结合的蛋白质的细胞，使得所述文库表达时能与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测到的阳性克隆中分离得自文库的cDNA(当在酵母细胞中表达与本发明多肽结合的蛋白质时，两者的结合激活了报道基因，使得阳性克隆能被检测到)。通过将上文分离到的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质即可制备由cDNA编码的蛋白质。
至于报道基因，除了用S3基因外，还可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
也可使用亲和层析筛选与本发明多肽结合的化合物。例如，可将本发明的多肽固定在亲和柱的载体上，将含有能与本发明多肽结合的蛋白质的受试化合物上样于亲和柱。本文中的受试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。上样受试化合物之后，洗涤柱，即可制备与本发明多肽结合的化合物。
当受试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白质的氨基酸序列，基于所述序列合成寡DNA，使用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库以获得编码蛋白质的DNA。
在本发明中，使用表面胞质基因组共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合化合物的仪器。当使用所述生物传感器时，仅使用极少量的多肽并且无需标记，即可实时观察到表现为表面胞质基因组共振信号的本发明多肽和受试化合物之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器，如BIAcore评价本发明多肽和受试化合物之间的结合。
当固定化的本发明多肽暴露于合成化合物，或天然物质库，或随机噬菌体肽展示文库时筛选结合分子的方法，以及基于组合化学技术(Wrightonet al.，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))进行高通量筛选从而不仅分离出蛋白质，还分离出与本发明蛋白质结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法是本领域技术人员众所周知的。
通过筛选分离出的化合物是能促进或抑制本发明多肽活性的候选药物，可用于治疗或预防例如细胞增殖性疾病所导致的疾病，如癌症。通过本发明的筛选方法获得的化合物包括这样一种化合物，其中通过本发明的筛选方法获得的、具有与本发明多肽结合之活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选候选药剂的方法，所述药剂是治疗细胞增殖性疾病的潜在靶。如上文所详细讨论的，通过控制WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的表达水平，就可以控制癌症的发生和发展。因此，通过利用WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的表达水平和活性作为指标进行筛选，即可鉴定出身为治疗细胞增殖性疾病的潜在靶的候选药剂。在本发明的上下文中，所述筛选包括例如下述步骤a)使候选化合物与表达WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的细胞接触；和b)选择与缺乏所述化合物时检测到的表达水平相比，能降低WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1表达水平的化合物。
表达WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1中的至少一种的细胞包括例如由HCC或结肠癌建立的细胞系；所述细胞可用于本发明的上述筛选。通过本领域技术人员众所周知的方法即可估计出表达水平。在筛选方法中，可将能降低WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1中的至少一种的表达水平的化合物选择为候选药剂。
在本发明的另一个筛选治疗细胞增殖性疾病所用化合物的方法的实施方案中，所述方法利用本发明多肽的生物活性作为指标。由于本发明的WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白具有促进细胞增殖的活性，使用此活性作为指标可以筛选出能促进或抑制本发明蛋白质之一的此活性的化合物。该筛选方法包括步骤(a)使受试化合物与本发明的多肽接触；(b)检测步骤(a)中多肽的生物活性；和(c)选择与缺乏受试化合物时检测到的生物活性相比，能抑制多肽生物活性的化合物。
任何多肽都可用于筛选，只要它们具有WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的生物活性即可。所述生物活性包括人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白的细胞-增殖活性，PPIL1与SNW1或驿蛋白结合的活性。例如，可使用人WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白，也可使用与这些蛋白质功能等同的多肽。所述多肽可由细胞内源或外源性地表达。
可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物或天然化合物。
通过所述筛选分离出的化合物是本发明多肽的候选激动剂或拮抗剂。术语“激动剂”指的是通过与本发明多肽结合而激活所述多肽功能的分子。类似地，术语“拮抗剂”指的是通过与本发明多肽结合而抑制所述多肽功能的分子。另外，通过所述筛选分离出的化合物是能抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白质)的体内相互作用的候选化合物。
当本发明方法欲检测的生物活性是细胞增殖时，通过例如制备能表达本发明多肽的细胞，在受试化合物的存在下培养细胞，并按实施例中所述测定细胞增殖的速度，测定细胞周期，以及测定集落形成活性即可检测到所述活性。
通过上述筛选分离出的化合物是能抑制本发明多肽之活性的候选药物，并可用于治疗与本发明多肽相关的疾病，如包括癌症的细胞增殖性疾病。更具体地，当将WDRPUH或KRZFPUH蛋白的生物活性用作指标时，通过本发明的方法筛选的化合物用作治疗肝细胞癌的候选药物。另外，当将KRZFPUH蛋白的生物活性用作指标时，除了HCC外，通过本发明的方法筛选的化合物还可用作治疗胃癌或肺癌的候选药物。另一方面，当将PPIL1或APCDD1蛋白的生物活性用作指标时，通过本发明的方法筛选的化合物还可用作治疗结直肠癌的候选药物。
另外，通过本发明的筛选方法可以获得的化合物还包括这样一种化合物，其中能抑制WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白之活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
或者，本发明的筛选方法可包括下述步骤a)使候选化合物与已导入载体的细胞接触，所述载体含有一个或多个标记基因的转录调节区和在转录调节区控制之下表达的报道基因，其中一个或多个标记基因选自WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1，b)测定所述报道基因的活性；和c)选择与对照相比能降低所述报道基因的表达水平的化合物。
适当的报道基因和宿主细胞是本领域众所周知的。通过使用标记基因的转录调节区可以制备筛选所需的报道构建体。当标记基因的转录调节区已为本领域技术人员所知时，使用先前已知的序列信息即可制备报道构建体。当仍未鉴定出标记基因的转录调节区时，可基于标记基因的核苷酸序列信息，从基因组文库中分离出含有转录调节区的核苷酸区段。
另外，在本发明的另一个筛选治疗细胞增殖性疾病所用化合物的方法的实施方案中，所述方法利用APCDD1的启动子区域。根据本发明，发现β-连环蛋白/Tcf4复合物与APCDD1基因转录调节区中的两个Tcf/LEF结合基元结合，并参与转录激活APCDD1。因此，将能抑制APCDD1的转录激活的化合物用作抑制本发明APCDD1多肽之活性的候选药物，并用于治疗与所述多肽有关的疾病，例如细胞增殖性疾病，如癌症，尤其是结直肠癌。
所述筛选方法包括步骤(a)构建在报道基因上游含有APCDD1的两个Tcf/LEF结合基元的载体；(b)用步骤(a)的载体转化细胞；(c)使受试化合物和β-连环蛋白/Tcf-4复合物与步骤(b)的细胞接触；(d)检测报道基因的表达；和(e)选择与缺乏受试化合物时相比，能抑制报道基因表达的化合物。
可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。
例如，可根据实施例28所述的方法进行筛选。例如，通过将APCDD1的启动子区域插入含有报道基因的表达载体，即可构建在报道基因上游含有APCDD1的两个Tcf/LEF结合基元的载体。可使用人APCDD1基因的5’区域(SEQ ID NO7)作为探针，从基因组文库中获得APCDD1的启动子区域。可以如实施例28所述制备β-连环蛋白和Tcf-4。
任何报道基因都可用于筛选，只要能检测到所述基因的表达即可。报道基因的例子包括β-gal基因、CAT基因和萤光素酶基因。可根据报道基因的类型来检测报道基因的表达。尽管对导入载体的细胞没有特别的限制，但优选的例子包括HeLa细胞。
通过筛选分离出的化合物是能抑制本发明APCDD1蛋白之表达的候选药物，并可用于治疗与APCDD1蛋白相关的疾病，例如细胞增殖性疾病，如癌症，更具体地为结肠癌。另外，通过本发明的筛选方法可以获得的化合物还包括这样一种化合物，其中能通过β-连环蛋白/Tcf-4复合物抑制APCDD1蛋白之转录激活的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
在本发明的另一个筛选治疗细胞增殖性疾病所用化合物的方法的实施方案中，所述方法利用PPIL1与SNW1(SKI相互作用蛋白)或驿蛋白的结合能力。已发现本发明的PPIL1蛋白能与参与维生素D受体转录活性的蛋白质SNW1(SKI相互作用蛋白)和参与细胞周期进程的胞质磷蛋白驿蛋白结合。这些发现表明本发明的PPIL1蛋白通过与诸如SNW1和驿蛋白的分子结合而发挥细胞增殖功能。因此，抑制PPIL1蛋白与SNW1或驿蛋白之间的结合有望导致细胞增殖受抑制，能抑制结合的化合物可用作治疗细胞增殖性疾病，如癌症的药物。通过本发明的方法筛选的化合物所治疗的细胞增殖性疾病优选为结肠癌。
该筛选方法包括步骤(a)在受试化合物的存在下使本发明的多肽与驿蛋白或SNW1接触；(b)检测多肽与驿蛋白或SNW1之间的结合；和(c)选择能抑制多肽与驿蛋白或SNW1之间的结合的化合物。
用于筛选的本发明的PPIL1多肽以及SNW1或驿蛋白可以是重组多肽或天然来源的蛋白质，或者也可以是它们的部分肽，只要能保留彼此之间的结合能力即可。用于筛选的PPIL1多肽、SNW1或驿蛋白可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。
至于筛选能抑制PPIL1蛋白与SNW1或驿蛋白结合的化合物的方法，可使用多种本领域技术人员众所周知的方法。可在体外检测系统，如细胞系统中进行筛选。更具体地，首先使PPIL1多肽，或者SNW1或驿蛋白与支持物结合，再在支持物上添加另一种蛋白质以及受试样品。接着保温混合物，洗涤，检测和/或测定与支持物结合的另一种蛋白质。
可用于结合蛋白质的支持物包括例如不溶性的多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；和合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选使用由上述材料制备的可商购的珠和板(如多孔板，生物传感器芯片等)。当使用珠时，可将其填充于柱中。
可根据常规方法，如化学键合和物理吸附使蛋白质与支持物结合。或者，可经由特异性识别蛋白质的抗体使蛋白质与支持物结合。另外，也可以利用亲和素和生物素结合使蛋白质与支持物结合。
在例如，但不限于磷酸缓冲液和Tris缓冲液的缓冲液中进行蛋白质之间的结合，只要缓冲液不会抑制蛋白质之间的结合即可。
在本发明中，使用表面胞质基因组共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合蛋白质的仪器。当使用所述生物传感器时，仅使用极少量的多肽并且无需标记，即可实时观察到表现为表面胞质基因组共振信号的蛋白质之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器，如BIAcore评价PPIL1多肽与SNW1或驿蛋白之间的结合。
或者，可标记PPIL1多肽，或SNW1或驿蛋白，结合蛋白质的标记可用于检测或测定结合蛋白质。具体地，预标记一种蛋白质之后，在受试化合物的存在下使标记的蛋白质与另一种蛋白质接触，洗涤后根据标记检测或测定结合蛋白质。
在本发明的方法中，可使用标记物质，如放射性同位素(如3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)和生物素/亲和素标记蛋白质。当用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液体闪烁进行检测或测定。或者，通过加入酶底物，用吸光计检测底物的酶促变化，如颜色的产生，即可检测或测定用酶标记的蛋白质。另外，当将荧光物质用作标记时，可使用荧光光度计检测或测定结合蛋白质。
另外，使用抗PPIL1多肽和SNW1或驿蛋白的抗体也可检测或测定PPIL1多肽与SNW1或驿蛋白的结合。例如，使固定于支持物上的PPIL1多肽与受试化合物和SNW1或驿蛋白接触之后，保温混合物并洗涤，使用抗SNW1或驿蛋白的抗体进行检测或测定。或者，将SNW1或驿蛋白固定于支持物上，将抗PPIL1的抗体用作抗体。
当在本发明的筛选方法中使用抗体时，优选用上述的一种标记物质标记抗体，并基于标记物质检测或测定抗体。或者，将抗PPIL1多肽、SNW1或驿蛋白的抗体用作第一抗体，用经标记物质标记的第二抗体可以检测出所述第一抗体。另外，使用蛋白G或蛋白A柱可以检测或测定在本发明的筛选方法中与蛋白质结合的抗体。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双-杂合系统(“MATCHMAKER双-杂合系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双-杂合试验试剂盒”，“MATCHMAKER单-杂合系统”(Clontech)；“HybriZAP双-杂合载体系统”(Stratagene)；参见文献“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10286-292(1994)”)。
在双-杂合系统中，本发明的PPIL1多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。与本发明的PPIL1多肽结合的SNW1或驿蛋白与VP16或GAL4转录激活区融合，并能在受试化合物的存在下在酵母细胞中表达。当受试化合物不能抑制PPIL1多肽与SNW1或驿蛋白之间的结合时，两者的结合会激活报道基因，使得阳性克隆能被检测到。
至于报道基因，除了HIS3基因外，还可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
通过筛选分离出的化合物是能抑制本发明PPIL1蛋白之活性的候选药物，并可用于治疗与PPIL1蛋白相关的疾病，例如细胞增殖性疾病，如癌症，更具体地为结肠癌。另外，通过本发明的筛选方法可以获得的化合物还包括这样一种化合物，其中能抑制PPIL1蛋白与SNW1或驿蛋白之间的结合的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
当将通过本发明的方法分离出的化合物作为药物施用于人和其它哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治疗细胞增殖性疾病(如癌症)时，可直接施用分离的化合物，或使用已知的药物制备方法将其配制成剂量形式。例如，根据需要，可以糖衣片剂、胶囊、酏剂和微囊剂型口服药物，或者以溶于水或任何其它药物可接受液体的无菌溶液或悬浮液注射剂形式非口服给药。例如，可以常规药物实践所需的单位剂量形式将化合物与药学可接受载体或介质混合，所述载体或介质具体地为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、增味剂、赋形剂、载体、防腐剂、结合剂等。这些制品中活性成分的量能提供所示范围内的适当剂量。
可与片剂和胶囊混合的添加剂的例子有如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶的结合剂；如晶体纤维素的赋形剂；如玉米淀粉、明胶和藻酸的膨胀剂；如硬脂酸镁的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂；如胡椒薄荷、Gaultheria adenothrix油和樱桃的增味剂。当单位剂量形式是胶囊时，上述成分中还可包括液体载体，如油。可使用注射用载体，如蒸馏水，根据常规药物实践配制注射用的无菌混合物。
生理盐水、葡萄糖和其它包括助剂的等渗液体，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠可用作注射用的水溶液。它们可与适当的增溶剂，如醇，特别是乙醇；聚醇，如丙二醇和聚乙二醇；非离子型表面活性剂，如Polysorbate 80(TM)和HCO-50一起使用。
芝麻油或豆油可用作油质液体，并可与苯甲酸苄酯或苄醇一起用作增溶剂，并可与如磷酸缓冲液和醋酸钠缓冲液的缓冲液；如盐酸普鲁卡因的止痛剂；如苄醇、酚的稳定剂；和抗氧化剂一起配制。可将制备好的注射液注入适当的安瓿中。
可使用本领域技术人员众所周知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如以动脉内、静脉内、经皮注射给药和鼻内、经支气管、肌内或口服给药。给药剂量和方法随患者体重和年龄的变化而改变；然而，本领域技术人员可常规选择给药剂量和方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将DNA插入基因治疗载体，施用所述载体以进行治疗。给药剂量和方法随患者体重、年龄和症状的变化而改变；但本领域技术人员可适当选择给药剂量和方法。
例如，当给正常成人(体重为60kg)口服给药时，尽管根据症状的不同有一些差异，但与本发明多肽结合并调节其活性的化合物剂量约为0.1mg至100mg/天，优选约为1.0mg至50mg/天，更优选约为1.0mg至20mg/天。
当以注射液形式给正常成人(体重为60kg)非肠道给药时，尽管根据患者、靶器官、症状和给药方法的不同有一些差异，但合适的静脉内注射剂量约为0.01mg至30mg/天，优选约为0.1至20mg/天，更优选约为0.1至10mg/天。当给其它动物给药时，可以施用被转换成60kg体重的量。
另外，本发明提供了使用抗本发明多肽的抗体治疗或预防细胞增殖性疾病，如癌症的方法。根据此方法，需施用药物有效量的抗本发明多肽的抗体。由于WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1和APCDD1蛋白的表达在癌细胞中被上调，因此抑制这些蛋白质的表达可导致细胞增殖活性降低，通过抗体与这些蛋白质的结合有望治疗或预防细胞增殖性疾病。因此，以足以降低本发明蛋白质活性的剂量施用抗本发明多肽的抗体，所述剂量范围是0.1至约250mg/kg/天。成人的剂量范围一般约为5mg至17.5g/天，优选约为5mg至10g/天，最优选约为100mg至3g/天。或者，将与特异于肿瘤细胞的细胞表面标记结合的抗体用作药物传递的工具。例如，以足以损伤肿瘤细胞的剂量施用带有细胞毒性剂的抗体。
本发明还涉及诱导抗-肿瘤免疫力的方法，所述方法包括施用WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白或其免疫活性片段，或编码任一种蛋白质及其片段的核酸的步骤。WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白或其免疫活性片段可用作抗细胞增殖性疾病的疫苗。在本发明中，抗细胞增殖性疾病的疫苗指的是当接种于动物时，具有诱导抗-肿瘤免疫力作用的物质。一般说来，抗-肿瘤免疫力包括如下所述的免疫应答-诱导抗肿瘤的细胞毒淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导产生抗-肿瘤的细胞因子。
因此，当将某种蛋白质接种于动物可诱导任一种免疫应答时，就可以说该蛋白质具有诱导抗-肿瘤免疫力的作用。通过观察宿主免疫系统在体内或体外针对蛋白质的反应，即可检测出蛋白质诱导的抗-肿瘤免疫力。
例如，检测细胞毒T淋巴细胞诱导的方法是众所周知的。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递至T细胞和B细胞。以抗原特异性方式对APC呈递的抗原作出反应的T细胞因受抗原的刺激而分化成细胞毒T细胞(或细胞毒T淋巴细胞；CTL)，然后进行增殖(也称作T细胞激活)。因此，通过用APC将某种肽呈递至T细胞，并检测CTL的诱导即可评价肽导致的CTL诱导。另外，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞对抗-肿瘤免疫力也很重要，因此，使用这些细胞的激活作用作为标志，即可评价肽的抗-肿瘤免疫力诱导作用。
例如，评价以树状细胞(DC)作为APC的CTL诱导作用的方法是众所周知的。DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在此方法中，起初使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。与DC接触后检测到具有针对感兴趣细胞的细胞毒作用的T细胞，这表明受试多肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。例如，使用51Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为标志，可以检测抗肿瘤的CTL活性。或者，使用3H-胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为标志评价肿瘤细胞损害程度的方法也是众所周知的。
APC不限于DC，也可使用外周血单核细胞(PBMC)。在这种情况下，有报道表明在GM-CSF和IL-4的存在下培养PBMC可以增强CTL诱导。类似地，已证实在匙孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7的存在下培养PBMC可以诱导CTL。
经这些方法证实具有CTL诱导活性的受试多肽是具有DC激活作用继而具有CTL诱导活性的多肽。因此，能诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤疫苗。另外，通过与多肽接触获得诱导抗肿瘤CTL的能力的APC可用作抗肿瘤疫苗。另外，因APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤疫苗。使用APC和CTL所导致的抗-肿瘤免疫力的肿瘤治疗方法被称为细胞免疫治疗。
通常，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，已知混合多种具有不同结构的多肽并将它们与DC接触可以增加CTL-诱导的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段较为有利。
或者，通过观察对抗肿瘤抗体产生的诱导可以进一步证实多肽对抗-肿瘤免疫力的诱导。例如，当在用多肽免疫的实验室动物中诱导出抗多肽的抗体时，以及在肿瘤细胞的生长受所述抗体抑制时，多肽能够诱导抗-肿瘤免疫力。
通过施用本发明的疫苗可诱导抗-肿瘤免疫力，所述免疫力可治疗和预防HCC或结肠癌。抗癌疗法或预防癌症发生的作用可以是下述步骤中的任何一种，如抗癌细胞生长的抑制活性、癌症的退化和对癌症发生的抑制作用。也可以是患癌个体死亡率的降低、血液中肿瘤标记的减少、与癌症相伴随的可测症状的减轻等。优选所述作用在统计学上是显著的，例如，与未施用疫苗的对照相比，优选在5％或更低的显著性水平上观察到抗癌症的治疗效果或抗癌症发生的预防作用。例如，Student’s t-试验、Mann-Whitney U-试验或ANOVA可用于统计学分析。
上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂混合。佐剂指的是当与具有免疫活性的蛋白质一起(或相继)施用时能增强抗蛋白质的免疫应答的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等，但并不局限于此。另外，本发明的疫苗可与药物可接受载体适当混合。所述载体的例子是无菌水、生理盐水、磷酸缓冲液、培养液等。另外，必要时疫苗还可含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。可全身或局部施用疫苗。可通过单次给药施用疫苗，或通过多次给药加强免疫。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可通过例如来自体内的方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，使来自体内的细胞与多肽接触，诱导APC或CTL之后，可给受试者施用细胞。也可通过在来自体内的PBMC中导入编码多肽的载体来诱导APC。在给药前可克隆在体外诱导的APC或CTL。通过克隆和培养具有较高靶细胞损害活性的细胞，可更有效地进行细胞免疫治疗。另外，按此方式分离的APC和CTL不仅可用于针对细胞所来源的个体的细胞免疫治疗，还可用于针对来自其它个体的相似类型肿瘤的细胞免疫治疗。
另外，本发明提供了用于治疗或预防细胞增殖性疾病，如癌症的药物组合物，其含有药物有效量的本发明多肽。药物组合物可用于产生抗肿瘤免疫力。WDRPUH和KRZFPUH的正常表达分别局限于睾丸以及胎盘和睾丸，因此，抑制这些基因不会对其它器官有不利影响。因此，优选使用WDRPUH和KRZFPUH多肽治疗细胞增殖性疾病，特别是HCC。
提供下述实施例是为了阐明本发明，并帮助本领域技术人员制备和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的意思相同。尽管在本发明的实践或检验中可使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但下文描述了适当的方法和材料。本文提及的任何专利、专利申请和出版物都列入本文作为参考。
实施本发明的最佳模式通过下述实施例详细阐明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1鉴定两个常在HCC中被上调的新基因WDRPUH和KRZFDUH使用含有23040个基因的来自机构内部的全基因组cDNA微阵列，将20个HCC的表达分布图与相应的非-癌肝组织的表达分布图进行比较。更具体地，在已接受外科手术的患者知情同意的情况下，从其手术样品中获得HCC组织和相应的非-癌组织。根据厂商提供的方案，使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)从微量解剖组织中提取总RNA。用DNase I处理提取的总RNA，用Ampliscribe T7转录试剂盒(Epicentre Technologies)进行扩增，并在逆转录过程中使用Cy-染料(Amersham)进行标记。分别使用Cy5和Cy3标记得自非-癌组织和肿瘤的RNA。然后，根据Ono等的方法(Cancer Res 605007-11(2000))进行杂交、洗涤和检测。使用Array Vision软件(Amersham Pharmacia)测定每个靶点Cy5和Cy3的荧光强度。测定双份数值，从在每个靶点检测到的荧光强度中减去背景信号之后，计算平均值。然后，将在载玻片上检测到的所有荧光强度归一化以调整每个载玻片上52个持家基因的平均Cy5和Cy3强度。从进一步的研究中排除Cy3和Cy5的荧光强度皆低于25000个单位的基因，选择Cy3/Cy5信号比率＞2.0的基因进行进一步评价。
通常在HCC中被上调的基因中，对应于UniGene簇的EST(Hs.122614)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、机构内部登录号为D3197的基因在12个HCC的11个中过表达，所述过表达是与相应的非-癌肝组织相比而言的(图1a)。该基因含有编码具有WD40重复的蛋白质的开放阅读框，因此被称为WDRPUH(在HCC中被上调的WD40重复蛋白)。WDRPUH也在两例胃癌的一例中被上调。另外，还检测到机构内部登录号为C6242(EST Hs.58461)的基因，与相应的非-癌肝组织相比，所述基因在14个HCC的11个中被显著上调(图1b)，基于其编码蛋白质含有锌指基元，将其称为KRZFPUH(在HCC中被上调的Krupple-型锌指蛋白)。KRZFPUH也在所有被检测的胃癌病例(2例)和36个肺癌病例中的2例中被上调。
随后，进行半定量RT-PCR以进一步证实另外10个HCC病例中WDRPUH和KRZFPUH表达的提高(图1c和d)。具体地说，根据厂商提供的方案，使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用聚dT12-18引物(Amersham Pharmacia Biotech)与Superscript II逆转录酶(Life Technologies)，将10微克总RNA等分试样逆转录成cDNA。将所得单链cDNA制品稀释于20μl PCR缓冲液(TaKaRa)中。然后使用下述引物，通过标准RT-PCR实验进行PCR扩增WDRPUH正向引物5’-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3’[SEQ ID NO9]和反向引物5’-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3’[SEQ ID NO10]；和KRZFPUH正向引物5’-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3’[SEQ IDNO11]和反向引物5’-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3’[SEQ IDNO12]。
在下述条件下使用GeneAmp PCR 9700系统(Perkin-Elmer)进行扩增94℃变性4分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒和72℃ 45秒共35轮循环。
实施例2表达、分离和鉴定新的人基因WDRPUH接着，使用WDRPUH的PCR产物作为探针进行多-组织Northern印迹分析。更具体地，使人多-组织印迹(Clontech)与经32P-标记的WDRPUH PCR产物杂交。根据厂商的推荐进行预-杂交、杂交和洗涤。于-80℃用增感屏对印迹进行放射自显影24至72小时。结果，在睾丸中检测到2-kb转录物的大量表达(图2a)。由于D3197小于在Northern印迹上检测到的WDRPUHcDNA，随后，发明人研究了WDRPUH cDNA的5’序列。首先，使用BLAST程序在基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中检索对应于D3197的基因组序列，以寻找定位于染色体带17p13的粘粒序列(GenBank登录号AC026855)。使用GENSCAN、Gene Recognition和Assembly Internet Link程序推测基因组序列的候选外显子序列，连接推测的外显子序列。然后，按下述进行cDNA末端的5’快速扩增(5’-RACE)根据厂商说明，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)进行5’RACE。使用基因-特异性反向引物5’-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3’[SEQ ID NO13]和试剂盒提供的AP-1引物制备WDRPUH的5’部分。由人睾丸mRNA(Clontech)合成cDNA模板，使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆扩增产物，用ABI PRISM 3700 DNA测序仪(Applied Biosystems)测定其序列。测定的装配序列由2152个核苷酸组成，其中含有1860个核苷酸长的开放阅读框，其编码620个氨基酸残基的蛋白质(GenBank登录号AB065281)。用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)检索蛋白质基元，结果表明推测的蛋白质中有11个WD40重复结构域(图2b)。测定的WDRPUH核苷酸序列及其推测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO1和2。
实施例3WDRPUH的亚细胞定位使用基因特异性引物套5’-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3’[SEQ ID NO14]和5’-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3’[SEQ ID NO15]扩增对应于WDRPUH的完整编码区，并克隆至pcDNA3.1myc/His载体(Invitrogen)。然后，将构建的载体pcDNA 3.1myc/His-WDRPUH瞬时转染至SNU475细胞(韩国细胞系库)，在RPMI1640中培养细胞。在含有4％低聚甲醛的PBS中固定细胞15分钟，然后于室温(RT)下用含有0.1％ Triton X-100的PBS透化2.5分钟。随后，于4℃用含2％ BSA的PBS覆盖细胞24小时以阻断非特异性杂交。将1∶1000稀释的小鼠抗-myc单克隆抗体(Sigma)用作免疫细胞化学染色所用的第一抗体，在同与罗丹明-偶联的抗-小鼠第二抗体(Leinco和ICN)保温之后观察反应。用4’，6’-二脒-2’-苯基吲哚二盐酸化物(DAPI)复染细胞核。在ECLIPSE E800显微镜下获得荧光图像。结果显示出细胞的胞质中存在经标记的WDRPUH蛋白(图3)。
实施例4WDRPUH对细胞生长的作用为了研究WDRPUH对细胞生长的作用，通过用表达WDRPUH的质粒(pcDNA-WDRPUH)转染NIH3T3细胞(ATCC，Rockville，MD)以进行集落-形成试验。具体地说，按实施例3所述扩增对应于WDRPUH的完整编码区，并克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)。分别用质粒pcDNA-WDRPUH、对照质粒(mock)和表达WDRPUH互补链的质粒(pcDNA-antisense)转染细胞。在含有适当浓度的遗传霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中将转染细胞培养10至21天。然后，用100％甲醇固定细胞，并用Giemsa溶液进行染色。所有实验同时做三份。
结果，与对照质粒(mock)或pcDNA-antisense相比，用pcDNA-WDRPUH转染的细胞产生了显著更多的集落(图4a和b)。根据Student’s t试验进行统计学分析以测定显著差异。
实施例5通过指定用于降低WDRPUH表达的反义S-寡核苷酸抑制肝癌细胞生长为了检测抑制WDRPUH是否能导致HCC细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成了多个被指定用于抑制WDRPUH表达的反义S-寡核苷酸。使用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)，用包含WDRPUH的第一个外显子-内含子边界的反义S-寡核苷酸(WDRPUH-AS4；5’-GGCCTCACCATTGAAG-3’[SEQ ID NO16])或对照S-寡核苷酸(WDRPUH-S4；5’-CTTCAATGGTGAGGCC-3’[SEQ ID NO17])转染铺于10-cm平皿上的SNU475细胞(韩国细胞系库)(2×105个细胞/皿)；并在添加有适当浓度的遗传霉素的RPMI1640中培养6至12天。通过RT-PCR和Western印迹分析细胞的WDRPUH和GAPDH表达。
与对照(WDRPUH-S4)相比，用WDRPUH-AS4转染的SNU475细胞中WDRPUH的内源性表达显著降低(图5a)。
接着，通过以5×105个细胞/100mm平皿的密度平铺SNU475细胞进行3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验。用指定用于抑制WDRPUH的有义或反义S-寡核苷酸转染三份细胞。培养72小时之后，用含有500μg/ml MTT(Sigma)的新鲜培养基更换培养基，将平板置于37℃保温4小时。然后，加入1ml 0.01N HCl/10％ SDS以裂解细胞。用ELISA平板读数器，在570nm的检测波长下(参比波长为630nm)定量颜色反应。用与对照相比的吸光度描述细胞生存力。
与上述RT-PCR和Western印迹分析相似，与WDRPUH-S4相比，WDRPUH-AS4的转染能显著降低存活细胞的数目(图5b)，这表明WDRPUH对肝细胞癌细胞的细胞生长和/或存活起着重要作用。通过三个独立的实验进一步证实了该结果。
实施例6表达WDRPUH siRNA的质粒的构建及其对HCC细胞生长的作用最近已证实在哺乳动物细胞中，短的干扰RNA(siRNA)具有基因特异性的基因沉默作用，而不会诱导基因表达的全面改变，所述siRNA由具有19个互补核苷酸和3’末端互补的胸苷或尿苷二聚体的20至21聚体双链RNA(dsRNA)组成。因此，本发明人构建了表达多种WDRPUH-siRNA的质粒，并检查了它们对WDRPUH表达的作用。
首先，按下述构建psiH1BX3.0载体。由于据报道H1RNA基因由RNA聚合酶III转录，所述酶可在3’末端产生具有尿苷的短转录物，因此，使用一套引物5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’[SEQ ID NO18]和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’[SEQ ID NO19]，以人胎盘DNA作为模板，通过PCR扩增含有其启动子区域的H1RNA基因的基因组片段。纯化产物，根据厂商提供的方案使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将产物克隆至pCR2.0质粒载体。用一套引物5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’[SEQ ID NO20]和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’[SEQ ID NO21]，通过PCR扩增含有H1RNA基因的片段；用BamHI和XhoI消化，再进行纯化。然后，将经纯化的含有H1RNA基因的BamHI-XhoI片段克隆至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的核苷酸1257至56片段。将连接的DNA用作PCR模板，PCR引物是5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’[SEQ ID NO22]和5’-TTTAAGCT TGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’[SEQ ID NO23]。用HindIII消化产物，随后自身连接以产生psiH1BX3.0载体质粒。
通过将双链寡核苷酸克隆至psiH1BX3.0载体的BbsI位点，制备出对照质粒和表达WDRPUH-siRNA的质粒。克隆至载体的寡核苷酸如下psiH1BX-WDRPUH01，5’-CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATC ACATT-3’[SEQ ID NO24]和5’-AAAAAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3’[SEQ ID NO25]psiH1BX-WDRPUH02，5’-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3’[SEQID NO26]和5’-AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACT GGTGTCCTT-3’[SEQ ID NO27]；psiH1BX-WDRPUH03，5’-CACCAAAGAGAC GCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3’[SEQ ID NO28]和5’-AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3’[SEQ ID NO29]；psiH1BX-WDRPUH05，5’-CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3’[SEQ ID NO30]和5’-AAAAAACGACGGTAAAATCCGAGCCTCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3’[SEQ ID NO31]；和对照psiH1BX-EGFP(mock)，5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’[SEQID NO32]和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’[SEQ ID NO33]。每个序列中的下划线部分是siRNA的靶序列。根据厂商的推荐，使用FuGENE6试剂(Roche)将质粒转染至HepG2细胞。转染48小时之后，从细胞中提取总RNA。
结果，其中的psiH1BX-WDRPUH01而不是psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03或psiH1BX-WDRPUH05能显著抑制细胞中的WDRPUH表达(图6A)。为了检测抑制WDRPUH是否能导致肝癌细胞的生长受抑制，用psiH1BX-WDRPUH01、psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03或psiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP或模拟载体转染HepG2细胞。与用psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03或psiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP或对照转染的细胞相比，用psiH1BX-WDRPUH01转染的存活细胞显著减少，这表明WDRPUH表达的降低能抑制肝癌细胞的生长(图6B)。
实施例7制备抗-WDRPUH抗体为了检查WDRPUH的表达并研究其功能，按下述制备抗WDRPUH的多克隆抗体。首先，在大肠杆菌中产生重组的经His-标记的WDRPUH，并根据厂商的推荐，使用Pro BondTM组氨酸树脂(Invitrogen)从细胞中纯化所述WDRPUH。将重组蛋白质用于免疫兔。从血清中纯化抗WDRPUH的多克隆抗体。
抗-WDRPUH血清而不是预-免疫血清的免疫印迹显示出70kD经FLAG-标记的WDRPUH带，其大小与使用抗-FLAG抗体检测到的相同(图7)。
实施例8表达、分离和鉴定新的人基因KRZFPUH使用C6242 cDNA作为探针，按实施例2所述进行多-组织Northern印迹分析。结果显示出2.8-kb转录物在胎盘和睾丸中大量表达(图8a)。由于C6242比在Norrhern印迹上检测到的小，发明人研究了KRZFPUH cDNA 5’部分的序列。首先，使用BLAST程序在基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中检索对应于C6242的基因组序列，以寻找定位于染色体带16p11的工作草图序列(GenBank登录号NT-024802)。使用GENSCAN、Gene Reeognition和Assembly Intemet Link程序推测基因组序列的候选外显子序列，连接推测的外显子序列。然后，按实施例2所述进行5’-RACE，不同的是将5’-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3’[SEQ ID NO34]用作引物，结果获得2744个核苷酸长的装配序列，其中含有1500个核苷酸长的开放阅读框，其编码500个氨基酸长的蛋白质(GenBank登录号AB065282)。用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)检索蛋白质基元，结果表明推测的蛋白质含有Kruppel-型锌指结构域(图8b)。测定的KRZFPUH核苷酸序列及其推测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO3和4。
实施例9KRZFPUH的亚细胞定位使用基因特异性引物套5’-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3’[SEQ ID NO35]和5’-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3’[SEQ ID NO36]扩增对应于的KRZFPUH的完整编码区；并将其克隆至pcDNA3.1myc/His载体(Invitrogen)。然后将该构建体瞬时转染至SNU475细胞(韩国细胞系库)，并按实施例3所述研究KRZFPUH的亚细胞定位。细胞的免疫细胞化学染色揭示出经标记的KRZFPUH蛋白存在于细胞核中(图9)。
实施例10KRZFPUH对细胞生长的作用为了分析KRZFPUH对细胞生长的作用，通过用表达KRZFPUH的质粒(pcDNA-KRZFPUH)转染COS7细胞(ATCC，Rockville，MD)以进行集落-形成试验。具体地说，按实施例9所述扩增对应于KRZFPUH的完整编码区，并克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)。分别用质粒pcDNA-KRZFPUH、对照质粒(mock)和表达KRZFPUH互补链的质粒(pcDNA-antisense)转染细胞。在含有适当浓度的遗传霉素的DMEM中将转染细胞培养10至21天。然后，用100％甲醇固定细胞并用Giemsa溶液染色。所有实验都做三份。如图10a和b所示，与表达KRZFPUH互补链的对照质粒(pcDNA-antisense)相比，pcDNA-KRZFPUH在COS7细胞中产生了明显更多的集落。通过三个独立的实验进一步证实该结果。根据Student’s t试验进行统计学分析以测定显著性差异。
实施例11通过指定用于降低KRZFPUH表达的反义S-寡核苷酸抑制肝癌细胞生长为了检测抑制KRZFPUH是否能导致HCC细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成了多个被指定用于抑制其表达的反义S-寡核苷酸。使用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)，用包含KRZFPUH的第一个外显子-内含子边界的反义S-寡核苷酸(KRZFPUH-AS4；5’-GGCCTCACCGAGCGCG-3’[SEQ ID NO37]或对照S-寡核苷酸(KRZFPUH-S4；5’-CGCGCTCGGTGAGGCC-3’[SEQ ID NO38])转染铺于10-cm平皿上的Alexander细胞(ATCC，Rockville，MD)(2×105个细胞/皿)；并在添加有适当浓度的遗传霉素的RPMI1640中培养6至12天。然后，用100％甲醇固定细胞并用Giemsa溶液染色。在组成型表达大量KRZFPUH的Alexander细胞中，与对照有义S-寡核苷酸(KRZFPUH-S4)相比，通过用反义S-寡核苷酸(KRZFPUH-AS4)转染，KRZFPUH的内源性表达和存活细胞的数目显著降低(图11a和b)，这表明KRZFPUH对HCC细胞的细胞生长和/或存活起着重要作用。通过三个独立的实验进一步证实了该结果。根据Student’s t试验进行统计学分析以测定显著性差异。
实施例12表达KRZFPUH siRNA的质粒的构建及其对HCC细胞生长的作用通过将双链寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0载体来制备表达KRZFPUH-siRNA的质粒。用于KRZFPUH-siRNA的寡核苷酸是psiU6BX-KRZFPUH15’-CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCA TCGGTGTTTCGTT-3’(SEQ ID NO104)和5’-AAAAAACGAAACACCGATGACTGGGTCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3’(SEQ ID NO105)；psiU6BX-KRZFPUH25’-CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCG GTGATT-3’(SEQ IDNO106)和5’-AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3’(SEQ ID NO107)psiU6BX-KRZFPUH35’-CACCAAACCTTGCCTACGACATGTTTTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3’(SEQ ID NO108)和5’-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTA GGCAAGGTTT-3’(SEQ ID NO109)；和psiU6BX-KRZFPUH45’-CACCAAAAGG TTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3’(SEQ ID NO110)和5’-AAAAAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3’(SEQ ID NO111)。每个序列中的下划线部分是siRNA的靶序列。
根据厂商的推荐，使用FuGENE6试剂(Roche)将psiU6BX-KRZFPUH、psiU6BX-EGFP或psiH1BX-mock质粒转染至细胞中。转染48小时之后，从细胞中提取总RNA。
最近已证实在哺乳动物细胞中，短的干扰RNA(siRNA)具有基因特异性的基因沉默作用，而不会诱导基因表达的全面改变，所述siRNA由具有19个互补核苷酸和3’末端互补的胸苷或尿苷二聚体的20至21聚体双链RNA(dsRNA)组成。因此，本发明人构建了表达多种KRZFPUH-siRNA的质粒，并检查了它们对KRZFPUH表达的作用。在siRNA中，是psiU6BX-KRZFPUH2而不是psiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3或psiU6BX-KRZFPUH4能显著抑制Huh7、Alexander、HepG2和SNU449细胞中的KRZFPUH表达(图12和13，数据未显示)。为了检测抑制KRZFPUH是否能导致肝癌细胞的生长受抑制，用psiU6BX-KRZFPUH2、psiH1BX-KRZFPUH1，psiH1BX-KRZFPUH3、psiH1BX-KRZFPUH4、psiH1BX-EGFP或模拟载体转染Huh7、Alexander细胞。与用psiH1BX-KRZFPUH1、psiH1BX-KRZFPUH3、psiH1BX-KRZFPUH4、psiU6BX-EGFP或对照转染的细胞相比，用psiU6BX-KRZFPUH2转染的存活细胞显著减少，这表明KRZFPUH表达的降低能抑制肝癌细胞的生长(图12和13)。
实施例13鉴定常在人结肠癌中被上调的新基因PPIL1使用含有23040个基因的cDNA微阵列，按实施例1所述将11个结肠癌组织的表达分布图与相应的非-癌结肠粘膜组织的表达分布图进行比较。该分析鉴定出多个基因，与其在相应非-癌组织中的表达水平相比，所述基因在癌症组织中的表达水平通常有所升高。其中，与CGI-124/PPIL1基因(GenBank登录号为AF151882)相对应、机构内部登录号为B9486的基因在穿过截留滤器的所有6个病例的癌症组织中的表达水平在2.36至4.68的放大范围内有所增强，所述增强是与相应的非-癌粘膜相比而言的(图14a)。为了阐明微阵列的结果，使用引物5’-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3’(正向)[SEQID NO39]和5’-CTCGACGAGTTCTCCCATCG-3’(反向)[SEQ ID NO40]，按实施例1所述，通过半定量RT-PCR检查这些转录物在其它结肠癌样品中的表达。根据半定量RT-PCR，证实在20个病例的17个中，PPIL1的表达有所增加(图14b)。
实施例14.PPIL1的结构使用国立生物技术信息中心的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，在公共数据库中对对应于PPIL1的AF151882序列进行额外的同源性检索，鉴定出包括BE908798、AK026636的EST，它们分别含有PPIL1的5’或3’部分，还鉴定出被定位于染色体带6p21.1的基因组序列(GenBank登录号为NT_007592)。装配的PPIL1 cDNA序列具有1734个核苷酸，其中含有498个核苷酸长的开放阅读框。将该cDNA序列与基因组序列相比较，揭示出该基因由4个外显子组成。该基因推测的氨基酸序列与鼠的相应序列具有98％的同一性(图15)。测定的PPIL1核苷酸序列及其推测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO5和6。
实施例15PPIL1对细胞生长的作用为了研究PPIL1对细胞生长的作用，通过用表达经myc-标记的PPIL1蛋白的质粒(pcDNA3.1myc/His-PPIL1)转染NIH3T3细胞(ATCC，Rockville，MD)进行集落-形成试验。按下述构建质粒。首先，根据厂商提供的方案，使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用聚dT12-18引物(Amersham Pharmacia Biotech)与Superscript II逆转录酶(Life Technologies)，将10微克总RNA等分试样逆转录成cDNA。将所得单链cDNA制品稀释于20μl PCR缓冲液(TaKaRa)中。然后使用下述引物，通过标准RT-PCR实验进行PCR扩增以扩增出对应于PPIL1的完整编码区5’-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3’(正向)[SEQ ID NO41]和5’-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3’(反向)[SEQ ID NO42]。
在下述条件下使用GeneAmp PCR 9700系统(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行RT-PCR94℃变性4分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒和72℃ 45秒共28轮循环。将扩增的片段插入pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)载体。然后将构建的pcDNA3.1myc/His-PPIL1转染至NIH3T3细胞。
与对照质粒，pcDNA3.1myc/His-LacZ或表达PPIL1互补链的pcDNA3.1myc/His-asPPIL1相比，pcDNA3.1myc/His-PPIL1能在NIH3T3细胞中诱导明显更多的集落(图16a)。
另外，进行与上述类似的实验，不同的是将表达少量内源性PPIL1的HCT116人结肠癌细胞(ATCC，Rockville，MD)用作被pcDNA3.1myc/His-PPIL1转染的细胞。结果，在转染的HCT116人结肠癌细胞中观察到增强的集落形成活性(图16b)。
实施例16通过指定用于降低PPIL1表达的反义S-寡核苷酸抑制结肠癌细胞生长为了检测抑制PPIL1是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成了4对对应于PPIL1的对照和反义S-寡核苷酸对照有义寡核苷酸PPIL1-S2，5’-CTTCGCTATGGCGGCA-3’[SEQ ID NO43]；反义S-寡核苷酸PPIL1-AS2，5’-TGCCGCCATAGCGAAG-3’[SEQ ID NO44]；和scramle S-寡核苷酸PPIL1-SCR2，5’-GTTGCACAGCGACGCA-3’[SEQ ID NO92]。使用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)，将每一种合成的寡核苷酸转染至人结肠癌细胞SW480(ATCC，Rockville，MD)、SNU-C4和SNU-C5(皆得自韩国细胞系库)，在被检测的11株结肠癌细胞系中，上述细胞显示出较高水平的PPIL1表达。在Leibovitz’s L-15中培养SW480，在RPMI1640中培养SNU-C4和SNU-C5，所有培养基都添加有适当浓度的遗传霉素，培养时间为6至12天。然后用100％甲醇固定细胞，并用Giemsa溶液进行染色。
在反义S-寡核苷酸中，与对照有义(PPIL1-S2)相比，PPIL1-AS2能显著降低SNU-C5细胞中的PPIL1表达(图17a)。转染6天后，被PPIL1-AS2转染的存活细胞数目显著少于用对照，PPIL1-S2或scramle S-寡核苷酸(PPIL1-SCR2)转染的存活细胞数目，这表明抑制PPIL1能降低转染细胞的生长和/或存活(图17b)。在三个独立的实验中获得了一致的结果。
接着进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验以测定PPIL1-AS2对SW480、SNU-C4和SNU-C5细胞的生长-抑制作用。具体地说，以5×105个细胞/100mm平皿的密度平铺细胞，用指定用于抑制PPIL1的有义或反义S-寡核苷酸转染三份细胞。转染72小时之后，用含有500μg/mlMTT(Sigma)的新鲜培养基更换培养基，将平板置于37℃保温4小时。然后，加入1ml 0.01N HCl/10％ SDS以裂解细胞，并用ELISA平板读数器，在570hm的检测波长下(参比波长为630nm)测定裂解物的吸光度。用与对照细胞相比的吸光度描述细胞生存力。结果，在这三个细胞系中，相对于PPIL1-S2而言，用PPIL1-AS2转染的存活细胞数目明显较少(图17c)。
实施例17PPIL1蛋白与SNW1的相互作用据报道，两种与PPIL1高度同源的原核蛋白质Cyp2(粟酒裂殖糖酵母)和CypE(Dictiostelium discoideum)分别能与Snw1和SnwA相互作用。因此，假设PPIL1蛋白能与Snw1和SnwA的人同系物SNW1/SKIP结合。为了研究该假说，构建了表达经Flag标记的PPIL1蛋白的pFLAG-PPIL1。首先按实施例15所述扩增PPIL1的完整编码区，将产物克隆至pFLAG-CMV-5c(Sigma)的克隆位点以制备pFLAG-PPIL1。类似地，使用基因特异性引物套5’-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3’(正向)[SEQ ID NO45]和5’-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3’(反向)[SEQ IDNO46]，通过RT-PCR扩增SNW1的完整编码区；并将其克隆至pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)的克隆位点以构建表达经myc-标记的SNW1的pcDNA3.1myc-SNW1。接着，与或不与pcDNA3.1myc-SNW1相伴将pFLAG-PPIL1转染至COS7细胞(ATCC，Rockville，MD)。
然后，按下述用抗-FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀转染48小时后，收集用pFLAG-PPIL1和pcDNA3.1myc/His-SNW1转染的COS7细胞，并用含有20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1％ NP-40和1×完全蛋白酶抑制剂混合物EDTA(-)(Boehringer)的裂解缓冲液裂解细胞。用抗-FLAG M2抗体(SIGMA)免疫沉淀细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白质并使用抗-FLAG M2抗体进行免疫印迹分析。
免疫沉淀之后，使用抗-c-Myc抗体进行免疫印迹分析。具体地说，用PBS将用pFLAG-PPIL1和/或pcDNA3.1myc/His-SNW1转染的细胞洗涤2次，并用裂解缓冲液(150mM NaC1，1％ Triton X-100，50mM Tris-HCl pH 7.4，1mM DTT和1×完全蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer))收集细胞。匀浆细胞并以10,000×g离心30分钟后，通过Bradford试验(Bio-Rad)使上清液中的蛋白质浓度标准化。通过10％ SDS-PAGE分离蛋白质，并用小鼠抗-myc抗体(SANTA CRUZ)进行免疫印迹。将与HRP-偶联的山羊抗-小鼠IgG(Amersham)用作ECL检测系统(Amersham)的第二抗体。
结果表明当用两种质粒共转染细胞时，观察到对应于经myc-标记的SNW1蛋白的带(图18)。另外，用抗-cMyc抗体免疫沉淀裂解物可沉淀出经Flag-标记的PPIL1蛋白。这些结果证实PPIL1可在体内直接或间接与SNW1结合。
实施例18PPIL1与SNW1的共-定位为了进一步证实PPIL1与SNW1结合，通过使用抗-FLAG抗体对用pFLAG-PPIL1和pcDNA3.1myc-SNW1共转染的细胞进行免疫组化染色，检查经FLAG标记的PPIL1蛋白和经myc-标记的SNW1蛋白在COS7细胞中的亚细胞定位。具体地说，用含有4％低聚甲醛的PBS将用pFLAG-PPIL1和pcDNA3.1myc/His-SNW1转染的细胞固定15分钟，然后于室温下，用含有0.1％ Triton X-100的PBS透化细胞达2.5分钟。随后，于4℃用含有2％ BSA的PBS覆盖细胞24小时以阻断非-特异性杂交。将1∶1000稀释的小鼠抗-myc单克隆抗体(Sigma)或1∶2000稀释的小鼠抗-FLAG抗体(Sigma)用作第一抗体，在同与罗丹明-偶联的抗-小鼠第二抗体(Leinco和ICN)保温之后观察反应。用DAPI复染细胞核。在ECLIPSE E800显微镜下获得荧光图像。
用抗-FLAG抗体对细胞进行的免疫组化染色显示出细胞核中的信号，用抗-myc抗体显示出细胞核和细胞质中类似的阳性染色。图19a和b以及用DAPI复染的图19c的合并图像显示出经FLAG标记的PPIL1蛋白和经myc标记的SNW1蛋白共同定位于细胞核中(图19d)，这与PPIL1和SNW1之间存在相互作用的看法一致。
实施例19在人的多个组织中表达PPIL1使用PPIL1 cDNA作为探针进行多-组织Northern印迹分析。更具体地，使人多-组织印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与经32P-标记的PPIL1 PCR产物杂交。根据厂商的推荐进行预-杂交、杂交和洗涤。于-80℃用增感屏对印迹进行放射自显影24至72小时。
结果显示出所表达的1.7kb转录物的遍在表达。在被检查的组织中，在心脏、骨骼肌、睾丸、甲状腺和肾上腺中观察到大量表达(图20)。
实施例20表达PPIL1 siRNA的质粒的构建及其对结肠癌细胞生长的作用构建表达多种PPIL1-siRNA的质粒以检查其对PPIL1表达的作用。首先，按照与实施例6类似的方法构建psiH1BX3.0载体。另外，按实施例6所述制备对照载体psiH1BX-EGFP。然后，通过将双链寡核苷酸克隆至psiH1BX3.0载体的BbsI位点以制备表达PPIL1-siRNA的质粒。克隆至载体的寡核苷酸如下psiH1BX-PPIL-A，5’-TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGAGAACAGGTCTTTGG AGCATGC-3’[SEQ ID NO47]和5’-AAAAGCATGCTCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3’[SEQ IDNO48]；psiH1BX-PPIL-B，5’-TCCCAGA CTTCATGATCCAAGGATTCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3’[SEQ ID NO49]和5’-AAAAAGACTTCATGATCCAAGGATCTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT-3’[SEQ ID NO50]和psiH1BX-PPIL-C，5’-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTTGTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3’[SEQ ID NO51]和5’-AAAATGGCAGCCAGTTCTTTGTGTCTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3’[SEQ ID NO52]。每个序列中的下划线部分是siRNA的靶序列。
根据厂商的推荐，使用FuGENE6试剂(Roche)将质粒转染至结肠癌细胞SNUC4或SNUC5中。转染48小时之后，从细胞中提取总RNA。
其中，是psiH1BX-PPIL-A而不是psiH1BX-PPIL-B或psiH1BX-PPIL-C能显著抑制SNUC4以及SNUC5细胞中的PPIL1表达(图21A)。为了检测抑制PPIL1是否能导致结肠癌细胞SNUC4和SNUC5的生长受抑制，用psiH1BX-PPIL-A、psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C或对照psiH1BX-EGFP转染细胞。与用psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C或psiH1BX-EGFP转染的细胞相比，用psiH1BX-PPIL-A转染的存活细胞明显减少，这表明PPIL1表达的降低能抑制结肠癌细胞的生长(图21B)。
实施例21制备重组PPIL1蛋白为了产生抗PPIL1的特异性抗体，需制备重组PPIL1蛋白。使用一套引物5’-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3’[SEQ ID NO53]和5’-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3’[SEQ ID NO54]，通过RT-PCR扩增PPIL1的完整编码区。纯化产物，用BamHI和Xho1消化，克隆至pGEX-6P-1(pGEX-PPIL1)或pET21a(pET-PPIL1)载体的适当克隆位点。将pGEX-PPIL1或pET-PPIL1转化至大肠杆菌DH10B或BL21密码子正细胞。通过加入IPTG诱导重组蛋白质，根据厂商提供的方案从提取物中纯化重组蛋白质。当将质粒转化至大肠杆菌细胞时，可在SDS-PAGE上观察到预期大小的重组蛋白质的产生(图22A和B)。
实施例22通过细菌双-杂合筛选系统将驿蛋白鉴定为PPIL1-相互作用蛋白为了分析PPIL1的功能，使用细菌双-杂合筛选系统搜索PPIL1-相互作用蛋白。根据厂商提供的方案，使用BacterioMatch双杂合系统(Stratagene)进行细菌双-杂合试验。将实施例21所得的PPIL1完整编码序列克隆至pBT载体的BamHI-XhoI位点以用作饵，并筛选人胎脑cDNA文库(Stratagene)。在鉴定出的阳性克隆中，通过同时用pBT-PPIL1和pTRG-STMN转化细菌显示出驿蛋白与PPIL1的相互作用(图23A)。
另外还进行免疫沉淀试验。具体地说，用按实施例17所述制备的表达经FLAG-标记的PPIL1的pFLAG-PPIL1，和表达经HA-标记的驿蛋白蛋白的pCMV-HA-STMN或其组合转染COS7细胞，用PBS洗涤细胞，并用含有150mM NaCl，1％ NP-40，10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA和1×完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的NET-N缓冲液裂解细胞。在典型的免疫沉淀反应中，于4℃，将300μg全细胞提取物与1μg小鼠抗-FLAG(SIGMA)或3μg大鼠抗-HA抗体和20μl蛋白G Sepharose珠(Zymed)一起保温1至2小时。用1ml NET-N缓冲液将珠洗涤5次，通过在SDS样品缓冲液中煮沸以洗脱与珠结合的蛋白质。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白质，并使用抗-HA抗体或抗-FLAGM2抗体进行免疫印迹分析。
如上所述，通过COS7细胞中的免疫沉淀试验证实了体内经FLAG-标记的PPIL1蛋白和经HA-标记的驿蛋白蛋白之间的结合(图23B)。有趣的是，使用抗-驿蛋白抗体的Western印迹分析显示出两条对应于18-kDa和20-kDa蛋白质的带，这表明驿蛋白修饰形式的存在。由于已证实驿蛋白具有推定的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点(Ser16，Ser25，Ser38和Ser63)，较大的带可能对应于驿蛋白的磷酸化形式。另外，由于用抗-Flag抗体进行免疫沉淀显示出对应于20-kDa蛋白质的单条带，PPIL1可能与修饰形式结合，或通过与之结合来增加驿蛋白的修饰。
实施例23经Flag-标记的PPIL1和经HA-标记的驿蛋白在细胞中的共-定位为了检测PPIL1和驿蛋白是否共-定位于细胞中，按实施例22所述，将pFLAG-PPIL1和pCMV-HA-STMN共转染至COS7细胞以通过免疫组化染色检查其亚细胞定位(图24)。用抗-FLAG抗体染色，结果表明经Flag-标记的PPIL1定位于细胞核和胞质中，而用抗-HA抗体染色的结果表明经HA-标记的驿蛋白与PPIL1共-定位于胞质中。该数据支持PPIL1和驿蛋白在胞质中相互作用的观点。
实施例24用于与PPIL1相互作用的驿蛋白反应区另外，使用pCMV-HA-STMN的多种缺失突变体和野生型pFLAG-PPIL1，按照类似于实施例22的方式进行免疫沉淀试验以阐明用于相互作用的反应区。使用下述引物套，以全长克隆(pFLAG-PPIL1)作为模板扩增STMN的缺失突变体缺失突变体1，5’-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3’[SEQ ID NO55]和5’-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3’[SEQ ID NO56]；缺失突变体2，5’-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3’[SEQ ID NO57]和5’-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3’[SEQ ID NO58]；缺失突变体3，5’-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3’[SEQ ID NO59]和5’-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3’[SEQ ID NO60]；缺失突变体4，5’-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3’[SEQ ID NO61]和5’-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3’[SEQ ID NO62]；和缺失突变体5，5’-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3’[SEQ ID NO63]和5’-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3’[SEQID NO64]。将PCR产物克隆至pcDNA3.1myc/His的Kpn1和Xho1位点。
缺失驿蛋白的氨基酸1-43的缺失突变体(De13)能与PPIL1结合，但缺失1至65的突变体(Del 4)却不能与PPIL1结合。同时，另一个含有氨基酸1至61的突变体能够结合PPIL1(图25A和B)，这表明包含密码子44至61的区域是结合所必需的。
实施例25驿蛋白的磷酸化及其与PPIL1的相互作用由于抗-Flag抗体的免疫沉淀显示出对应于驿蛋白修饰形式的单条带，制备在推定的丝氨酸磷酸化位点表达其突变形式的质粒以检测其与PPIL1的结合(图26A)。具体地说，根据厂商的推荐，使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)和下述引物套制备突变体(用Ala取代Ser)S16A，5’-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3’[SEQ ID NO65]和5’-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3’[SEQ ID NO66]；S25A，5’-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3’[SEQ ID NO67]和5’-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3’[SEQ ID NO68]；
S38A，5’-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3’[SEQ IDNO69]和5’-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3’[SEQID NO70]；S63A，5’-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3’[SEQ IDNO71]和5’-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3’[SEQ IDNO72]。
用S16A或S63A突变体转染的细胞的Western印迹检测出非磷酸化和磷酸化形式，而用S38A突变体转染的细胞的Western印迹显示出对应于非磷酸化形式的单条带。因此，驿蛋白的丝氨酸38可能在细胞中被磷酸化。令人奇怪的是，驿蛋白-S38A突变体能与PP1L1结合(图26B)。因此，PPIL1与驿蛋白的相互作用可增强位于驿蛋白密码子44和61之间的PPIL1-结合位点附近的丝氨酸38的磷酸化。
实施例26分离受APC调节的基因APCDD1结肠癌发生的早期与β-连环蛋白/Tcf途径的调节受损有关。因此，在接下来的方案中搜索该途径的下游基因。APC的转导能降低结肠癌细胞细胞核中的β-连环蛋白水平，随后便能抑制β-连环蛋白/Tcf复合物的反式激活活性(van der Heyden et al.，J Cell Sci 1111741-9(1998))。因此，使用与实施例1类似的微阵列方法比较SW480细胞的表达分布图，其中大量β-连环蛋白积累于SW480细胞的核和胞质中。
为了鉴定受β-连环蛋白/Tcf复合物调节的基因，以MOI＝100用表达野生型APC(Ad-APC)或LacZ(Ad-LacZ；对照基因)的腺病毒构建体感染SW480细胞(ATCC，Rockville，MD)，并在Leibovitz’s L-15中培养细胞。感染72小时之后，从细胞中提取总RNA，根据Satoh等(Nat Genet 24245-50(2000))的方法，使用纯化自提取物的polyA RNA进行基于T7的RNA扩增。分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP标记得自含Ad-APC和Ad-LacZ的SW480细胞的扩增RNA(aRNA)，将等量的两种经标记aRNA作为探针，用于在微阵列载玻片上共-杂交。
比较23040个基因在用Ad-APC感染和用Ad-LacZ感染的SW480细胞中的表达分布图，从而鉴定出多个基因，所述基因的表达水平因APC的转染而被下调。在这些基因中，鉴定出对应于NCBI(国立生物技术信息中心)UniGene簇的EST Hs.20665、机构内部登录号为B7323N的基因，与Ad-LacZ相比，所述基因对Ad-APC作出的反应是表达水平降低约4倍。
随后，进行半定量RT-PCR实验以进一步证实APC表达的降低(图27a)。具体地说，根据厂商提供的方案，使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用聚dT12-18引物(AmershamPharmacia Biotech)与Superscript II逆转录酶(Life Technologies)，将10微克总RNA等分试样逆转录成cDNA。将所得单链cDNA制品稀释于20μl PCR缓冲液(TaKaRa)中。然后使用下述引物，通过标准RT-PCR实验进行PCR扩增正向，5’-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3’［SEQ ID NO73]；和反向，5’-TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3’[SEQ ID NO74]。在下述条件下使用GeneAmp PCR 9700系统(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行扩增94℃变性4分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒和72℃ 45秒共30轮循环。
另外，也用腺病毒Ad-Axin处理细胞并检查细胞中的B7323N表达，其中所述腺病毒表达也能下调β-连环蛋白/Tcf-4复合物活性的野生型AXIN1。结果，也观察到AXIN1的转导能降低B7323N的表达(图27a)。
用B7323N的cDNA序列在公共数据库中进行同源性检索，鉴定出100多个EST和定位于染色体带18p11.2的人基因组序列(GenBank登录号NT019631)。为了测定B7323N的全长cDNA序列，如实施例2所述进行5′RACE，不同的是使用了B7323N基因-特异性的引物(5’-GCTCGTCTGACCGATA GATGATCC-3’[SEQ ID NO75])，最终获得cDNA序列。从而测定其全长cDNA序列。所述cDNA由2607个核苷酸组成，其中含有1542个核苷酸长的开放阅读框，它编码推定的514个氨基酸长的蛋白质，其预测分子量为58.8kD(GenBank登录号AB104887)。推测的APCDD1蛋白与解木聚糖热杆菌的内切-1，4-β-木聚糖酶具有31％的同一性。使用计算机程序SMART(http://smart/embl-heidelberg/de/)和PSORT II Prediction(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)在数据库中进行基元检索，未鉴定出任何已知的结构域。因此，将该基因称为APCDD1(被APCI下调)。比较cDNA序列与基因组序列即可测定APCDD1的基因组结构，它由5个外显子组成，约覆盖40-kb的基因组区域(数据未显示)。测定的APCDD1核苷酸序列及其推测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO7和8。
最终，按实施例2所述对APCDD1进行Northern印迹分析。Northern印迹分析表明APCDD1的2.6-kb转录物在心脏、胰腺、前列腺和卵巢中大量表达，但很少在肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺、结肠和外周白细胞中表达(图27b)。
实施例27在结肠-癌组织中表达APCDD1由于β-连环蛋白的积累是结肠癌的常见特征，因此，按实施例26所述，通过半定量RT-PCR检查结肠癌和相应非-癌组织中的APCDD1表达，在被检查的30个肿瘤的20个(67％)中检测出增加的表达(图27c)。该结果与APCDD1对β-连环蛋白/Tcf转录复合物的激活作出反应而被上调的事实一致。
实施例28APCDD1的启动子活性被β-连环蛋白和野生型Tcf4的复合物上调为了检测APCDD1的启动子活性是否受β-连环蛋白/Tcf4复合物的调节，将含有两个推定的Tcf/LEF结合基元(TBM1和2)的报道质粒P1转染至HeLa细胞，所述结合基元具有/不具有激活形式的突变β-连环蛋白和野生型Tcf4(图28a)。更具体地，通过比较人基因组序列(GenBank登录号为NT 019631.4)和APCDD1 cDNA序列测定APCDD1的推定转录起始位点(TIS)。通过PCR扩增APCDD1 5’侧翼区的3个片段(P1，P2和P3)，将它们克隆至pGL3-Basic载体(Promega)的适当酶切位点。使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(STRATAGENE)对含有一个或两个推定的Tcf/LEF结合基元的P1和P2进行定点诱变。使用一套引物5’-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3’[SEQ ID NO76]和5’-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3’[SEQ ID NO77]，以提取自HCT116结肠癌细胞的RNA为模板，通过RT-PCR制备激活形式的突变β-连环蛋白，随后克隆至pcDNA3.1质粒载体(Invitrogen)的适当克隆位点。分别使用引物套TcfF15’-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3’[SEQ ID NO78]和TcfR15’-CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGG TGACGAGCGAC-3’[SEQ ID NO79]，以及TcfF35’-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3’[SEQ ID NO80]和TcfR1，通过RT-PCR扩增Tcf-4完整编码区及其5’缺失区的人cDNA片段(wtTcf4，dnTcf4)。将产物克隆至pcDNA3.1质粒载体。使用FuGENE6(BoehringerMannheim)，将2μg各种报道质粒和1.5μg各种表达构建体与0.5μg pRL-TK质粒(Promega)一起共转染至HeLa细胞以使转染效率归一化。根据厂商的推荐，使用双重-萤光素酶报道试验系统(Promega)进行报道试验。
通过导入激活形式的β-连环蛋白和野生型Tcf4可显著增强质粒P1的报道活性(图28b)。有趣的是，当P1与Tcf4的显性失活形式共转染时，可降低增强的活性，这表明Tcf4能影响APCDD1的启动子活性。
为了测定负责其启动子活性的元件，我们进一步比较了P1的每个缺失突变体的启动子活性。P1的活性分别显著高于P2和P3的活性，仅含有TBM2的P2的活性显著高于P3的活性(图28b)。这些数据暗示包含-971至-151的区域可与β-连环蛋白/Tcf4复合物结合，并且与APCDD1启动子活性有关。由于该区域含有两个可能的Tcf/LEF-结合基元，假定这些基元负责转录激活。
为了研究该假说，构建了报道质粒P1M和P2M，其中将候选的Tcf/LEF-结合基元变为不能结合β-连环蛋白/Tcf4复合物的CTTTGGC[SEQID NO81]。使用这5个质粒的报道试验揭示出含有突变基元的P1M和P2M片段激活APCDD1转录的能力降低；而其萤光素酶活性等同于P2或P3片段(图28b)。这些结果暗示这两个推定的Tcf/LEF-结合基元都参与APCDD1的转录激活。
实施例29电泳迁移率变动分析为了测定β-连环蛋白/Tcf4复合物是否直接与TBM1和TBM2结合，使用经设计包含有TBM1序列(APCDD1-TBM1)和TBM2序列(APCDD1-TBM2)的寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。具体地说，按上文所述，使用得自SW480细胞完整细胞核的提取物进行EMSA(van der Heyden et al.，J CellSci 1111741-9(1998))。通过退火FF(5’-GCTTTGATTGTGGTGA-3’[SEQ IDNO82])和RR(5’-TCACCACAATCAAAGC-3’[SEQ ID NO83])(针对APCDD1-TBM1而言)以及FF2(5’-CCCCTTTGAACACCTT-3’[SEQ ID NO84])和RR2(5’-AAGGTGTTCAAAGGGG-3’[SEQ ID NO85])(针对APCDD1-TBM2而言)，制备出两个双链16-核苷酸DNA探针。
通过加入抗-β-连环蛋白抗体而不是P53抗体(对照)，观察到对应于β-连环蛋白/Tcf4与APCDD1-TBM1和APCDD1-TBM2的结合的带的变动(图29)。正如所预期的，通过加入野生型未标记的寡核苷酸而不是突变的未标记寡核苷酸可取消所述结合。
实施例30APCDD1在体外对LoVo细胞生长的作用为了披露APCDD1对结肠癌肿瘤发生的潜在作用，制备表达APCDD1(pcDNA-APCDD1)和APCDD1互补链(pcDNA-antisense)的质粒以在表达少量APCDD1的LoVo细胞(ATCC，Rockville，MD)中进行集落形成试验。更具体地，使用基因特异性引物套5’-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3’[SEQ ID NO86]和5’-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3’[SEQ ID NO87]，通过RT-PCR扩增APCDD1的完整编码区。将PCR产物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)的适当克隆位点。然后，用构建的pcDNA-APCDD1或pcDNA-antisense转染LoVo细胞，在添加有适当浓度的遗传霉素的HAM’s F-12中培养细胞10至21天。用100％甲醇固定细胞并用吉姆萨溶液染色。
结果，与对照质粒pcDNA-antisense或pcDNA相比，pcDNA-APCDD1产生了明显更多的集落(图30a)。通过三个独立的实验进一步证实了该结果。为了在体外证实它对细胞生长的作用，建立表达外源性APCDD1的LoVo细胞(LoVo-APCDD1细胞)以将它们的生长情况与被模拟载体转染的对照细胞相比较(图30b)。与对照LoVo-mock细胞相比，LoVo-APCDD1细胞以显著增加的速率生长(图30c)。
实施例31APCDD1对裸鼠肿瘤生长的作用为了研究APCDD1在体内的作用，将2克隆LoVo-APCDD1细胞或2克隆LoVo-mock细胞皮下移植至12只BALBcAnN Cri-nu/nu小鼠。具体地说，将肿瘤细胞LoVo-APCDD1或LoVo-vector调节至终浓度为5×107个细胞/ml，分别将100μl细胞皮下注射至BALB/cAnN Crj-nu/nu小鼠的后背中间位置。每过7天测量一次肿瘤大小，共持续8周，通过公式V＝π/6×a2×b估计肿瘤体积，其中“a”是短轴，“b”是长轴。
结果，移植8周后，LoVo-APCDD1克隆的肿瘤平均大小达到约482和653mm3，而LoVo-mock达到65和277mm3；这表明在体内导入APCDD1能对细胞生长起促进作用(图30d)。
实施例32被指定用于降低APCDD1表达的反义S-寡核苷酸的生长-抑制作用为了评估APCDD1的生长-促进作用，合成多对与APCDD1相对应的对照和反义S-寡核苷酸以将它们转染至SW480细胞，在被检查的11个结肠癌细胞系中，SW480细胞能表达大量APCDD1。根据实施例5所述的方法进行实验，不同的是使用SW480细胞替代SNU475细胞，接着使用下述S-寡核苷酸对照有义S-寡核苷酸APCDD1-S2，5’-ATGTCCTGGCCGCGCC-3’[SEQID NO88]；反义S-寡核苷酸APCDD1-AS2，5’-GGCGCGGCCAGGACAT-3’[SEQ ID NO89]；反向S-寡核苷酸APCDD1-R2，5’-TACAGGACCGGCGCGG-3’[SEQ ID NO90]；和scrambled S-寡核苷酸APCDD1-Sc2，5’-ATCTGGTCCGGCGCGG-3’[SEQ ID NO91]。
在寡核苷酸中，与对照APCDD1-S1相比，APCDD1-AS2能显著抑制细胞中的APCDD1表达(图31a)。有趣的是，转染6天后，与APCDD1-S2相比，导入APCDD1-AS2能明显抑制细胞灶的形成，暗示着抑制APCDD1能降低转染细胞的生长和/或存活(图31b)。MTT试验进一步证实与APCDD1-R2、APCDD1-Sc2和未经处理的细胞相比，对APCDD1-AS2作出的反应是细胞存活降低(图31c)。
实施例33在结肠癌细胞系中表达APCDD1为了测定APCDD1的表达和功能，按下述制备抗APCDD1多克隆抗体。首先，在大肠杆菌中产生重组的经His-标记的APCDD1蛋白，并根据厂商的推荐，使用Pro BondTM组氨酸树脂(Invitrogen)从细胞中纯化所述APCDD1。将重组蛋白质用于免疫兔。从血清中纯化抗APCDD1的多克隆抗体。为了进行Western印迹分析，通过10％ SDS-PAGE分离蛋白质并用抗-APCDD1抗体进行免疫印迹。将与HRP-偶联的山羊抗-兔IgG(Santa CruzBio-technology)用作ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)的第二抗体。
按实施例18所述，使用抗-APCDD1抗体进行SW480细胞和冷冻组织的免疫组化染色。根据厂商推荐的方法，用SAB-PO过氧化物酶免疫染色系统(Nichirei，Tokyo，Japan)对石蜡包埋的组织切片进行染色。通过在微波炉中，以700W的功率将置于柠檬酸缓冲液(pH6)中的载玻片预处理10分钟，从脱石蜡和重新水合的组织中挽救抗原。使用包括HCT116、SNUC4和SW480W的结肠癌细胞的提取物，用抗-APCDD1抗体进行的Western印迹分析显示出对应于APCDD1的58-kDa带(图32)。内源性APCDD1蛋白的大小与用抗-FLAG抗体检测到的经Flag-标记的外源性APCDD1蛋白十分类似。在上述3个结肠癌细胞系中，SW480细胞中的APCDD1表达最为丰富。
实施例34APCDD1在结肠癌细胞和组织中的亚细胞定位为了研究其亚细胞定位，使用SW480细胞进行APCDD1的荧光免疫组化染色。固定细胞，用抗-APCDD1染色，并用与荧光素偶联的第二抗体进行观察。在细胞与细胞接触的边界和细胞质中观察到信号(图33)。
还研究了非-癌结肠粘膜和癌组织中的APCDD1表达，在非-癌细胞和癌细胞的胞质中观察到染色(图34)。值得注意的是在上皮细胞的顶板(apicalboarder)处观察到强信号。
实施例35APCDD1在结肠的正常上皮、腺癌和腺瘤中的表达为了比较非-癌上皮细胞和肿瘤细胞之间的APCDD1蛋白表达水平，对石蜡包埋的组织进行免疫组化染色。与非癌上皮细胞相比，癌细胞能被抗-APCDD1抗体更强地染色(图35)。另外，还在腺瘤细胞中观察到微弱的信号(图36)。
工业实用性与非癌肝组织相比，新的人基因WDRPUH和KRZFPUH在肝细胞癌中的表达显著提高。另一方面，与非癌组织相比，新的人基因PPIL1和APCDD1在结肠癌细胞中的表达显著提高。因此，这些基因可用作癌症的诊断标记，由它们编码的蛋白质可用于诊断试验。
本发明人还证实新蛋白质WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的表达能促进细胞生长，而通过与WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1基因相对应的反义寡核苷酸或siRNA可抑制细胞生长。这些发现暗示WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1蛋白刺激致癌活性。因此，这种新的癌症蛋白质是对开发抗癌药物有用的靶。例如，能阻断WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1表达或抑制其活性的药剂具有作为抗-癌药剂，特别是治疗HCC和结肠癌的抗-癌药剂的治疗用途。所述药剂的例子包括反义寡核苷酸、siRNA和能识别WDRPUH，KRZFPUH，PPIL1或APCDD1的抗体。
另外，本发明人还证实了PPIL1能直接与驿蛋白结合，该结果暗示PPIL1能在体内增强驿蛋白的磷酸化。据报道驿蛋白与细胞周期进程有关并与多种类型的癌症相关联，因此，能抑制复合物活性的药剂也能用于治疗和预防结肠癌。
另外，本发明已阐明β-连环蛋白/Tcf-4复合物与APCDD1的两个Tcf/LEF结合基元的结合与APCDD1的转录激活有关。因此，能抑制复合物与结合基元结合的药剂也能用于治疗和预防结肠癌。
尽管根据本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但本发明的多种变化和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，并不背离本发明的精神和范围。
序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)国立大学法人 东京大学(THE UNIVERSITY OF TOKYO)<120>与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽<130>ONC-A0203P<150>US 60/386,985<151>2002-06-06<160>111<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2152<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(35)..(1897)<223>
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aatttggtca ttccttaaag acagggtttc aatttccaca catgatctct gcaaacaggc2555actgggtttt cagtgtcctt tttgaagggt catataaaaa taaggtaaca ccacagtgcc2615actacacctt ctggggctgg acttgtttca gcagctttgg ttgcactgaa tttgggggag2675ctgcatggta ccaggggttt attgggttgc agatatataa atgccctaaa cttaaaaaaa2735aaaaaaaaa2744<210>4<211>500<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Ala Pro Pro Ser Ala Pro Leu Pro Ala Gln Gly Pro Gly Lys Ala1 5 10 15Arg Pro Ser Arg Lys Arg Gly Arg Arg Pro Arg Ala Leu Lys Phe Val20 25 30Asp Val Ala Val Tyr Phe Ser Pro Glu Glu Trp Gly Cys Leu Arg Pro35 40 45Ala Gln Arg Ala Leu Tyr Arg Asp Val Met Arg Glu Thr Tyr Gly His50 55 60Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ala Gly Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ser Trp65 70 75 80Leu Glu Arg Asn Thr Asp Asp Trp Glu Pro Ala Ala Leu Asp Pro Gln85 90 95Glu Tyr Pro Arg Gly Leu Thr Val Gln Arg Lys Ser Arg Thr Arg Lys100 105 110Lys Asn Gly Glu Lys Glu Val Phe Pro Pro Lys Glu Ala Pro Arg Lys115 120 125Gly Lys Arg Gly Arg Arg Pro Ser Lys Pro Arg Leu Ile Pro Arg Gln130 135 140Thr Ser Gly Gly Pro Ile Cys Pro Asp Cys Gly Cys Thr Phe Pro Asp145 150 155 160His Gln Ala Leu Glu Ser His Lys Cys Ala Gln Asn Leu Lys Lys Pro
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aaatgaaaaa cacatccaac aatcaagttt ctaagaaggt gtcaagtggg gaataataat1365aatgtataat aatcaagaaa ttagtttatt aaaaggaagc agaagcattg accatttttt1425cccagagaag aggagaaatc tgtagtgagc aaaggacaga ccatgaatcc tccttgagaa1485gtagtactct cagaaaggag aagcgccact caagttcttt taacccaaga ctttagagaa1545attaggtcca agatttttat atgttcagtt gtttatgtat aaaaataact ttctggattt1605tgtggggagg agcaggagag gaaggaagtt aatacctatg taatacatag aaacttccac1665aataaaatgc cattgatggt tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa a1706<210>6<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Ala Ala Ile Pro Pro Asp Ser Trp Gln Pro Pro Asn Val Tyr Leu1 5 10 15Glu Thr Ser Met Gly Ile Ile Val Leu Glu Leu Tyr Trp Lys His Ala20 25 30Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala Glu Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr35 40 45Asn Gly Thr Lys Phe His Arg Ile Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly50 55 60Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Ala Ser Ile Tyr Gly Lys65 70 75 80Gln Phe Glu Asp Glu Leu His Pro Asp Leu Lys Phe Thr Gly Ala Gly85 90 95Ile Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly Pro Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe100 105 110Phe Val Thr Leu Ala Pro Thr Gln Trp Leu Asp Gly Lys His Thr Ile115 120 125Phe Gly Arg Val Cys Gln Gly Ile Gly Met Val Asn Arg Val Gly Met130 135 140
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<223>人工合成的引物序列<400>9caggtggaaa tgaccatctg gtcaaag 27<210>10<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>10catcagcttc aggaggtata tggtac26<210>11<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>11gtggcactgt ggtgttacct tat 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>12cctctaaacc tttgcctacg act 23
<210>13<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>13ttaccgtcgt tccatgctga aatgatgc 28<210>14<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>14ggggtaccac catggataac aaaatttcgc cggag 35<210>15<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15cggaattctc aggaggtata tgggtacttc catgc 35<210>16<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>16ggcctcacca ttgaag 16
<210>17<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>17cttcaatggt gaggcc 16<210>18<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>18tggtagccaa gtgcaggtta ta22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>19ccaaagggtt tctgcagttt ca22<210>20<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>20tgcggatcea gagcagattg tactgagagt30<210>21
<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>21ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29<210>22<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>22tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac 47<210>23<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>23tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34<210>24<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>24caccaatgtg atcttctcca ggtgcttcaa gagagcacct ggagaagatc acatt55<210>25
<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>25aaaaaatgtg atcttctcca ggtgctctct tgaagcacct ggagaagatc acatt55<210>26<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>26caccaaggac accagtttct cgtagttcaa gagactacga gaaactggtg tcctt55<210>27<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>27aaaaaaggac accagtttct cgtagtctct tgaactacga gaaactggtg tcctt55<210>28<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>28caccaaagag acgctcatag cgactttcaa gagaagtcgc tatgagcgtc tcttt55<210>29
<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>29aaaaaaagag acgctcatag cgacttctct tgaaagtcgc tatgagcgtc tcttt55<210>30<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>30caccaacgac ggtaaaatcc gagccttcaa gagaggctcg gattttaccg tcgtt55<210>31<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>31aaaaaacgac ggtaaaatcc gagcctctct tgaaggctcg gattttaccg tcgtt55<210>32<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>an人工的ly synthesized oligonucleotide<400>32caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c51<210>33<211>51
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>an人工的ly synthesized oligonucleotide<400>33aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c51<210>34<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>34tagattctgg gcgcacttgt ggctctcc 28<210>35<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>35ggggtaccac catggcgcca ccttcg26<210>36<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>36cggaattcat gggcgttgcc cctctgactg g 31<210>37<211>16<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>37ggcctcaccg agcgcg 16<210>38<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>38cgcgctcggt gaggcc 16<210>39<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>39ggacaggtcg aggtggtgc19<210>40<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>40ctcgacgagt tctcccatcg 20<210>41<211>22
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>41agacaagctt tccgccgccg gc22<210>42<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>42gtctctcgag aagggtatgc cttaatgatc ttc33<210>43<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>43cttcgctatg gcggca 16<210>44<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>44tgccgccata gcgaag 16<210>45<211>34
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>q<400>45tgggaanttc cggaagaaga tggcgctcac cage 34<210>46<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>46gtgcctcgag cttcctcctc ttcttgcctt catgc 35<210>47<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>47tcccgcatgc tccaaagacc tgtttcaaga gaacaggtct ttggagcatg c51<210>48<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>48aaaagcatgc tccaaagacc tgttctcttg aaacaggtct ttggagcatg c51<210>49<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>49tcccagactt catgatccaa ggattcaaga gatccttgga tcatgaagtc t51<210>50<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>50aaaaagactt catgatccaa ggatctcttg aatccttgga tcatgaagtc t51<210>51<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸<400>51tccctggcag ccagttcttt gtgttcaaga gacacaaaga actggctgcc a51<210>52<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>52aaaatggcag ccagttcttt gtgtctcttg aacacaaaga actggctgcc a51<210>53<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>53cgccggatcc gctatggcgg caattccccc ag 32<210>54<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>54agcactcgag cccagaaggg tatgccttaa tgatc 35<210>55<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>55attggtacca tggagctgat tctcagccct cggtc 35<210>56<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>56
aatctcgagg tcagettcag tctcgtcagc ag 32<210>57<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>57attggtacca tggttceaga attccccctt tcccct 36<210>58<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>58aatctcgagg tcagetteag tctcgtcage ag 32<210>59<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>59attggtacca tggatctttc cctggaggaa attcag 36<210>60<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>60aatctcgagg tcagettcag tctcgtcagc ag 32
<210>61<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>61attggtacca tggctgaggt cttgaagcag ctggc 35<210>62<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>62aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32<210>63<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>63attggtacct tcaecatggc ttcttctgat atcc 34<210>64<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>64aatctcgagg cgtctttctt ctgcagcttc30
<210>65<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>65ctggagaagc gtgccgcagg ccaggctttt g 31<210>66<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>66caaaagcctg gcctgcggca cgcttctcca g 31<210>67<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>67gcttttgagc tgattctcgc ccctcggtca aaagaatctg 40<210>68<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>68cagattcttt tgaccgaggg gcgagaatca gctcaaaagc 40
<210>69<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>69ccagaattcc cccttgcccc tccaaagaag aag33<210>70<211>33＜212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>70cttcttcttt ggaggggcaa gggggaattc tgg33<210>71<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>71cagaagaaag acgcaaggcc catgaagctg agg33<210>72<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>72cctcagcttc atgggccttg cgtctttctt ctg33<210>73
<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>73ggatcatcta tcggtcagac g 21<210>74<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>74tgggtcacat cctgctggat g 21<210>75<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>75gctcgtctga ccgatagatg atcc 24<210>76<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>76aaggatccgc gtggacaatg gctactcaag30<210>77<211>34
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>77ggactcgaga caggtcagta tcaaaccagg ccag 34<210>78<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>78aagaattctg ctggtgggtg aaaaaaaaat gc 32<210>79<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>79ctactcgagt tctaaagact tggtgacgag cgac 34<210>80<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>80aggaattcgt gcatcatggt cccaccacat catac 35<210>81<211>7
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>81ctttggc 7<210>82<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的探针序列<400>82gctttgattg tggtga 16<210>83<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的探针序列<400>83tcaccacaat caaagc 16<210>84<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的探针序列<400>84cccctttgaa cacctt 16<210>85<211>16<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工合成的探针序列<400>85aaggtgttca aagggg 16<210>86<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>86gcggaattca gggcccagag caggactg 28<210>87<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>87tagctcgagc taaaacttct atctgcggat gt 32<210>88<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>88atgtcctggc cgcgcc 16<210>89<211>16<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>89ggcgcggcca ggacat 16<210>90<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>90tacaggaccg gcgcgg 16<210>91<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>91atctggtccg gcgcgg 16<210>92<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸<400>92gttgcacagc gacgca 16<210>93<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<400>93aatgtgatct tctccaggtg c 21<210>94<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>94aaggacacca gtttctcgta g 21<210>95<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>95aaagagacgc tcatagcgac t 21<210>96<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>96aacgacggta aaatccgagc c 21<210>97<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>97aacgaaacac cgatgactgg g 21<210>98<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>98aatcaccgga ccacacacac a 21
<210>99<211>22<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>99aaaccttgcc tacgacatgt tt22<210>100<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>100aaaaggtttc cgttagcccc g 21<210>101<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>101gcatgctcca aagacctgtt 20<210>102<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>102agacttcatg atccaaggat 20<210>103<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>103tggcagccag ttctttgtgt 20<210>104<211>55<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>104caccaacgaa acaccgatga ctgggttcaa gagacccagt catcggtgtt tcgtt55<210>105<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>105aaaaaacgaa acaccgatga ctgggtctct tgaacccagt catcggtgtt tcgtt55<210>106<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>106caccaatcac cggaccacac acacattcaa gagatgtgtg tgtggtccgg tgatt55<210>107<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>107aaaaaatcac cggaccacac acacatctct tgaatgtgtg tgtggtccgg tgatt55<210>108<211>55<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>108caccaaacct tgcctacgac atgttttcaa gagaaacatg tcgtaggcaa ggttt55<210>109<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>109aaaaaaacct tgcctacgac atgtttctct tgaaaacatg tcgtaggcaa ggttt55<210>110<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>110caccaaaagg tttccgttag ccccgttcaa gagacggggc taacggaaac ctttt55<210>111<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列<400>111aaaaaaaagg tttccgttag ccccgtctct tgaacggggc taacggaaac ctttt5权利要求
1.选自下列的基本上纯的多肽(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8，其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有与由氨基酸序列SEQ IDNO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，且所述多肽具有与由SEQ ID NO2，4，6或8中任一氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
2.分离的多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
3.载体，其含有权利要求2的多核苷酸。
4.宿主细胞，其携有权利要求2的多核苷酸或权利要求3的载体。
5.产生权利要求1的多肽的方法，所述方法包括下述步骤(a)培养权利要求4的宿主细胞；(b)使宿主细胞表达所述多肽；和(c)收集所表达的多肽。
6.抗体，其与权利要求1的多肽结合。
7.多核苷酸，它与权利要求2的多核苷酸或其互补链互补，并且含有至少15个核苷酸。
8.反义多核苷酸或小的干扰RNA，其针对权利要求2的多核苷酸。
9.权利要求8的反义多核苷酸，其选自含有核苷酸序列SEQ ID NO16，37，44和89的核苷酸。
10.权利要求8的小的干扰RNA，其有义链选自含有核苷酸序列SEQID NO93，94，95，96，97，98，99，100，101，102和103的核苷酸。
11.诊断细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步骤(a)检测样本的生物样品中编码氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8的基因的表达水平；和(b)将对表达水平的评价与疾病相关联。
12.权利要求11的方法，其中通过选自下列的任一种方法检测表达水平(a)检测编码氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8的mRNA；(b)检测含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8的蛋白质；和(c)检测含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8的蛋白质的生物活性。
13.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)使受试化合物与选自下列的多肽接触(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8，其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有与由氨基酸序列SEQ IDNO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性；(b)检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；和(c)选择与所述多肽结合的化合物。
14.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤a)使候选化合物与细胞接触，所述细胞表达一种或多种由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸；和b)选择与缺乏受试化合物时检测到的表达水平相比，能降低一种或多种由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸的表达水平的受试化合物。
15.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)使受试化合物与选自下列的多肽接触(1)多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8的；(2)多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8，其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有与由氨基酸序列SEQ IDNO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(3)多肽，由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性；(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和(c)选择与缺乏受试化合物时检测到的生物活性相比，能抑制所述多肽生物活性的化合物。
16.权利要求15的方法，其中生物活性是细胞-增殖活性。
17.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤a)使候选化合物与已导入载体的细胞接触，所述载体含有一或多种标记基因的转录调节区和在转录调节区控制之下表达的报道基因，其中一或多种标记基因含有选自SEQ ID NO1，3，5或7的任一核苷酸序列，b)测定所述报道基因的活性；和c)选择与对照相比能降低所述报道基因的表达水平的化合物。
18.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)构建在报道基因上游含有APCDD1的两个Tcf/LEF结合基元的载体；(b)用步骤(a)的载体转化细胞；(c)在β-连环蛋白/Tcf4复合物的存在下，使受试化合物和与步骤(b)的细胞接触；(d)检测报道基因的表达；和(e)选择与缺乏受试化合物时相比，能抑制报道基因表达的受试化合物。
19.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)在受试化合物存在的情况下，使选自下列的多肽与驿蛋白或SNW1接触(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO6；(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO6且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO6组成的蛋白质等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在严紧条件下与由SEQ ID NO5的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO6组成的多肽等同的生物活性；(b)检测多肽与驿蛋白或SNW1之间的结合；和(c)选择能抑制所述多肽与驿蛋白或SNW1之间的结合的受试化合物。
20.权利要求11至19中任一项的方法，其中细胞-增殖性疾病是癌症。
21.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对编码选自下列之多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
22.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的抗选自下列之多肽的抗体(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
23.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的通过权利要求13至19中任一项的方法选择的化合物。
24.权利要求21至23中任一项的组合物，其中细胞增殖性疾病是癌症。
25.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的针对编码选自下列之多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述具有与由氨基酸序列SEQID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
26.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的抗选自下列之多肽的抗体的步骤(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
27.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的通过权利要求13至19中任一项的方法选择的化合物的步骤。
28.权利要求25至27中任一项的组合物，其中细胞增殖性疾病是癌症。
29.治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的步骤(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽或其片段具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，所述多肽由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
30.诱导抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括使选自(a)-(c)的多肽与抗原呈递细胞接触或将编码所述多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞的步骤(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，所述多肽由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
31.权利要求30的诱导抗肿瘤免疫力的方法，其中所述方法还包括给受试者施用抗原呈递细胞的步骤。
32.治疗或预防癌症的药物组合物，所述组合物含有药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8；(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8且其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的蛋白质等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，所述多肽由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQID NO1，3，5或7组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO2，4，6或8组成的多肽等同的生物活性。
33.权利要求32的药物组合物，其中多核苷酸被掺入表达载体。
全文摘要
本申请提供了新的人基因WDRPUH和KRZFPUH以及PPIL1，与相应的非癌组织相比，所述基因分别在绝大多数HCC和结肠癌中有显著提高的表达，本申请还提供了新的人基因APCDD1，它在原发性结肠癌中的表达提高，将野生型APC1转导至结肠癌细胞后，APCDD1的表达被下调。所述基因和由其编码的多肽可用于例如诊断细胞增殖性疾病，并用作开发针对所述疾病的药物的靶分子。
文档编号C07K14/47GK1675360SQ0381894
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月4日 优先权日2002年6月6日
发明者中村佑辅, 古川洋一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司, 国立大学法人东京大学