专利名称：用于研究肝细胞癌上皮间质样变的动物模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及构建一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型， 本发明也可成为针对肝癌细胞上皮间质样变过程的靶向抗肿瘤药物研发的理想验证平台。
背景技术：
原发性肝癌是高度恶性的肿瘤之一，其死亡率位于我国恶性肿瘤的第二位。绝大多数肝癌病人死亡与肝癌复发、转移相关。研究表明肝癌复发、转移是多基因参与、多步骤完成复杂过程，包括肿瘤细胞粘附、迁移和肿瘤细胞对细胞外基质的降解等，目前，其发生的分子机制尚不完全清楚，进一步探索研究肝癌复发、转移分子机制，对设计靶向药物、改善肝癌患者预后及提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。近年来肿瘤细胞转移过程中常出现上皮细胞间质样转变(EMT)受到关注。上皮细胞间质样转变是指具有极性的上皮细胞转换成为活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，在动物胚胎发育过程中普遍存在。当前认为90%以上的上皮细胞恶性肿瘤在发生侵袭与转移过程中发生上皮细胞间质样转变，例如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺、肝癌等。上皮细胞间质样转变以上皮细胞标记缺失，如上皮型钙粘素(E-cadherin)、β 连环蛋白(β-catenin)和角质蛋白18 (cytokeratin 18)等及间叶组织标记的获得，如波形蛋白(Vimentin)，神经型钙粘素(N-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)等为重要特征，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，具体包括细胞粘附分子的表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变。这种表型的转换使得肿瘤细胞容易摆脱细胞-细胞间黏附，并具有更强的穿透和游走能力， 因此上皮间质样改变与肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切。研究肿瘤上皮间质样改变的发生过程和调控机制，针对上皮间质样改变发生过程设计靶向药物对于恶性肿瘤的干预及治疗具有重要意义。上皮间质样改变与原发性肝癌侵袭和转移的关系及其分子机制已成为目前肝癌研究的热点。这些研究常包括上皮间质样改变相关基因表达的改变引起肝癌细胞形态改变的体外研究，然后通过裸鼠接种体内验证上皮间质样改变相关基因的表达改变，最后在临床肝癌标本中证实上皮间质样变的现象。目前应用较为广泛的用于研究上皮间质样改变的动物模型是肝癌细胞皮下接种法，这种方法虽然简单易行，但与肝癌复发转移的临床生理、 病理相差甚远，因此不能真实反映肝癌转移中上皮间质样改变的作用。近年来，研究者尝试用经腹盲目穿刺原位接种法制造动物模型，但这种方法具有穿刺成功率低，容易出血，腹腔播散较多等缺点。而且现有的动物模型只反映肝癌侵袭转移过程中某一时点的上皮间质样改变现象，与上皮间质样改变是一个动态的过程相违背，因此这些研究不能确切反映上皮间质样改变与肝癌侵袭转移的关系。构建能符合肝癌转移临床特点、体现上皮间质样改变动态发生过程的肝癌原位动物模型是获得可靠结果的前提和基础。然而，目前尚缺乏这样的动物模型。
发明内容
本发明的目的在于解决肿瘤细胞侵袭转移过程中发生的上皮间质样改变难以观察的问题，开发一种简单易行、能广泛推广应用的、成功率高的、可真实模拟肝癌临床的原位移植瘤上皮间质样变动态发生过程的一种动物模型构建的方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。所述的实验动物为BALB/c裸鼠。所述的超声设备为配备有高频(5-12MHZ)探头的彩色多普勒超声设备。所述的肝脏原位接种肿瘤细胞的方法为肝实质注射肝癌细胞。所述的动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况的方法为接种后第一周开始，每隔一周处死动物，直到接种后第六周；将处死的动物解剖、取出肝脏及肺脏，脱水包埋成蜡块；将肝脏切片，免疫组织化学染色检测不同时期肝癌组织及癌旁组织中上皮间质样变相关指标变化，将肺脏连续切片，计数肺转移率和转移病灶数。所述的免疫组织化学染色方法为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP 法)。所述的上皮间质样变相关指标为上皮型钙粘素(E-cadherin)、神经型钙粘素 (N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin), α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)和Snail蛋白中的一种或几种。所述的肺转移灶计数方法为肺连续切片，经苏木精-伊红染色(HE)，显微镜下观察计数肺转移率和病灶转移数。本发明采用在高频彩色多普勒引导下将肿瘤细胞注入肝实质，隔周处死实验动物，原位移植肿瘤、癌旁组织及肺包埋蜡块切片，通过对上皮间质样变的相关指标进行免疫组织化学染色和肺连续切片来观察肝细胞癌经历上皮向间质样细胞转变的动态过程及转移情况，该模型可为研究肝癌细胞上皮间质样改变机制和验证新的抗上皮间质样改变靶向治疗提供平台。本发明具有如下优点
(1)制作过程简单易行，成功率高，能广泛推广应用；
(2)制作的动物模型能真实地模拟临床肝癌转移的病理过程；
(3)制作的动物模型能动态反映肝癌细胞上皮间质样改变发生过程。
图1为接种后第一周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图2为接种后第二周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达
图3为接种后第三周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达
图4为接种后第四周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图5为接种后第五周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达
图6为接种后第六周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1
(1)取BALB/c裸鼠(4-6周，雄性)作为实验动物，每组5只裸鼠，用1.5% (1.5克溶于 IOOml双蒸水中)戊巴比妥钠(40mg/kg，国药集团产品，货号B1202)腹腔注射麻醉；
(2)将Matrigel基质膜(BD公司产品，货号3M234)和无血清高糖DMEM(GIBIC0公司产品，货号11995081)按体积比1 :1混合，分别用上述混合溶液将8X IO6个对数生长期肝癌细胞HCCIiO-control (HCCLM3细胞转染慢病毒空载体，HCCLM3细胞为复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用；慢病毒空载体为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号 GC080357)、shRNA-CD151-HCCLM3 (HCCLM3 细胞转染干扰 CD151 表达质粒的慢病毒，HCCLM3 细胞复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用；干扰CD151表达质粒的慢病毒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC080357)、shRNA- α 6-HCCLM3 (HCCLM3细胞转染干扰整合素α 6表达质粒的慢病毒，HCCLM3细胞复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用，干扰整合素α 6表达质粒的慢病毒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC92064)、 H印G2-control(H印G2细胞转染慢病毒空载体，IfepG2细胞为ATCC产品，货号HB8065，慢病毒空载体为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC080357)和H印G2-CD151 (HepG2 细胞转染以慢病毒为载体的过表达⑶151质粒，!fepG2细胞系ATCC产品，货号HB8065，慢病毒为载体的过表达⑶151质粒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC921783)定容成50ul ；
(3)将裸鼠仰卧，固定于平板上，75%酒精消毒皮肤，用无菌纱布铺巾，用配备有高频 (5-12MHZ)探头的彩色多普勒超声设备(Aloka公司产品)对裸鼠肝脏定位，在超声波引导下经剑突下0. 5cm用0. 4mm针头刺入肝实质，潜行0. 5cm后注射上述肿瘤细胞溶液50ul，拔出穿刺针，用干棉签在穿刺点向肝脏方向按压5分钟，超声波确认穿刺点周围无明显积液；
(4)在无特定病原体(SPF级)的环境下饲养，从接种后第一周到六周每隔一周用1.5% (1. 5克溶于IOOml双蒸水中)戊巴比妥钠(40mg/kg，国药集团产品)腹腔注射麻醉处死实验动物，解剖、取出肝脏及肺脏，用10%福尔马林(IOml福尔马林溶入IOOml生理盐水中)固定，脱水包埋成蜡块；
(5)肝脏肿瘤及癌旁组织蜡块切成4um厚的连续切片，用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)染色烤片68°C，20分钟；常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水二甲苯I 20分钟，二甲苯II 20分钟，100%酒精I 10分钟，100%酒精II 10分钟，95%酒精5分钟， 80%酒精5分钟，70%酒精5分钟；阻断灭活内源性过氧化物酶3%双氧水(H2O2) 37°C孵育 10分钟，ρΗ7· 0磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5分钟；抗原修复置0. 01M(0. Olmmol 枸橼酸融入1升双蒸水)枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中煮沸(95°C，15-20分钟)，自然冷却20分钟以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PH7. 0磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 10%正常羊血清工作液(中杉生物产品，货号ZLI-9022 )封闭，37°C，10分钟，倾去勿洗；滴加一抗(兔抗人上皮型钙粘素多克隆抗体，AbCAM公司产品，货号abl5148，l :250稀释；兔抗人 α平滑肌肌动蛋白多克隆抗体，AbCAM公司产品，货号ab5694，1 :500稀释；兔抗人Snail 多克隆抗体，AbCAM公司产品，货号ab85931，1 :300稀释)4°C冰箱孵育过夜，pH7. 0磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5分钟(用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照);滴加生物素标记二抗 (中杉生物产品，货号zb2030，1 2000稀释)，37°C孵育30分钟，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5分钟；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液(中杉生物产品，货号zbM04， 1 :2000稀释)，37°C孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟；二氨基联苯胺(DAB，迈新生物产品，货号C0009，A、B、C各一滴，加入0. 85ml磷酸盐缓冲液中现配现用，30分钟内有效) 反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素(中杉生物产品，货号ZLI-9039)复染，常规脱水，透明，干燥，封片。检测不同时间点肝癌组织及癌旁组织中上皮型钙粘素、α平滑肌肌动蛋白和Snail蛋白等与上皮间质样变密切相关指标的表达，来观察肝癌细胞上皮间质样变的动态变化过程(阳性染色判断标准和定位显微镜下观察棕黄色为强阳性，淡黄色为阳性，无染色为阴性；上皮型钙粘素定位于肿瘤细胞胞浆，α平滑肌肌动蛋白表达与肿瘤细胞胞浆和外基质，Snail定位于肿瘤细胞胞核和细胞浆)；
(6)肺包埋石蜡块进行连续切片，苏木精-伊红染色，(切片脱蜡、复水二甲苯I 20分钟，二甲苯II 10分钟，100%、95%、90%、80%、70%各级酒精，每级5分钟；苏木素液(中杉生物产品，货号ZLI-9039)染5分钟；流水洗3分钟，1 %盐酸酒精(1 :100体积)中蘸3下，流水冲洗20分钟使切片由淡红色变为灰兰色；伊红染液(中杉生物产品，货号ZLI-9044)5分钟； 脱水、透明70%、80%、90%的酒精中每级各蘸3下，再经95%、100% I、100% II梯度酒精，每级各5分钟。二甲苯I、二甲苯II分别透明10分钟；封片组织切片上滴加适量树胶(中杉生物产品，货号ZLI-9555)，加盖玻片封固)。用Leica DFC420相差显微镜采集图像，计数肺转移病灶数，肺转移灶计数方法为肺石蜡块连续切片，经苏木精-伊红染色(HE)，显微镜下观察计数肺转移灶。 如图1所示，为接种后第一周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图。肝癌细胞接种后第一周，所有移植瘤中上皮型钙粘素呈强阳性表达，而 α平滑肌肌动蛋白和Snail呈阴性表达，说明无上皮间质样改变发生。如图2所示，为接种后第二周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图；接种后第二周HCCLM3对照组细胞(HCCIiO-control)开始侵袭正常肝脏组织和细胞外基质，侵袭的肿瘤细胞显示α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)和细胞核内Snail强阳性表达，而上皮型钙粘素(E-cadherin)表达很弱，其余各组则呈现强阳性表达上皮型钙粘素(E-cadherin)，而 α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)和Snail呈阴性表达，说明HCCIiO-control最先发生上皮间质样改变；如图3所示，为接种后第三周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图；接种后3周通过转染过表达⑶151的!fepG2细胞(!fepG2-⑶151)在肿瘤与癌旁交界处开始出现间质样细胞，S卩α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞核内Snail 强阳性表达，而上皮型钙粘素表达(E-cadherin)很弱，肿瘤细胞向正常肝组织侵袭，说明 !fepG2-⑶151开始发生上皮间质样改变。如图4所示，为接种后第四周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图；接种后4周HCCLM3_control和H印G2-CD151组α平滑肌肌动蛋白和细胞核内Snail强阳性表达，而上皮型钙粘素(E-cadherin)表达很弱，而 HCCLM3-shCD151，HCCLM3_sh α 6 和 H印G2_control 组上皮型钙粘素(E-cadherin) 呈强阳性表达，而α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Snail呈阴性表达。如图5所示，为接种后第五周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图；接种后第5 周通过转染干扰CD151或整合素α 6的HCCLM3细胞(HCCLM3_shCD151，HCCLM3_sh α 6)开始形成肿瘤，并表现出侵袭的特性，S卩α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞核内Snail强阳性表达，而上皮型钙粘素(E-cadherin)表达很弱。如图6所示，为接种后第六周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图，转染空载体的H印G2_对照组 (HepG2-control)到接种后6周始终未出现间质样细胞，即上皮型钙粘素(E-cadherin)呈强阳性表达，而α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)和Snail呈阴性表达。肺转移计数显示HCCLM3对照组(HCCLM3_control)的肺转移率为100% (5/5)， 转移病灶数平均为M7士65个；转染干扰CD151的HCCLM3细胞(HCCLM3-shCD151)的肺转移率为40% 0/5)，转移病灶数平均为114士46个；转染干扰整合素α 6的HCCLM3细胞 (HCCLM3-sha 6)的肺转移率为40% 0/5)，转移病灶数平均为119士21个；通过转染过表达 CD151的H印G2细胞(!fepG2-CD151)的肺转移率为60% (3/5)，转移病灶数平均为145士43 个；而转染空载体的H印G2-对照组(!fepG2-C0ntr0l)的肺转移率为0% (0/5)，转移病灶数为0个。本发明采用肝脏原位接种肿瘤细胞，与传统的构建方法相比，更符合肝癌临床实际，能客观反映肺的转移率和转移病灶数；其次以往研究上皮间质样改变的传统肝癌转移动物模型，多盲目取某一时间点来反映肝癌细胞上皮间质样改变的特点，这与上皮间质样改变是一个动态的过程相违背，本发明采用逐周处死动物来观察上皮间质样改变发生的动态过程，更符合上皮间质样改变的病理过程。
权利要求
1.一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于， 取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。
2.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的实验动物为BALB/c裸鼠或非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠。
3.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的超声设备为配备有高频探头的彩色多普勒超声设备。
4.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的肝脏原位接种肿瘤细胞的方法为肝实质注射肝癌细胞。
5.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况的方法为接种后第一周开始，每隔一周处死动物，直到接种后第六周；将处死的动物解剖、取出肝脏及肺脏，脱水包埋成蜡块；将肝脏切片，免疫组织化学染色检测不同时期肝癌组织及癌旁组织中上皮间质样变相关指标变化，将肺脏连续切片，计数肺转移率和转移病灶数。
6.如权利要求5所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的免疫组织化学染色方法为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
7.如权利要求5所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的上皮间质样变相关指标为上皮型钙粘素、神经型钙粘素、波形蛋白、 α平滑肌肌动蛋白和Snail蛋白中的一种或几种。
8.如权利要求5所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的肺转移灶计数方法为肺连续切片，经苏木精-伊红染色，显微镜下观察计数肺转移率和病灶转移数。
全文摘要
本发明提供了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。本发明具有如下优点制作过程简单易行，成功率高，能广泛推广应用；制作的动物模型能真实地模拟临床肝癌转移的病理过程；制作的动物模型能动态反映肝癌细胞上皮间质样变发生过程。
文档编号G01N33/48GK102178568SQ20111004326
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者周俭, 施国明, 柯爱武, 樊嘉, 黄晓勇 申请人:复旦大学附属中山医院