用于在肝细胞癌中预后整体存活和无复发存活的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肝细胞癌（HCC)管理的技术领域，并且更准确地涉及HCC侵袭性的预 后和相关治疗决策。本发明提供HCC侵袭性的新预测方法，基于体外确定和分析包括基因 TAF9、RAMP3、HN1、KRT19以及RAN的表达谱。本发明还提供用于HCC侵袭性预后的试剂盒， 以及基于受试者HCC侵略性的初步预后在受试者中治疗HCC的方法。
【背景技术】
[0002] 肝细胞肿瘤是由肿瘤的异质组所组成，包括恶性肿瘤（肝细胞癌或HCC)和良性 (肝细胞腺瘤或HCA、局灶性结节性增生或FNH、以及再生大结节（macronodule)肿瘤。
[0003] HCC构成在亚洲和非洲的主要健康问题，主要是由慢性乙肝病毒感染率高来解释， 但在西方国家其发生率也在不断升高，其中90%以上的HCC发生于肝硬化。在西方国家中， 构成肝脏疾病的主要原因是慢性乙型和丙型肝炎以及酒精消耗。作为代谢综合征的后果， 非酒精性脂肪性肝炎也是慢性肝病和HCC增加的原因。更罕见的（约10%的病例），HCC发 生于非肝硬化。
[0004] 手术切除代表HCC重要的治愈性治疗，但受高再发生率（5年50%至70% )和肿 瘤相关死亡（5 年 30%至 50% )影响（IshizawaTGastroenterology2008)。
[0005] 因此，需要允许预测或预后HCC患者的整体存活和早期肿瘤再发生的简单工具。
[0006] 事实上，根据患者HCC的侵袭性，所述患者的临床管理应当是不同的：
[0007] _在侵袭性低的情况下（即总存活和早期再发生的预后良好），推荐仅随访；
[0008] -与之相反，在侵袭性高的情况下（即总体存活和早期再发生的预后不良），可以 推荐利用细胞毒性化疗（阿霉素或吉西他滨和奥沙利铂（oxaliplatine)联用）或靶向治 疗（索拉非尼）的辅助治疗。
[0009] 在这种背景下，基于受试者肝脏样本分子谱的简单预测工具将是非常有益的。
[0010] 有些基因如EPCAM(YamashitaT等人 2008;LeeJS等人，2006)和KRT19(LeeJS 等人，2006;DurnezA等人，2006)已经与HCC的预后相关。
[0011] 由手术后2年内肿瘤再发生所定义的早期再发生，主要与肿瘤生物学相关 (lmamuraHJh印atol2003)。本发明人以前描述了HCC分子分类为6个亚组（G1-G6)， 并已证明G3 亚组的HCC具有不良预后（BoyaultSHepatology2007;VillanuevaA Gastroenterology2011 ;W02007/063118A1)。HCC再发生和死亡相关的其他分子标签已 经公布，但其中几乎没有被外部验证（VillanuevaA,clinicalcancerres2010)。一 个验证的分子预后分类是已在石赌包埋组织中验证的G3标签（BoyaultSHepatology 2007VillanuevaA,gastroenterology2011)。此外，已在W02007/063118A1 中描述几个无 复发存活的预后标签（良好预后与术后头4年无复发相关，不良预后与术后头2年复发相 关）。
[0012] 与此相反，由手术后3年以上肿瘤再发生所定义的晚期再发生主要涉及到周围的 非肿瘤组织的特征（"致癌场效应"）。源自非肿瘤肝脏样本的196个基因的分子标签与晚 期再发生和总存活期相关联，并且可以被认为是构成肝硬化的严重程度和致癌能力的替代 标志（HoshidaY，NEJM，2008年）。此外，几个在5年中整体存活预后的标签（有或没有复 发）也已经在W02007/063118A1中得以描述。
[0013] 虽然上述现有技术的工具对于HCC侵袭性的预后有用，但仍需要用于验证和更强 大的肿瘤分子标记，以预测切除HCC的整体存活和早期复发。
[0014] 特别是，在考虑到不同的治疗管理选择取决于预后，至关重要的是用于进行此类 治疗决定的预后方法是高度灵敏和特异的，并显示出高的阳性预测值（PPV)、阴性预测值 (NPV)和准确度（如R0C曲线或AUG下的面积测得的）。
[0015] 此外，如果独特分子标签能够预测整体存活和早期再发生两者，这将对临床医生 非常有用。在这方面，我们注意到在现有技术中所描述的预后工具对于预后整体存活和早 期再发生总是不同的。值得注意的是，在W02007/063118A1中公开的整体存活（即总体存 活）和无复发存活的最佳预测值（其还预测早期再发生）是不同的，这对临床医生而言不 适用。
[0016] 此外，许多试图确定HCC预后的分子标签的研宄是根据患者群的具体病因（如HBV 或HCV相关的HCC，见NaultJC，semliverdis2011，WooHGgastroenterology2011，Hsu HCAmJpathol2000)，以及在这种群（cohort)鉴定的分子标签的普遍适用性可能被质 疑，并在任何情况下需要在其它HCC病因的患者中进一步验证。
[0017] 因而仍然需要简单且高度可靠的预后工具，这将允许预测整体存活和早期再发生 两者，并会显示出高灵敏度、特异性、PPV、NPV和准确性。
[0018] 基于从各个HCC样本获得的微阵列数据分析的新策略，本发明人构建了满足上述 标准的简单而可靠的分子预后工具：
[0019] ?它使用起来非常简单，因为它允许同时预测总存活率和早期再发生。此外，只有 5个基因的表达水平分析是预后所必须的，这也有助于在测试的简便性；以及
[0020] ?它是高度可靠的，因为在119例患者验证群中，用来预测肿瘤相关死亡的曲线 (AUC)下时间依赖面积达到0.80。包括在内的大量患者以及其HCC肿瘤的各种病因进一步 保证了测试的可靠性和普遍适用性。特别是，预后独立于肝硬化背景、肿瘤尺寸及病理特 征。
【发明内容】
[0021] 因此，本发明涉及从患有HCC受试者的肝脏样本中体外预后所述受试者的整体存 活和/或无复发存活的方法，所述方法包括：
[0022] a)从所述肝脏样本体外确定表达谱，所述表达谱包含或由下列5个基因组成： TAF9、RAMP3、HN1、KRT19和RAN，和任选的一种或多种内参基因，或其等效表达谱；以及
[0023] b)使用用至少一个参考HCC肝脏样本校准的算法，基于所述表达谱预后整体存活 和/或无复发存活。
[0024] "受试者"是指无论性别或年龄的任何人类受试者。所述受试者患有HCC，并优选 已经过外科肝肿瘤切除术。
[0025] 根据本发明，HCC进展的"预后"是指特定HCC肿瘤相对于患有此特定HCC肿瘤患 者的未来进展预测。根据本发明的方法允许同时进行整体存活预后和无复发存活预后两 者。
[0026] 通过"整体存活预后"是指有或无复发的存活预后。如前所述，针对HCC目前主要 的治疗是肿瘤手术切除。结果是，"不良整体存活预后"定义为肝切除后3年内死亡发生，而 "良好整体存活预后"定义为术后在5年期间没有死亡。
[0027] 由"无复发存活预后"是指没有任何复发或再发生的存活预后。"无复发不良存活 预后"被定义为肝切除后两年内肿瘤复发的存在，而"无复发良好存活预后发"是指在术后 4年内没有复发。通过"复发"或"再发生"，它意思为初次治疗后，一般指通过肿瘤手术切 除，在相同受试者中长回HCC。
[0028] 在根据本发明上述方法中，参考样本用于以校准算法，其随后可以用来以预测整 体存活和/或无复发存活。在