专利名称：：酸性核磷酸蛋白pp32用作肝细胞癌标志物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，涉及一种酸性核磷酸蛋白PP32用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术：
：肝细胞癌是世界范围内第四位常见的恶性肿瘤，也是我国第二位常见恶性肿瘤，每年大约有250，000名患者死于肝细胞癌。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义，寻找新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。B.个生tl^SlSSpp32(Acidicnuclearphosphoproteinpp32；Acidicleucine—richnuclearphosphoprotein32familymemberA；Potentheat-stableproteinphosphatase2AinhibitorIlPP2A；Leucine—richacidicnuclearprotein,Lanp；PutativeHLA-DR-associatedproteinI，PHAPI；Mapmodulin)白勺NCBI白勺Ι》NP_006296,Swissprot登录号为P39687，IPI号为IPI00025849.1(human3.28version)。酸性核磷酸蛋白PP32是蛋白磷酸酶2A和组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，参与一系列生理过程，包括增殖、分化、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-依赖以及非依赖的细胞凋亡等，具有抑制肿瘤发生的作用。在现有研究中，仅由Kadkol等发现pp32在II级和III级前列腺癌中高表达(Novelnuclearphosphoproteinpp32ishighlyexpressedinintermediate—andhigh-gradeprostatecancer.Prostate34(3):231_7)。此外，未发现有关于酸性核磷酸蛋白pp32与其他癌症，特别是与肝细胞癌的相关性的报道。
发明内容通过筛选在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为酸性核磷酸蛋白PP32。免疫印迹实验证实，酸性核磷酸蛋白PP32的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。利用人肝细胞癌细胞株H印G2和人正常肝细胞株L02进行的免疫荧光实验，证明酸性核磷酸蛋白PP32在这两种细胞株间存在差异表达(在人肝细胞癌细胞株H印G2中表达上调)。通过对62对人肝细胞癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验进一步证实了酸性核磷酸蛋白PP32在人类肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。基于酸性核磷酸蛋白pp32与肝细胞癌的这种相关性，pp32可以作为一种蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。因此，本发明的首要目的即在于提供一种酸性核磷酸蛋白pp32用作检测肝细胞癌的应用。本发明提供的酸性核磷酸蛋白PP32的应用为，作为用于检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物。本发明的另一个目的在于提供一种酸性核磷酸蛋白PP32的抗体的应用。本发明提供的酸性核磷酸蛋白pp32的抗体的应用为，用于制备检测肝细胞癌的制剂和/或用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。根据本发明，抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝组织中酸性核磷酸蛋白PP32的表达是否异常的方法。本发明提供的方法为检测待测肝组织中酸性核磷酸蛋白PP32的数量，并与正常肝组织中的酸性核磷酸蛋白PP32的数量进行比较。鉴于到目前为止，还没有酸性核磷酸蛋白pp32与肝细胞癌的相关性报道。因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。图1为酸性核磷酸蛋白pp32的免疫印迹检测结果，其中，泳道1-6为肝细胞癌组织的检测结果，泳道1’-6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。图2为对图1的免疫印迹图谱进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图，其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织。图3为酸性核磷酸蛋白pp32的免疫荧光实验结果，其中，Al为!fepG2细胞中pp32的分布情况，A2为!fepG2的细胞核，A3为Al和A2的叠加图，Bl为L02细胞中pp32的分布情况，B2为L02的细胞核，B3为Bl和B2的叠加图。图4为酸性核磷酸蛋白pp32的免疫组织化学实验结果，其中，A为肝细胞癌的癌组织的检测结果，B为癌旁组织的检测结果，物镜放大倍数为20倍。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3_胆酰胺丙基)_二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98%)购自剑桥同位素实验室；透析胎牛血清购自Gibco公司；D9785细胞培养粉末、β-巯基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencinggrade)购自Promega公司；SCX柱禾ΠSAX柱以及PH缓冲液试剂盒购自ColumnTechnology公司；!fepG2细胞株和L02细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞研究所的细胞库。在本发明的下述实施例中，使用的溶液/培养基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，ImMEDTA,苯甲异恶唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL,两性霉素B0.25mg/mL,制霉菌素50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4%CHAPS、40mmol/LTris和65mmol/LDTT。裂解缓冲液8mol/L尿素，40mmol/LTris,65mmol/LDTT。TBST=Tris2.42g/L，氯化钠8g/L,Tween_201ml/L，用HCl调节pH到7.6。本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymaticsamplepreparation,NESP)制备了肝细胞癌的癌组织与癌旁组织的蛋白质样品，并采用CDIT技术结合溶液内酶解及阴阳多维液相色谱串联质谱的蛋白质组学标记定量技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较其表达量，结果发现酸性核磷酸蛋白PP32在肝细胞癌组织中上调表达。免疫印迹实验、免疫荧光实验和免疫组织化学实验均证明酸性核磷酸蛋白PP32的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达。因此，以酸性核磷酸蛋白pp32作为一个蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌，即酸性核磷酸蛋白PP32可以用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。实施例1、肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备从东方肝胆外科医院获取5例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，该5例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，5例患者的病理资料如表1所示。表1、5例肝细胞癌患者的病理资料权利要求一种酸性核磷酸蛋白pp32的应用，其特征在于，所述应用为用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记是检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表达量。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表达量是检测这种蛋白质在肝细胞组织中是否均存在上调表达。4.一种抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的制剂。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。6.一种抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。8.—种体外检测肝组织中酸性核磷酸蛋白pp32的表达是否异常的方法，其特征在于，所述方法为检测待测肝组织中酸性核磷酸蛋白PP32的数量，并与正常肝组织中的酸性核磷酸蛋白PP32的数量进行比较。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测为使用抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体进行检测。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗酸性核磷酸蛋白pp32的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。全文摘要本发明提供了一种酸性核磷酸蛋白pp32的应用。本发明提供的酸性核磷酸蛋白pp32的应用为酸性核磷酸蛋白pp32作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。酸性核磷酸蛋白pp32在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。文档编号G01N33/577GK101995473SQ20091005678公开日2011年3月30日申请日期2009年8月21日优先权日2009年8月21日发明者徐孟杰,曾嵘,李辰,武祎,阮宏强申请人:中国科学院上海生命科学研究院