吡唑类衍生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及吡唑类衍生物及其制备方法与制药用途。
【背景技术】
[0002] 乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B)，简称乙肝(Hepatitis B)，是由乙型 肝炎病毒(HBV)所致的重大传染性疾病，长期发展可导致急慢性病毒性肝炎、重型肝炎、肝 硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。据世界卫生组织(WHO)报道，全 球近20亿人曾感染过HBV，其中约3.5亿人为慢性HBV感染者，平均每年约有100万人死于HBV 感染所致的急、慢性肝炎及相关并发症。目前用于预防和治疗慢性乙型肝炎(CHB)的药物主 要有疫苗、干扰素、免疫调节药以及DNA聚合酶抑制剂。但是由于它们存在耐药性、副作用、 停药后反弹和不能彻底的清除乙肝病毒等缺点，因此发现和研究新的安全、高效、低毒和抗 耐药性的非核苷类乙肝病毒抑制剂显得至关重要。
[0003] 杂环化合物是发现药物活性先导物的重要源泉。取代吡唑作为结构独特的一类杂 环"优势结构"，具有广泛的生物活性。它可以作为构成药效团的基本结构母核，以适合药物 特殊作用靶点的空间要求;还可以作为活性取代基或环系的组成部分而产生相应的生物活 性;另外杂环具有较好的体内代谢稳定性及生物相容性，对发现高效广谱、生物利用度好的 新型抗HBV药物具有重要意义。
[0004] 本发明基于噻唑类乙肝病毒抑制剂药效团模型和活性构象，采用分子杂合和电子 等排药物设计策略，设计合成了一系列吡唑类化合物，此类化合物在现有技术中未见相关 报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了吡唑类衍生物及其制备方法。本发明还提供 了上述化合物作为非核苷类HBV抑制剂的活性筛选结果及其应用。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -.吡唑类衍生物
[0008] 本发明涉及的吡唑类衍生物，具有如下通式I所示的结构：
[0010] 其中，
[0011] R1为含取代基的苯环或芳杂环；
[0012] R2为烷基、苄基或不同链长度的酯基；
[0013] X 为NH、S或 CH2;
[0014] R3为羧基、酯基或不同取代基的酰胺。
[0015] 根据本发明优选的，通式I中，R1为不同取代基的苯环或噻唑环;R2为饱和烷基、苄 基或丁酸乙酯;X为〇、NH或CH 2;R3为甲酸、甲酸乙酯、环丙酰胺、不同取代基的苯酰胺、不同取 代基的苄酰胺。
[0016] 进一步优选的，吡唑类衍生物是具有下列结构的化合物之一：
[0017] 表1.化合物1-50的结构式
[0023] 二.吡唑类衍生物的制备方法
[0024] 本发明吡唑类衍生物的制备方法为下列之一：
[0025] 1.吡唑类衍生物的制备方法，步骤如合成路线1:以乙氧甲叉氰乙酸乙酯la为初始 原料，首先在醋酸和水的混合溶液中经过醋酸钠的催化与不同的芳香肼反应得到中间体lb 粗品，然后lb与溴化亚铜、2-甲基-2-硝基丙烷经重氮化反应得到中间体Ic，Ib或Ic与不同 取代基发生亲核取代反应生成不同的目标化合物Id;接着，在碱性条件下发生水解反应生 成中间体Ie，Ie与不同取代的胺发生酰化反应得到目标产物If。
[0026] 合成路线1如下：
[0027]
[0028] 试剂及条件：（i)醋酸钠，醋酸，水，回流；（ii)溴化亚铜，乙腈，50°C;(iii)氢化钠、 碳酸钾或碳酸铯，不同的胺、醇或卤代烷，N，N_二甲基甲酰胺，30_80°C;(iv)氢氧化钠，乙 醇，水，四氢呋喃，50°C;(v)不同的胺，二氯甲烷，1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐 酸盐，1-羟基苯并三唑；
[0029] 其中，
[0030] R1为含取代基的苯环或芳杂环；
[0031] R2为烷基、苄基或不同链长度的酯基；
[0032] X 为 NH或 S;
[0033] R3为不同取代基的酰胺；
[0034] 所述的不同的胺为环丙胺，2，4-二氟苄胺；
[0035] 本发明所述的吡唑类衍生物的制备方法，具体制备步骤如下：
[0036] (1)取25mL圆底烧瓶，将不同取代基的肼盐酸盐Ial.59mmol溶于3mL乙酸中，加入 lmL水，醋酸钠3.49mmol回流4h;反应结束后冷却至室温，加入20mL冰水中；乙酸乙酯萃取三 次，合并有机相，30mL饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速制备色谱 硅胶柱分离获取纯品lb;
[0037] (2)取25mL圆底烧瓶，将中间体lb 0.8mmo 1溶于乙腈5mL中，加入溴化亚铜，冷却至 〇°C，缓慢加入亚硝酸叔丁酯2.17mmol，50°C搅拌过夜。反应结束后冷却至室温，加50mL水淬 灭；乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，50mL饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法 上样，快速制备色谱硅胶柱分离获取纯品Ic;
[0038] (3)取25mL圆底烧瓶，将中间体lb 1.12mmol溶于5mL DMF中，加入碳酸钾、碳酸铯 或者氢化钠，室温搅拌5min;加入不同的卤代烷1.35mmol，室温搅拌过夜。反应结束后加入 50mL水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法 上样，快速制备色谱硅胶柱分离获取纯品Id;
[0039] 取25mL圆底烧瓶，将中间体Ic 0.64mmol溶于5mL DMF中，加入60%NaH 0.77mmol， 室温搅拌5分钟;缓慢加入不同的硫醇等试剂，室温搅拌过夜。反应结束后加入50mL水，乙酸 乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速制 备色谱硅胶柱分离获取纯品Id;
[0040] (4)取25mL圆底烧瓶，将中间体Id 0.74mmo 1溶于2mL乙醇、2mL水和2mL四氢呋喃的 混合溶液中，50°C加热反应过夜。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃和乙醇，加入30mL 氯化铵水溶液中和反应，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，20mL饱和食盐水洗一次，无水硫 酸钠干燥;浓缩，石油醚洗，重结晶得到纯品Ie;
[0041 ] (5)取25mL圆底烧瓶，将中间体Ie 0.19mmo 1溶于5mL二氯甲烷中，然后低温下缓慢 加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.25mmol和1-羟基苯并三唑0.25mmol， 搅拌10分钟；加入不同的胺，室温反应过夜。反应结束后加入30mL水，乙酸乙酯萃取三次，合 并有机相，20mL饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱 分离获取纯品If。
[0042] 2.吡唑类衍生物的制备方法，步骤如合成路线2:以碳酸二乙酯Ila为初始原料，首 先在醋酸和四氢呋喃的混合溶液中经过氢化钠的催化与不同的脂肪酮得到中间体lib粗 品，然后lib与N，N-二甲基甲酰胺缩二甲醇反应得到中间体II C，IIc与不同肼盐酸盐发生成 环反应生成不同的目标化合物lid;接着，在碱性条件下发生水解反应生成中间体lie，lie 与不同取代的胺发生酰化反应得到目标产物Ilf;
[0043] 合成路线2如下：
[0045]试剂及条件：（i)四氢呋喃，氢化钠，60°C ; (i i ) 100°C ; (i i i)乙醇，三乙胺；（iv)氢 氧化钠，乙醇，水，四氢呋喃，50°C; (v)N，N-二甲基甲酰胺，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N '， Ν'-四甲基脲六氟磷酸酯，三乙胺，室温；
[0046] 其中，
[0047] R1为含取代基的苯环或芳杂环；
[0048] R2为烷基；
[0049 ] R3为不同取代的苯基、苄基、苯胺或酚；
[0050]本发明所述的吡唑类衍生物的制备方法，具体制备步骤如下：
[0051 ] (1)取50mL圆底烧瓶，低温下将60%氢化钠11.98mmol溶于15mL四氢呋喃溶液中， 缓慢滴加不同的脂肪酮Ila 1.59_〇1溶于混合溶液中，室温搅拌半小时;低温下继续滴加 碳酸二乙酯14.98mmol于混合溶液中，60°C反应4小时。反应结束后冷却至室温，加入50mL冰 水中，加入1.5mL醋酸中和反应，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，30mL饱和食盐水洗一次， 无水硫酸钠干燥;浓缩得到粗品lib;
[0052] (2)取25mL圆底烧瓶，将中间体lib 5.81mmol溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺缩二甲 醇中100°C搅拌过夜;反应结束后减压蒸馏得到粗品lie;
[0053] (3)取25mL圆底烧瓶，将1.59mmol不同取代基的肼盐酸盐溶于6mL乙醇中，加入 1 · 90mmol中间体lie于混合溶液中，缓慢滴加三乙胺7 · 93mmol，室温搅拌过夜。反应结束后 冷却至室温，减压蒸馏除去部分乙醇，加入50mL水中；乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，30mL 饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离获取纯品 lid；
[0054] (4)取25mL圆底烧瓶，将中间体lid 0·69mmo 1溶于3mL乙醇、3mL水和3mL四氢呋喃 的混合溶液中，50°C加热反应过夜。反应结束后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃和乙醇，加入 30mL氯化铵水溶液，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗一次20mL，无水硫酸钠 干燥;浓缩，石油醚洗，重结晶得到纯品lie;
[0055] (5)取25mL圆底烧瓶，将中间体lie 0.38mmol溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后 低温下缓慢加入2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯0.46mmol，搅拌 10分钟；加入不同的胺及三乙胺0.76mmol，室温反应1小时;反应结束后加入30mL水，乙酸乙 酯萃取三次，合并有机相，20mL饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速 制备色谱硅胶柱分离获取纯品Ilf。
[0056] 三.吡唑类衍生物的应用
[0057]本发明公开了吡唑类衍生物抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑制剂的应用。通 过实验证明本发明的吡唑类衍生物可作为经典的HBV非核苷类抑制剂应用。具体地说，可以 作为HBV抑制剂用于制备抗乙肝药物。因此，本发明还提供吡唑类衍生物在制备抗HBV的药 物中的应用。
[0058]四.啦唑类衍生物的抗HBV活性和毒性实验
[0059] 对上述新合成的化合物(化合物的结构式见表1)运用酶联免疫法(ELISA)检测样 品药物达到抑制病毒HBeAg和HBsAg分泌的50%时的浓度数值为IC 5Q;运用MTT法检测样品药 物导致50%细胞毒性死亡的数值浓度为CC5Q值；用聚合酶链反应(PCR)检测药物抑制HBV DNA复制量的50%时的浓度数值IC 5Q，以拉米夫定作为阳性对照药。它们的抗HBV活性和毒性 数据列于表2中。由表2看出新合成的化合物部分呈现出较好抑制病毒HBeAg和HBsAg分泌活 性，大部分细胞毒性较低。
[0060] 本发明的吡唑类衍生物是一类结构新颖的非核苷类HBV抑制剂，可作为抗HBV的先 导化合物。
[0061] 本发明的吡唑类衍生物可作为非核苷类HBV抑制剂应用。具体地说，作为HBV抑制 剂用来制备抗乙肝药物。
[0062] 一种抗HBV药物组合物，包括本发明的吡唑类衍生物和一种或多种药学上可接受 载体或赋形剂。
[0063]本发明公开了吡唑类衍生物、其制备方法、抗HBV活性筛选结果及其作为抗HBV抑 制剂的首次应用。实验证明本发明的吡唑类衍生物可作为HBV抑制剂用于制备抗乙肝药物。
【具体实施方式】
[0064] 通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所 有目标化合物的编号与表1相同。
[0065] 合成路线：
[0067]实施例1.化合物44的制备方法
[0068] 取25mL圆底烧瓶，将3-氟苯肼盐酸盐(5g，30.52mmol)溶于45mL乙酸中，加入15mL 水，醋酸钠(5.68g，33.58mmol)，回流4h。反应结束后冷却至室温，加入200mL冰水中；乙酸乙 酯萃取三次(50mL X 3)，合并有机相，50mL饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法 上样，快速制备色谱硅胶柱（乙酸乙酯：石油醚=1:20)分离获取淡黄色固体3-氨基-1- (3-氟苯)-1!1-吡唑-4-甲酸乙酯(44)6.938，熔点为130-131°(3，收率为91%。
[0070]化合物44波谱数据:iH-NMRGOOMHz，CDC13)δρρπι: 7 · 79(s，1H)，7 · 51 ~7 · 45(m，1H)， 7.37~7.30(m，2H)，7.13~7.08(m，lH)，5.36(s，lH)，4.31(q，2H，J = 7.1Hz)，1.37(t，3H，J =7.1Hz);13C-匪R(100MHz，CDC13) :164.47,164.39,161.92,149.15,140.97,139.15， 139.04,131.10,131.01,118.88,188.85,115.11,114.90,111.41,111.17,96.57,59.78， 14.49；EI-MS:250.4[M+H] +.
[0071]实施例2.化合物1的制备
[0072] 取25mL圆底烧瓶，将化合物44 (280mg，1.12mmo 1)溶于5mL DMF中，加入碳酸钾 (466mg，3 · 36mmol)，室温搅拌5min;加入溴化节（230mg, 1 · 35mmol)，室温搅拌过夜。反应结 束后加入50mL水，乙酸乙酯萃取三次(25mL X 3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(50mL X 3 )，无水硫酸钠干燥;浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱（乙酸乙酯:石油醚=1:30)分离 获取浅黄色油状液体1280mg，收率为73%。
[0074] 化合物1 的波谱分析数据:iH-NMRGOOMHz，CDC13)δρρπι: 7 · 81 (s，1H)，7 · 43~7 ·4536 (m，2H)，7.32~7.27(m，lH)，7.25~7.22(m，3H)，7.12~7.07(m，lH)7.04(dd，2H，Jl = 2.0Hz,J2 = 7.6Hz) ,6.52(s,lH) ,4.29(q,2H,J = 7.2Hz) ,4.03(s,lH) ,1.34(t,3H,J = 7.2Hz);1