检测、诊断和治疗肝细胞癌(hcc)的方法

专利名称：：检测、诊断和治疗肝细胞癌(hcc)的方法
技术领域：
：本发明涉及检测并诊断肝细胞癌的方法以及治疗和预防肝细胞癌的方法。
背景技术：
：肝细胞癌是全球性的癌症死亡的主要原因之一。尽管近来在诊断和治疗策略上有进展，患晚期癌症的患者的预后仍很差。尽管分子学研究已经发现肿瘤抑制基因和/或癌基因的改变参与了癌发生，精确的机制仍不清楚。在从全基因组(genome-wide)角度理解肿瘤进展(progression)的潜在机制的努力中，为了发现用于诊断的靶标分子并开发新的治疗药物，本发明人用表示23,040个基因的cDNA微阵列对基因表达图谱进行分析(Okabe等，CancerRes612129-37(2001)；Kitahara等，CancerRes613544-9(2001)；Lin等，Oncogene214120-8(2002)；Hasegawa等，CancerRes627012-7(2002))。在这些研究过程中已经鉴定出了包括ESTs在内的数个基因，它们在癌组织中与相应的非癌性细胞相比呈现高频率上调。因为癌发生涉及癌基因的活化和/或肿瘤抑制基因的失活，这些上调基因中至少一些的增强表达会反映致癌性质。cDNA微阵列技术已经使得获得并比较在正常和异常细胞中的基因表达的综合图谱成为可能(Okabe等，CancerRes612129-37(2001)；Kitahara等，CancerRes613544-9(2001)；Lin等，Oncogene214120-8(2002)；Hasegawa等，CancerRes627012-7(2002))。此信息有助于理解癌细胞的复杂特性及癌发生机制。鉴定出肿瘤中下调的基因可以更精确并准确地诊断个体的癌症，并开发出新的治疗靶标(BienzandClevers，Cell103311-20(2000))。为揭示癌发生机理而设计的实验已经促进了特定的抗-肿瘤物质的分子靶标的鉴定。例如，最初为抑制与Ras相关的生长-信号途径而开发的法呢基转移酶(farnesyltransferase)抑制剂(FTI)已经显示能有效治疗动物模型中的Ras-依赖性肿瘤，其中Ras的活化依赖于翻译后法呢基化(He等，Cell99335-45(1999))。类似地，为了拮抗原癌基因受体HER2/neu，使用抗癌药物与抗-HER2单克隆抗体trastuzumab的组合在人中进行的临床实验改善了乳腺癌患者的临床反应和总存活率(Lin等，CancerRes616345-9(2001))。最后，已经开发了选择性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571用于治疗慢性骨髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia)，其中bcr-abl酪氨酸激酶的构成性活化(constitutiveactivation)在白细胞转化中发挥着重要的作用。这些种类的物质被设计用于抑制具体基因产物的致癌活性(Fujita等，CancerRes617722-6(2001))。因此，癌性细胞中通常上调的基因产物明显可用作开发新型抗癌药物的潜在靶标。已进一步证明CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别来自I类MHC分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自从发现MAGE家族作为TAA的第一个实例，用免疫学方法已发现了许多其它的TAA(Boon，IntJCancer54177-80(1993)；BoonandvanderBruggen，JExpMed183725-9(1996)；vanderBruggen等，Science2541643-7(1991)；Brichard等，JExpMed178489-95(1993)；Kawakami等，JExpMed180347-52(1994))。一些新发现的TAA目前正处于作为免疫疗法的靶标的临床开发阶段。迄今为止已经发现的TAA包括MAGE(vanderBruggen等，Science2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，JExpMed180347-52(1994))，SART(Shichijo等，JExpMed187277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen等，ProcNatlAcadSciUSA941914-8(1997))。另一方面，已证实在肿瘤细胞中特异地过表达的基因产物已显示作为诱导细胞免疫反应的靶标而被识别。这种基因产物包括p53(Umano等，BritJCancer841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，BritJCancer8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，IntJCancer8092-7(1999))等。尽管在关于TAA的基础和临床研究中取得了重要的进展(Rosenbeg等，NatureMed4321-7(1998)；Mukherji等，ProcNatlAcadSciUSA928078-82(1995)；Hu等，CancerRes562479-83(1996))，目前只有有限数量的候选TAA能治疗腺癌，包括肝细胞癌。在癌细胞中大量表达、但其表达限制在癌细胞内的TAA是作为免疫治疗靶标的有希望的候选物(candidate)。此外，对诱导强效且特异性抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定被预期能够促进肽接种策略在多种类型的癌中的临床使用(BoonandcanderBruggen，JExpMed183725-9(1996)；vanderBruggen等，Science2541643-7(1991)；Brichard等，JExpMed178489-95(1993)；Kawakami等，JExpMed180347-52(1994)；Shichijo等，JExpMed187277-88(1998)；Chen等，ProcNatlAcadSciUSA941914-8(1997)；Harris，JNatlCancerInst881442-5(1996)；Butterfield等，CancerRes593134-42(1999)；Vissers等，CancerRes595554-9(1999)；vanderBurg等，JImmunol1563308-14(1996)；Tanaka等，CancerRes574465-8(1997)；Fujie等，IntJCancer80169-72(1999)；Kikuchi等，IntJCancer81459-66(1999)；Oiso等，IntJCancer81387-94(1999))。已有重复报道指出，来自某些具体健康供体的肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对该肽产生响应而产生显著水平的IFN-γ，但在51Cr释放实验中几乎不以HLA-A24或-A0201限制性方式发挥针对肿瘤细胞的细胞毒作用(Kawano等，CancerRes603550-8(2000)；Nishizaka等，CancerRes604830-7(2000)；Tamura等，JpnJCancerRes92762-7(2001))。但是，HLA-A24和HLA-A0201均为在日本人以及高加索人群中常见的HLA等位基因(DatecTissueAntigens4793-101(1996)；Kondo等，JImmunol1554307-12(1995)；Kubo等，JImmunol1523913-24(1994)；Imanishi等，ProceedingoftheeleventhInternationalHistocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress，Oxford，1065(1992)；Williams等，TissueAntigen49129(1997))。因此，由这些HLA所呈递的癌抗原肽特别适用于治疗日本人和高加索人所患的癌症。此外，已知在体外诱导低亲和力CTL通常是使用高浓度肽的结果，所述高浓度肽的使用在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平特异性肽/MHC复合物，所述复合物将有效活化这些CTL(Alexander-Miller等，ProcNatlAcadSciUSA934102-7(1996))。因此，为揭示致肝细胞癌的机制并鉴定针对肝细胞癌(HCC)的抗癌药物的新型诊断标记和分子靶标，用包含23,040个基因的全基因组的cDNA微阵列对20例HCC的表达图谱进行分析。在这些在肿瘤中表达发生改变的基因中，选择了两种人基因MGC47816和HES6，与相应的正常组织相比它们在癌症中高频度上调。基因MGC47816编码公知的391个氨基酸的蛋白，所述蛋白包含氨甲酰磷酸合酶L链和ATP结合区，并被定位在染色体带1q34.1。另一基因HES6编码公知的224个氨基酸的蛋白，所述蛋白包含螺旋-环-螺旋结构域和桔黄(orange)结构域，并被定位在染色体带2q37。通过转染小干扰RNA(siRNA)而被抑制的MGC47816或HES6的表达抑制了肝细胞癌细胞的生长。这些结果使得对肝细胞的癌发生有了新的认识，并可能对开发诊断和治疗此种癌症的新策略起有贡献。发明概述因此，本发明是基于与肝细胞癌(HCC)有关的MGC47816和HES6的基因表达模式的发现。因此，本发明提供了检测、诊断和/或确定受试者中患HCC的倾向性的方法，该方法通过测定源自患者的生物样品(诸如组织样品)中MGC47816或HES6的表达水平，并将其与对照的表达水平作比较来进行。MGC47816或HES6的表达水平相对于该基因正常对照水平的升高，表示所述受试者患有或易患HCC。本发明中，术语“对照水平”指在对照样品中检测的表达水平并包括正常对照水平和HCC对照水平。本发明中，对照水平可包含源自单个参照群体的单一表达模式或源自多个表达模式。例如，对照水平可以是源自以前试验细胞的表达模式的数据库。“正常对照水平”指在正常个体或在已知未患HCC的个体的群体中检测到的基因表达水平。正常个体是无HCC临床症状的个体。正常细胞优选从肝细胞组织获得。另一方面，“HCC对照水平”指在已知患HCC的个体或个体的群体中检测到的基因表达水平。在试验样品中检测到的MGC47816或HES6的表达水平相对正常对照水平的下降表明所述受试者(从所述受试者获得了所述样品)患有或易患HCC。根据本发明，当基因表达与对照水平相比上升了至少10％，至少25％，或至少50％或更多时，认为表达水平“上升”。或者，当表达水平与对照水平相比上升了至少0.1，至少0.2，至少1，至少2，至少5，或至少10或更多倍时，认为表达水平“上升”。可以通过检测杂交，例如MGC47816或HES6基因探针与从源自患者的组织样品分离的基因转录物的结合来确定表达。本发明中，源自患者的组织样品可能是取自试验受试者，例如已知或疑似患有HCC的患者的任何样品。例如，所述组织可包含肝癌细胞。更具体地，所述组织可能是来自肝的细胞。本发明进一步地提供鉴定抑制MGC47816或HES6的表达或它们的基因产物的活性的物质的方法，所述方法是通过使表达MGC47816或HES6的试验细胞与试验物质接触并分别确定所述MGC47816或HES6基因的表达水平或所述基因产物的活性来进行的。试验细胞优选是肝细胞，如来自肝细胞癌的肝细胞。MGC47816或HES6表达水平相对所述基因的正常对照水平的下降表明所述试验物质是MGC47816或HES6的抑制物，因此能减轻HCC的症状。本发明也提供了包含与MGC47816或HES6核酸序列或其编码的基因产物结合的检出药剂的试剂盒。本发明的治疗方法包括了治疗或预防受试者的HCC的方法，所述方法包括给予所述受试者反义组合物的步骤。本发明中，所述反义组合物降低了具体靶基因例如MGC47816或HES6的表达。例如，所述反义组合物可包含与MGC47816或HES6的核酸序列互补的核苷酸。或者，本方法可包括给予受试者小干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。本发明中，所述siRNA组合物降低了MGC47816或HES6的表达。在另一个具体实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者的HCC的方法，其包括给予受试者核酶组合物的步骤。所述核酸特异性的核酶组合物降低了MGC47816或HES6的表达。在体内表达所需基因的适当机制在本领域是已知的。本发明也提供了疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者的HCC的方法可涉及给予所述受试者包含由MGC47816或HES6编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段的疫苗。本发明中，免疫活性片段是比全长的天然蛋白的长度短的多肽，但该多肽诱导的免疫应答与所述全长的蛋白所诱导的免疫应答类似。例如，免疫活性片段应该长度至少8个残基并能刺激免疫细胞如T细胞或B细胞。免疫细胞刺激的测定可通过检测细胞增殖、细胞因子(例如IL-2)加工(elaboration)或抗体产生来进行。除另有说明外，本申请所用的所有科技术语的都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的意思。尽管与本申请中描述的方法及材料类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其它参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，以本说明书包括定义为准。另外，所述材料、方法以及实施例都只是为了更好地说明，而绝无意进行限制。本文所述方法的一个优点是在检测明显临床症状前能鉴定出所述疾病。本发明的其他特征和优点从如下具体描述及所附的权利要求是明显可见的。附图简述图1图示了通过cDNA微阵列检测的D4999在20例原发HCC中的相对表达比(癌/非癌)。在经过截留过滤(Cy3和Cy5信号都超过25,000)的11例HCC中的7例中观察到上调表达(Cy3∶Cy5强度比＞2.0)。图2图示了使用另外的HCC组织通过半定量RT-PCR分析D4999的表达。T指肿瘤组织；N指正常组织。GAPDH的表达被用作内部对照。图3图示了MGC47816的基因组结构和MGC47816蛋白的预测结构。外显子用空心方块来表示，MGC47816cDNA的核苷酸数目显示在图的上部。图4图示了HA-标记的MGC47816蛋白的亚细胞定位。HA-标记的MGC47816蛋白的免疫印迹显示于图4(a)。COS7细胞中被标记蛋白的免疫组化染色显示于图4(b)。所述蛋白用大鼠抗-HA单克隆抗体染色并用罗丹明(RHODAMINE)-偶联的抗-大鼠IgG第二抗体来显示。用DAPI来复染核。图5图示了MGC47816-siRNA对MGC47816表达的影响[图5(a)]以及MGC47816-siRNA对Alexander和SNU449细胞的生存力的影响[图5(b)]。图6(a)图示了通过cDNA微阵列检测的C2298在20例原发HCC中的相对表达比(癌/非癌)。在经过截留过滤(Cy3和Cy5信号都超过25,000)的12例HCC中的11例中观察到上调的表达(Cy3∶Cy5强度比＞2.0)。图6(b)图示了通过半定量RT-PCR分析，C2298在8例另外的HCC(T)和它们的相应非癌性肝组织(N)中的表达。GAPDH的表达被用作内部对照。图7图示了HES6的多组织Northern印迹分析的结果。HES6的转录产物大小大约为1.4-kb。图8图示了HES6的基因组结构和HES6蛋白的预测结构。外显子用空心方块来表示，HES6cDNA的核苷酸数目显示在图上部。图9图示了被标记的HES6蛋白的亚细胞定位。图9(a)图示了HA-标记的HES6蛋白的免疫印迹结果。图9(b)图示了COS7细胞中被标记蛋白的免疫组化染色结果。HA-标记的HES6蛋白用大鼠抗-HA单克隆抗体染色并用罗丹明-偶联的抗-大鼠IgG第二抗体来显示。用DAPI来复染核。图10图示了HES6-siRNA对HES6表达的影响[图10(a)]和HES6-siRNA对Alexander和HepG2细胞的生存力的影响(b)。
发明内容除非另外具体指出，本文所用术语“一个”、“一种”和“所述”指“至少一个”。本发明部分基于MGC47816和HES6在HCC患者的肝细胞中的表达升高的发现。此提高的基因表达是用综合的cDNA微阵列系统来鉴定的。事先使用包含23,040个基因的cDNA微阵列构建了20个患者的综合基因表达图谱。在HCC患者中MGC47816和HES6以高水平表达。选择具有患者血清或痰中与癌症有关的蛋白的检出能力的候选分子标记，并发现了开发人肝细胞癌中信号抑制策略的一些潜在靶标。具体地，MGC47816和HES6在本文被鉴定为具有诊断用处的HCC的标记及基因靶标，其表达可被改变来治疗或缓解HCC的症状。除非另外指出，“HCC”指肝细胞癌，HCC-有关的基因或蛋白指本文公开的任何核酸或氨基酸序列(例如MGC47816或HES6)。通过测定细胞样品中MGC47816或HES6的表达，可诊断HCC。同样，通过测定MGC47816或HES6的表达对多种药剂响应，可以鉴定出用于治疗HCC的药剂。本发明涉及确定(例如测定)MGC47816或HES6的表达。使用分别针对MGC47816和HES6的核苷酸和/或氨基酸序列的GeneBankTM数据库登录(entries)所提供的序列信息，可用本领域一般技术人员公知的技术来检测和测定MGC47816或HES6。例如，在对应于MGC47816或HES6的序列数据库登录内的序列，可用于构建使用例如Northern印迹杂交分析检测MGC47816或HES6RNA序列的探针。作为另一个例子，公开的序列可用于构建特异性扩增MGC47816或HES6的引物，所述扩增使用例如基于扩增的检测方法，如基于逆转录的聚合酶链式反应。然后将试验细胞群(例如源自患者的组织样品)中的MGC47816或HES6的表达水平与参照群中MGC47816或HES6的表达水平进行比较。所述参照细胞群包括被比较的参数已知的一或多个细胞，即HCC细胞或非-HCC细胞。与参照细胞群相比试验细胞群中的基因表达模式是否表示HCC或患HCC的倾向性取决于参照细胞群的组成。例如，如果所述参照细胞群由非-HCC细胞组成，那么试验细胞群和参照细胞群之间的相似基因表达模式表示所述试验细胞群是非-HCC型。相反，如果所述参照细胞群由HCC细胞组成，那么试验细胞群和参照细胞群之间的相似基因表达图谱表示所述试验细胞群包括HCC细胞。如果HCC标记基因在试验细胞群中的表达水平与参照细胞群相关的表达水平相比改变了超过1.2，超过1.5，超过2.0，超过5.0，或超过10.0或更多倍，那么认为它是“改变的”。试验细胞群和参照细胞群之间的差异性基因表达可被标准化到对照核酸，例如管家基因。本发明中，对照核酸是已知其表达在细胞的癌和非-癌状态间没有改变的核酸。在试验细胞群体和参照群体中，对照核酸的表达水平可用于标准化被比较群中的信号水平。对照基因的例子包括但不限于β-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。试验细胞群可与多个参照细胞群比较。多个参照群中的每一个的已知参数可以是不同的。因此，试验细胞群可与已知包含例如HCC细胞的第一参照细胞群，以及已知包含例如非-HCC细胞(正常细胞)的第二参照群进行比较。所述试验细胞是从由已知包含或疑似包含HCC细胞的受试者获得的组织类型或细胞样品分离的。所述试验细胞从身体组织或体液，例如生物体液(如血液或尿液)获得。例如，所述试验细胞可纯化自组织。优选，所述试验细胞群包含上皮细胞。更优选，所述上皮细胞来自已知是或怀疑是HCC的组织。所述参照细胞群中的细胞应源自与所述试验细胞相似的组织类型。任选地，所述参照细胞群是细胞系，例如HCC细胞系(阳性对照)或正常的非-HCC细胞系(阴性对照)。或者，所述对照细胞群可源自分析参数或条件已知的细胞的分子信息数据库。所述受试者优选是哺乳动物。所述哺乳动物可以是例如人、非-人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。用本领域已知方法，可在蛋白或核酸水平确定MGC47816或HES6的表达。例如，使用特异性识别与MGC47816或HES6有关的RNA序列的探针，Northern杂交测定法可用于确定基因表达。或者，用基于逆转录的PCR分析，例如用对MGC47816或HES6特异的引物，可测定基因表达。也可确定在蛋白水平的表达，即通过测定本文所述的HCC标记基因编码的多肽的水平或其生物活性。这种方法在本领域是公知的，并且其包括但不限于，例如基于抗MGC47816或HES6编码的蛋白的抗体的免疫测定法。由各个基因编码的蛋白的生物活性也是公知的。例如，近来的研究提示人HES6抑制和促进HES1的蛋白酶降解，支持MASH1的活性并促进细胞具体是肌原(myogenic)细胞和神经元细胞的分化，(BaeS，等，Development.2000Jul；127(13)2933-43；GaoX等，JCellBiol.2001Sep17；154(6)1161-71)。诊断HCC本发明中，通过测定试验细胞群(即源自患者的生物样品)中MGC47816或HES6的表达水平来诊断HCC。优选，所述试验细胞群包含上皮细胞，例如从肝组织获得的细胞。也可从血液或其他体液如尿液来测定基因表达。可用其他生物学样品来确定蛋白水平。例如，在源自待诊断受试者的血液或血清中的蛋白水平可以通过免疫测定法或其他的常用生物测定法来测定。确定试验细胞或生物样品中MGC47816或HES6的表达，并与和正常对照样品有关的表达水平进行比较。正常对照水平是通常在已知不患HCC的群中发现的MGC47816或HES6的表达图谱。因此，在源自患者的组织样品中的MGC47816或HES6表达水平的上升表明所述受试者患有或易患HCC。换言之，当与正常对照相比在试验群中的MGC47816或HES6的表达水平发生改变，这就表明被试的受试者患有或易患HCC。鉴定抑制MGC47816或HES6表达或活性的物质对抑制MGC47816或HES6的表达或与其有关的基因产物的活性的物质的鉴定，可以通过使表达MGC47816或HES6的试验细胞群与试验物质接触，并测定MGC47816或HES6的表达水平或与其有关的基因产物的活性来进行的。与所述试验物质缺无时的水平相比所述物质存在时表达或活性的下降，表明所述物质是MGC47816或HES6的抑制物，因此对于抑制HCC是有用的。所述试验细胞群可以是表达MGC47816或HES6的任何细胞。例如，所述试验细胞群可包含上皮细胞，如分离自或源自肝的细胞。具体地，所述试验细胞可以是源自肝细胞癌的无限增殖细胞系。或者，所述试验细胞可以是用MGC47816或HES6转染的细胞或用来自MGC47816或HES6的、与报道基因可操作连接的调控序列(例如启动子序列)转染的细胞。评估受试者中的HCC治疗有效性本文鉴定的差异表达的MGC47816或HES6也允许HCC的疗程得以监测。此方法中，试验细胞群由正在接受HCC治疗的受试者提供。如果需要，可在治疗之前、期间、和/或之后的多个时间点从受试者取得试验细胞群。然后测定MGC47816或HES6在细胞群中的表达并将其与参照细胞群比较，该参照细胞群包括其HCC状况已知的细胞。本发明中，所述参照细胞未暴露于目的(ofinterest)治疗。如果所述参照细胞群不包含HCC细胞，在试验细胞群和正常对照参照细胞群之间的MGC47816或HES6表达相似性表明该治疗是有效的。然而，在被试群和正常对照参照细胞群之间的MGC47816或HES6表达差异表示临床结果或预后良好程度较低。相反，如果所述参照细胞群包含HCC细胞，那么在试验细胞群和参照细胞群之间的HCC-相关性基因(例如MGC47816或HES6)的表达差异表明该目的治疗是有效的，而在被试群和参照细胞群中的MGC47816或HES6表达相似性表示临床结果或预后良好程度较低。另外，可对治疗后获得的在源自受试者的生物样品中测定的一或多个HCC-相关性基因(例如MGC47816或HES6)的表达水平(即治疗后水平)与治疗开始前获得的源自受试者的生物样品中测定的所述一或多个HCC-相关性基因的表达水平(即治疗前水平)进行比较。MGC47816和/或HES6在治疗后样品中表达的下降表示所述所需治疗是有效的，而在治疗后样品中表达的上升或维持表示临床结果或预后良好程度较低。本发明中，术语“有效的”是指治疗导致受试者中病理性上调的基因的表达下降，或肝细胞肿瘤的大小、发生率、或转移可能性降低。当目的治疗用于预防时，术语“有效的”是指该治疗延缓或阻止HCC形成、或延缓、阻止或减轻临床HCC症状。可用标准临床方案来评估肝细胞肿瘤。另外，联合用于诊断或治疗HCC的任何已知方法可对有效性进行测定。例如，可通过鉴别症状性异常来诊断HCC。适合于具体个体的用于治疗HCC的治疗物质的选择个体基因构成的差异可导致其代谢多种药物的相对能力有差异。在个体中被代谢从而作为抗HCC剂的物质可通过如下方式使其自身得以显现，即诱导受试者细胞中的特征性基因表达类型从HCC状态改变到非HCC状态的特征性基因表达类型。由此，本文公开的差异性表达的MGC47816或HES6基因允许在来自所选择受试者的受试细胞群中检测推定的HCC治疗物质或HCC预防性抑制物，以便确定该物质是否是适于该受试者的HCC抑制物。为鉴定适于具体受试者的HCC抑制物，将来自该受试者的受试细胞群暴露于治疗物质，然后测定MGC47816或HES6的表达。本发明中，所述受试细胞群包含表达MGC47816或HES6的HCC细胞。优选地，所述受试细胞是上皮细胞。例如，可在候选物质存在时温育受试细胞群。然后，测定试验样品中的基因表达类型并与一或多种参照图谱进行比较，所述参照图谱例如HCC参照表达图谱或非-HCC参照表达图谱。受试细胞群中MGC47816或HES6的表达相对于含HCC的参照细胞群中所述基因的表达下降表示所述物质是治疗物质。试验物质可以是任何化合物或组合物。适用于本发明的合适的示例性试验物质包括但不限于免疫调节物质。筛选鉴定治疗物质的测定法本文公开的MGC47816或HES6也可用于鉴定治疗HCC的候选治疗物质。本发明方法包括如下步骤，即筛选候选治疗物质来测定是否它将HCC状态的特征性MGC47816或HES6表达图谱转变为指示非-HCC状态的类型。在本方法中，使细胞暴露于试验物质或多种试验物质(依次地或联合地)开测定MGC47816或HES6在细胞中的表达。然后将试验细胞群中MGC47816或HES6的表达水平与未暴露于试验物质的参照细胞群中MGC47816或HES6的表达水平相比较。能够抑制HCC中过表达的基因(例如MGC47816或HES6)的表达的物质具有潜在的临床效益。可以进一步检测这些化合物预防HCC生长的能力。在另一个具体实施方案中，本发明提供了筛选是治疗HCC的潜在靶标的候选物质的方法。如上详述，通过控制标记基因的表达水平或其基因产物的活性，可控制HCC的发病和进展。因此，是治疗HCC的潜在靶标的候选物质可以通过用这些表达水平和活性作为癌性或非癌性状态指标的筛选方法来鉴定。由此，本发明中，所述筛选可包含例如以下步骤a)将试验化合物与MGC47816或HES6编码的多肽接触；b)检测所述多肽与试验化合物的结合活性；和c)选出结合所述多肽的试验化合物。或者，本发明的筛选方法可包含如下步骤a)将候选化合物与表达MGC47816或HES6的细胞接触，和b)选出降低MGC47816或HES6的表达水平的候选化合物。表达标记基因的细胞包括例如，从HCC建立的细胞系；这些细胞可用于本发明的上述筛选。或者，本发明的筛选方法可包含如下步骤a)使试验化合物与MGC47816或HES6编码的多肽接触；b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选出这样的试验化合物，所述化合物使MGC47816或HES6编码的多肽的生物活性与没有该试验化合物时检测到的所述多肽的生物活性相比受到抑制。用于本发明筛选方法的蛋白可用标记基因的核苷酸序列作为重组蛋白来得到。基于涉及标记基因和/或其编码的蛋白的信息，本领域技术人员可选择所述蛋白的任何生物活性作为筛选的指标以及任何合适的测定方法来分析所选定的生物活性。优选地，MGC47816或HES6的细胞增殖活性被选作所述生物活性。细胞增殖活性可通过细胞系如NIH3T3或COS7的增殖来进行常规检测。或者，本发明的筛选方法可包含如下步骤a)将候选化合物与细胞接触，所述细胞中已经引入了包含MGC47816或HES6的转录调节区及受该转录调节区控制而表达的报道基因的载体；b)测定所述报道基因的表达或活性；和c)选出与对照相比降低所述报道基因的表达或活性的候选化合物。合适的报道基因和宿主细胞是本领域公知的。用于本发明的筛选方法的报道构建体可通过使用HCC-相关性标记基因(例如MGC47816或HES6)的转录调节区来制备。当标记基因的转录调节区是本领域技术人员已知的时候，可利用前面的序列信息制备报道构建体。在标记基因的转录调节区是未确定的情况下，可从基于该标记基因的核苷酸序列信息的基因组文库分离含有所述转录调节区的核苷酸片段。通过筛选而分离的化合物可作为药物开发的候补物，所述药物抑制标记基因编码的蛋白的活性，并可用于治疗或预防HCC。此外，可通过本发明的筛选方法获得的化合物中还包括抑制由标记基因所编码蛋白的活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或置换而改变的化合物。当将由本发明方法分离的化合物作为药物施用于人类及其他哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴子、狒狒和猩猩时，该分离的化合物可被直接施用或可采用已知的药物制备方法而被制成剂型。例如，根据需要，该药物可作为糖衣片剂，胶囊剂，酏剂和微囊剂而口服，或以水或任何其它可药用的液体的无菌溶液或悬浮液的注射液形式以非口服方式施用。例如，该化合物可与可药用的载体或介质，具体而言为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、增香剂(flavoringagent)，赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等，在通常可接受的药物制备方法所需的单位剂型中混合。这些制剂中含有的活性成分量是所标记范围内的适宜剂量。可混合至片剂和胶囊中的添加剂的实例包括但不限于，粘合剂诸如明胶，玉米淀粉，黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂诸如微晶纤维素；溶胀剂诸如玉米淀粉，明胶和海藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；增甜剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；以及增香剂诸如薄荷，Gaultheriaadenothrix油和樱桃红(cherry)。当单位剂型是胶囊时，液体载体诸如油，也可进一步包括在上述成份中。用于注射的无菌组合物可按照标准的药物制备方法采用载体诸如适合用于注射的蒸馏水进行配制。生理盐水，葡萄糖，和包含佐剂诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等张液可被用作注射用含水溶液。其可与适宜的增溶剂，诸如醇，特别是乙醇，多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，诸如Polysorbate80(TM)和HCO-50联合使用。麻油或大豆油可用作油性液体，其可与用作增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇联合使用，且可采用缓冲液诸如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液进行配制；止痛药，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和苯酚；和/或抗氧化剂。可将制备的注射剂装于适宜的安瓿中。可采用本领域技术人员公知的方法将本发明的药物组合物施用给患者，例如以经动脉内、经静脉内、或经皮注射，或经鼻内、经支气管内、经肌内或口服施用的方式。施用的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而改变；然而，本领域技术人员可常规地选择适宜的施用方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将该DNA插入用于基因治疗的载体中，将该载体施用患者从而实施治疗。施用的剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状而改变，但本领域技术人员能适当地对其进行选择。例如，虽然与本发明的蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量依赖于症状，但口服给予正常成年人(体重60kg)时，所述化合物的剂量通常为约0.1mg-约100mg/日，优选约1.0mg-约50mg/日，且更优选约1.0mg-约20mg/日。当以注射剂方式经胃肠外给予正常成年人(体重60kg)时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法而存在一些差异，适于静脉内注射的剂量是约0.01mg-约30mg/日，优选约0.1-约20mg/日，且更优选约0.1-约10mg/日。而且，在其它动物的情况中，可以通过转换为60kg体重来常规地计算合适的剂量。评估患HCC的受试者的预后本发明还提供了评估患HCC受试者的预后的方法，该方法包括将受试细胞群中MGC47816或HES6的表达与整个患病期间源自患者的参照细胞群中所述基因的表达进行比较的步骤。通过比较受试细胞群和参照细胞群中MGC47816或HES6的基因表达，或通过比较源自所述受试者的受试细胞群在不同时间(overtime)的基因表达图谱，可以评估所述受试者的预后。例如，受试细胞中MGC47816或HES6的表达相对正常对照的增加表明预后良好程度较低。相反，在受试细胞和正常对照之间的MGC47816或HES6表达的相似性则表明受试者预后良好程度较高。试剂盒本发明也包括HCC-检出药剂，例如，特异性结合或鉴定MGC47816或HES6核酸的核酸，如与部分MGC47816或HES6核酸互补的寡核苷酸序列，或结合MGC47816或HES6核酸所编码的蛋白的抗体。所述试剂可以试剂盒的形式包装在一起。例如，所述试剂可以包装在分开的容器中，例如核酸或抗体(结合于固体基质或与将其结合于所述基质的试剂分开包装)在一个容器中，对照试剂(阳性和/或阴性)在另一个容器中，和/或可检测的标记在第三个容器中。该试剂盒中也可包含实施所述测定法的说明书(例如，书面的、磁带、CD-ROM等)。使用所述试剂盒的分析模式可以是本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。例如，将HCC检出药剂固定在固体基质诸如多孔带上从而形成至少一个HCC检测位点。多孔带的测定或检测区可包括多个位点，其中的每一个均含核酸。检测带还可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与检测带分开的带上。任选地，不同检测位点可包含不同量的固定的核酸，即，第一检测位点中的量较高而随后的位点中的量较低。加入受试样品后，显示可检测信号的位点的数量提供了对样品中存在的HCC量的定量指示。检测位点可被设定为任何适宜的可检测形状，通常为跨越检测带宽度的条或点的形状。抑制HCC的方法本发明还提供了通过降低HCC-相关性基因(例如MGC47816或HES6)的表达或它们的基因产物之一的活性来治疗或减轻受试者中的HCC症状的方法。合适的治疗化合物可被预防性地或治疗性地施用给患有或可能患(或疑似)患有HCC的受试者。施用可以是全身的或局部的。这样的受试者可用标准化临床方法或通过检测MGC47816或HES6的表达或它们的基因产物之一的活性的异常水平来鉴定。举例的治疗物质包括但不限于细胞增殖的抑制物。本发明治疗方法包括使MGC47816或HES6的表达、它们的基因产物之一的功能、或两者都下降。可以以本领域已知的多种方式中的任一种来抑制表达。例如，可以通过向受试者施用抑制或拮抗过表达的基因的表达的核酸，例如破坏过表达的基因的表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA来抑制表达。反义核酸如上述，与MGC47816或HES6的核苷酸序列对应的反义核酸可用于降低MGC47816或HES6的表达水平。与在HCC中被上调的基因(例如MGC47816或HES6)的核苷酸序列对应的反义核酸可用于治疗HCC。具体来说，本发明的反义核酸可通过如下方式发挥作用，即通过结合MGC47816或HES6的核苷酸序列或与MGC47816或HES6相应的mRNA，由此抑制所述基因的转录或翻译，促进所述mRNA的降解，和/或抑制由MGC47816或HES6核酸编码的蛋白的表达，并最终抑制所述蛋白的功能。本文所使用的术语“反义核酸”包括与靶序列完全互补的核苷酸以及具有核苷酸错配的那些核苷酸，只要该反义核酸能与所述靶序列特异性杂交即可。例如，本发明的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的长度上与参照序列具有至少70％或更高、优选至少80％或更高、更优选至少90％或更高、甚至更优选至少95％或更高的同源性的多核苷酸。可将本领域已知的算法可用于测定同源性。本发明的反义核酸通过以下方式对生成HCC-相关性标记基因编码的蛋白的细胞产生作用与编码所述蛋白的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进所述mRNA降解，抑制所述蛋白的表达，由此抑制该蛋白的功能。本发明的反义核酸可通过与对所述核酸无活性的适宜基质材料混合而被制成外用制剂，诸如搽剂或泥敷剂。按照需要，该反义核酸也可通过加入赋形剂、等张剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂等而被配制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、脂质体胶囊剂、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂等。这些剂型可通过已知方法进行制备。例如，可通过将本发明的反义核酸直接施用于患病位点或注射至血管中以便到达患病位点而给予患者。反义封固的介质也可被用于增加耐久性和膜通透性。实例包括但不限于脂质体、聚左旋赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染素(lipofectin)或这些物质的衍生物。本发明的反义核酸的剂量可根据患者状况适当调整并以所需量使用。例如，可施用范围在0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg的剂量。本发明的反义核酸抑制本发明蛋白的表达从而可用于抑制所述蛋白的生物活性。另外，包含本发明反义核酸的表达抑制物是可用的，因为它们能抑制本发明蛋白的生物活性。本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，硫代核苷酸(thioatednucleotide)可被用于赋予寡核苷酸对核酸酶的抗性。而且，针对标记基因的siRNA可被用于降低该标记基因的表达水平。术语“siRNA”意指可阻止靶mRNA翻译的双链siRNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中DNA是RNA转录模板的那些技术。在本发明中，siRNA包括针对上调的标记基因诸如MGC47816或HES6的有义核酸序列和反义核酸序列。本发明的反义和siRNA方法可用于改变细胞中上调的HCC基因的表达，例如由细胞恶性转化导致的上调。siRNA与靶细胞中MGC47816或HES6的相应转录物的结合导致细胞产生的蛋白的减少。寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，且可与天然存在的转录物同样长。优选地，所述寡核苷酸的长度为约19-25个核苷酸。最优选地，所述寡核苷酸的长度短于75、50、25个核苷酸。抑制在Alexander和SNU449细胞中的表达的MGC47816siRNA寡核苷酸的实例包括包含SEQIDNO19的靶序列。抑制在Alexander和HepG2细胞中的表达的HES6siRNA寡核苷酸的实例包括包含SEQIDNO26的靶序列。可构建siRNA使其单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列，例如，作为发卡结构。HCC-相关性基因(例如MGC47816或HES6)的siRNA与靶mRNA杂交，由此降低或抑制MGC47816或HES6多肽的生成，这是通过与正常的单链mRNA转录物连接从而干扰翻译由此影响所述蛋白的表达的结果。为了提高siRNA的抑制活性，可将核苷酸“u”添加到所述靶序列的反义链的3’端。要添加的“u”的数目为至少2，通常2-10，优选2-5。添加的“u”在siRNA的反义链的3’端形成单链。MGC47816或HES6的siRNA可以能结合所述mRNA转录物的形式直接导入细胞。或者，编码siRNA的DNA可在载体中携带。例如，可通过将HCC-相关性基因靶序列以允许两条链表达的方式(通过DNA分子的转录)克隆到在所述序列侧翼具有可操作连接的调控序列的表达载体中来制备载体(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。与HCC-相关性基因的mRNA反义的RNA分子(例如MGC47816或HES6)由第一启动子(例如所克隆DNA3’的启动子序列)转录，并且是HCC-相关性基因的mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如所克隆DNA5’的启动子序列)转录。所述有义和反义链在体内杂交产生siRNA构建体来沉默所述HCC-相关性基因。或者，这两个构建体可用于产生siRNA构建体的有义和反义链。克隆的HCC-相关性基因(例如MGC47816或HES6)可编码具有二级结构诸如发夹的构建体，其中单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列。由任意核苷酸序列组成的环状序列可位于有义和反义序列之间从而形成发夹环状结构。因此，本发明也提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是与选自由核苷酸SEQIDNOs19，26组成的组的序列相对的核糖核苷酸序列[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区与[A’]杂交，然后形成由[B]区组成的环(loop)。所述环状序列优选长度是3-23个核苷酸。所述环状序列，例如，可选自由如下序列组成的组(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。另外，由23个核苷酸组成的环状序列也提供了活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438.)。CCC，CCACC或CCACACCJacque，J.M，Triques，K.，andStevenson，M(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature，Vol.418435-438.UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-lrevtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，andTocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradationofdouble-strandedRNAbyanactivityinXenopuslaevisgerminalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4)1639-1644.UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，andSharp，P.A.(2002)KillingthemessengerShortRNAsthatsilencegeneexpression.NatureReviewsMolecularCellBiology4457-467.例如，具有本发明环状结构的优选siRNAs如下所示。在下面的结构中，环状序列可选自由CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA组成的组。优选的环状结构是UUCAAGAGA(DNA为“ttcaagaga”)。适用于本发明的举例的发夹siRNA包括对于MGC47816-siRNAguguccgcugacagaacaa-[b]-uuguucugucagcggacac(对于SEQIDNO19的靶序列)对于HES6-siRNAacuuuuagggacccugcag-[b]-cugcagggucccuaaaagu(对于SEQIDNO26的靶序列)；适当的siRNA的核苷酸序列可用在Ambion网站上可得到的siRNA设计计算机程序来设计(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。所述计算机程序基于如下方案选择了siRNA合成的核苷酸序列。选择siRNA靶位1.从目标转录物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。将每次AA和邻近3′的19个核苷酸的出现记录为潜在的siRNA靶位。Tuschl等反对针对5′和3′非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能较为富含调节性蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位与人类基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何靶序列。可采用BLAST(可见于NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性检索3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，优选沿基因选择数个靶序列进行评估。MGC47816或HES6基因侧翼的调节序列可以是相同的或是不同的，从而它们的表达可以被独立调控，或者以时间或空间的方式得以调控。siRNA在细胞内转录通过将MGC47816或HES6基因模板克隆到含有诸如来自小核RNA(snRNA)U6或人H1RNA启动子的RNApolIII转录单元的载体。为了将载体导入细胞，可使用转录增强剂。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamin2000(Invitrogen)，Oligofectamin(Invitrogen)，和Nucleofactor(WakopureChemical)可用作转录增强剂。本发明的siRNA抑制本发明多肽的表达从而可用于抑制本发明多肽的生物活性。同样，包含本发明siRNA的表达抑制物是可用的，因为它们能抑制本发明多肽的生物活性。因此，包含本发明反义寡核苷酸的组合物如siRNA可用于治疗HCC。抗体或者，抑制在HCC中过表达的基因(例如MGC47816或HES6)的基因产物的功能可通过施用可结合或者可抑制所述基因产物功能的化合物来抑制。例如，所述化合物可以是一种能与过表达的基因的产物结合的抗体。本发明涉及抗体具体而言为针对上调的基因编码的蛋白的抗体或该抗体的片段的用途。本文所用术语“抗体”是指具有特异性结构的免疫球蛋白分子，该结构仅与用于合成该抗体(即，上调的标记基因产物)的抗原或与同其密切相关的抗原特异性相互作用(即，结合)。本发明中，抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它结合HCC-相关性标记基因编码的蛋白。例如，所述抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston等，ProcNatlAcadSciUSA855879-83(1988))。更具体地，抗体片段可用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体而生成。或者可构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见，如Co等，JImmunol1522968-76(1994)；BetterandHorwitz，MethodsEnzymol178476-96(1989)；PluckthunandSkerra，MethodsEnzymol178497-515(1989)；Lamoyi，MethodsEnzymol121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol121663-9(1986)；BirdandWalker，TrendsBiotechnol9132-7(1991))。抗体可通过与多种分子，诸如聚乙二醇(PEG)偶联而进行修饰。本发明提供了所述修饰的抗体。该修饰的抗体可通过化学方法修饰抗体而获得。这些修饰方法在本领域中是常规的。或者，抗体可包括嵌合抗体(具有源于非人抗体的可变区和源于人抗体的恒定区)，或人源化抗体(具有源于非人抗体的互补决定区(CDR)、源于人抗体的框架区(FR)和恒定区)。使用已知技术可制备所述抗体。针对癌细胞中出现的具体分子改变的癌症治疗已通过抗癌药的临床开发和调控性批准而被证实是有效的，所述抗癌药诸如用于治疗晚期乳癌的曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治疗慢性髓细胞性白血病(chronicmyeloidleukemia)的伊马替尼甲酯(imatinibmethylate)(Gleevec)，用于治疗非小细胞性肺癌(NSCLC)的吉非替尼(gefitinib)(Iressa)，和用于治疗B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)的利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20mAb)(CiardielloF，TortoraG.Anovelapproachinthetreatmentofcancertargetingtheepidermalgrowthfactorreceptor.ClinCancerRes.2001Oct；7(10)2958-70.Review.；SlamonDJ，Leyland-JonesB，ShakS，FuchsH，PatonV；BajamondeA，FlemingT，EiermannW；WolterJ，PegramM，BaselgaJ，NortonL.UseofchemotherapyplusamonoclonalantibodyagainstHER2formetastaticbreastcancerthatoverexpressesHER2.NEnglJMed.2001Mar15；344(11)783-92.；RehwaldU，SchulzH，ReiserM，SieberM，StaakJO，MorschhauserF，DriessenC，RudigerT，Muller-HermelinkK，DiehlV，EngertA.TreatmentofrelapsedCD20+Hodgkinlymphomawiththemonoclonalantibodyrituximabiseffectiveandwelltoleratedresultsofaphase2trialoftheGermanHodgkinLymphomaStudyGroup.Blood.2003Jan15；101(2)420-424.；FangG，KimCN，PerkinsCL，RamadeviN，WintonE，WittmannSandBhallaKN.(2000).Blood，96，2246-2253.)。这些药物在临床上是有效的，由于其仅靶向转化的细胞，故其耐受性比传统抗癌剂好。因此，所述药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，还验证了分子靶向的癌症治疗这一概念。此外，在与标准化学疗法联合使用时，经靶向的药物可增强标准化学疗法的功效(GianniL.(2002).Oncology，63Suppl1，47-56.；KlejmanA，RushenL，MorrioneA，SlupianekA和SkorskiT.(2002).Oncogene，21，5868-5876.)。因此，未来的癌症治疗可涉及传统药物与靶特异性物质的联用，后者针对肿瘤细胞不同特性诸如血管发生及侵袭力。这些调节方法可离体或在体外实施(例如，通过在存在所述物质的条件下培养细胞)或可选地在体内实施(例如，通过将所述物质施用于受试者)。所述方法包括施用蛋白或蛋白的组合或核酸分子或核酸分子的组合进行治疗以抵消(counteract)差异性表达的基因的异常表达或它们的基因产物的异常活性。特征分别在于基因的表达水平或基因产物的生物活性增加(相对于未患有疾病或病症的受试者而言)的疾病或病症，可用拮抗(即降低或抑制)过表达的一或多种基因的活性的治疗物质来进行治疗。可治疗性或预防性施用具有上述拮抗活性的治疗物质。由此，本发明可使用的治疗物质包括，例如，(i)针对MGC47816或HES6蛋白的抗体；(ii)“功能障碍性(dysfunctional)”反义核酸或核酸(即由于在MGC47816或HES6基因序列的编码序列中的异源插入)；(iii)小干扰RNA(siRNA)；或(iv)调节剂(即改变MGC47816或HES6多肽与其结合配偶体之间相互作用的抑制剂或拮抗剂)。该功能障碍性反义分子可用于通过同源重组而“敲除”多肽的内源功能(参见，例如，Capecchi，Science2441288-12921989)。通过定量肽和/或RNA可很容易地检测增加的水平，所述定量可通过获取患者组织样品(例如，来自活组织检查组织)，在体外检测其RNA或肽水平、表达的肽的结构和/或活性(或其表达改变的基因的mRNA)来进行。本领域公知的方法包括但不限于免疫测定法(例如，通过Western印迹分析，免疫沉淀然后进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫细胞化学等)和/或杂交测定法来检测mRNA的表达(例如，Northern测定法，斑点印迹，原位杂交等)。预防性施用可在明显的临床症状出现之前进行，由此可防止疾病或病症或可选地延迟所述疾病或病症的进程。本发明治疗方法可包括将细胞与下述物质接触的步骤，所述物质调节在HCC中差异性表达的基因(例如MGC47816或HES6)的基因产物的一种或多种活性。调节蛋白活性的物质的举例包括但不限于核酸、蛋白、这些蛋白的天然存在的同源配体、肽、肽模拟物，或其它小分子。接种预防HCC本发明还涉及治疗或预防受试者的HCC的方法，其包括对所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含由MGC47816或HES6编码的多肽、所述多肽的免疫活性片段、或编码该多肽的多核苷酸或其片段。施用所述多肽会在受试者中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，施用MGC47816或HES6编码的多肽、所述多肽的免疫活性片段，或编码该多肽的多核苷酸或其片段到有需要的受试者。该多肽或其免疫活性片段可用作抗HCC的疫苗。在一些情况下，所述蛋白或其片段可以以与T细胞受体(TCR)结合或由抗原呈递细胞(APC)呈递的形式来施用，所述APC诸如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B细胞。由于DC具有强抗原呈递能力，在所述APC中，使用DC是最优选的。在本发明中，抗HCC的疫苗是指具有经对动物进行免疫接种而诱导抗肿瘤免疫的能力的物质。根据本发明，由MGC47816或HES6编码的多肽或其片段被认为是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可诱导针对表达MGC47816或HES6的HCC细胞的、有效且特异的免疫反应。因此，本发明还包括使用所述多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫反应-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识别肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。因此，当具体蛋白通过对动物进行免疫接种而诱导任何一种上述免疫应答时，该蛋白即可被认为具有抗肿瘤免疫诱导功效。由蛋白诱导的抗肿瘤免疫可通过观察宿主免疫系统在体内或体外针对该蛋白的应答而进行检测。例如，检测对细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。具体地，进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用而被呈递于T细胞和B细胞。以抗原特异性方式响应于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这被称为T细胞活化)。因此，具体的肽对CTL的诱导可通过经由APC将该肽呈递给T细胞，并检测CTL的诱导而进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞、和NK细胞的功效。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，故该肽的抗肿瘤免疫诱导作用可采用这些细胞的活化效应作为指标进行评估。以树突细胞(DC)作为APC而对CTL的诱导作用进行评估的方法在本领域中是公知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先将受试多肽与DC接触，然后将该DC与T细胞接触。在与DC接触后，对具有针对目的细胞的细胞毒性作用的T细胞的检测显示出该试验多肽具有诱导所述细胞毒T细胞的活性。CTL抗肿瘤的活性可通过，例如，采用51Cr标记的肿瘤细胞的溶解作为指标进行检测。或者，采用3H-脱氧胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标对肿瘤细胞损伤程度进行评价的方法也是公知的。除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。已有报道指出，通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC，可增强CTL的诱导。相似地，已经显示出通过在存在匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC可诱导CTL。通过这些方法证实具有CTL诱导活性的试验多肽是具有DC活化效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL能力的APC可用作抗肿瘤的疫苗。此外，由于经APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可被用作抗肿瘤的疫苗。采用由APC和CTL产生的抗肿瘤免疫的肿瘤治疗方法被称为细胞免疫治疗。一般来说，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，已知通过联合多种具有不同结构的多肽并使它们与DC接触可增加CTL诱导效率。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。或者，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可通过观测对抗肿瘤抗体生成的诱导而被证实。例如，当在用多肽免疫的试验动物中诱导抗该多肽的抗体时，以及当这些抗体抑制肿瘤细胞的生长时，该多肽可被确定为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。通过施用本发明的疫苗可诱导抗肿瘤免疫，且这种对该抗肿瘤免疫的诱导使得能够治疗和预防HCC。抗癌治疗或对癌症发病的预防包括任何下述步骤，诸如对癌性细胞生长的抑制、癌症的衰退(involution)、以及对癌发生的抑制。患癌症个体的死亡率或病死率的降低、血液中肿瘤标记物水平的降低、癌伴发的可检测症状的缓解等等也包括在癌症的治疗或预防中。这些治疗性和预防性效果优选具有统计学上的显著性，诸如在显著性水平为5％或更低的观察中，其中将抗细胞增殖性疾病的疫苗的治疗性或预防性效果与未施用疫苗的对照进行比较。例如，可将Student’st-检验、Mann-WhitneyU-检验、或ANOVA用于统计学分析。上述具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体可与佐剂联合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白一起(或连续)施用时能增强针对该蛋白的免疫应答的化合物。佐剂的实例包括但不限于霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾、等。此外，本发明的疫苗可适宜地与可药用的载体联用。所述载体的实例是无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，所述疫苗可按需要包含稳定剂、混悬剂、防腐剂、表面活性剂等。所述疫苗可全身或局部地进行施用。疫苗施用可通过单次施用进行，或经多次施用而强化。当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可通过，例如离体方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，将该细胞与所述多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL后，可将该细胞施用于该受试者。APC还可通过将编码所述多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导。离体条件下诱导的APC或CTL可在施用前进行克隆。通过克隆并使具有高靶细胞破坏活性的细胞生长，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可用于对所述细胞所源自的个体进行细胞免疫治疗，还可用于对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治疗。此外，提供了治疗或预防细胞增殖性疾病，诸如癌症的药物组合物，其包含药学有效量的本发明的多肽。该药物组合物可用于引起抗肿瘤免疫。抑制HCC的药物组合物本发明提供了适宜的药物配制剂，其包括那些适于口服、经直肠、经鼻、经局部(包括经颊和经舌下)、经阴道或经肠胃外(包括经肌内、经皮下和经静脉内)施用的配制剂，或者适于通过吸入或吹入施用的配制剂。优选地，所述施用是经静脉内施用。可任选地将配制剂包装在分离的剂量单位内。适于口服施用的配制剂包括胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，每一种都含有预定量的活性成分。合适的配制剂还包括但不限于粉末、颗粒、溶液、悬液或乳剂。所述活性成分可选以药糖丸(boluselectuary)或药膏的形式施用。口服施用的片剂和胶囊剂可以包含惯用的赋形剂如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂和/或润湿剂。可任选与一种或多种配制剂成分一起，通过压制或模制制成片剂。压制片(compressedtablet)可以通过将自由流动形式的例如粉末或颗粒的活性成分压入合适机器里制成，所述活性成分还可任选与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性和/或分散剂混合。模制片(moldedtablet)可以用由惰性液态稀释剂润湿后的粉末化合物的混合物在合适机器内进行模制而制成。所述片剂可以用本领域公知的方法来包被。口服流体制剂的形式可以是，例如，含水或含油的悬液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以是干燥产物的形式，在使用前用水或其它合适载体重配。所述液体配制剂可以包含惯用的添加剂如悬浮剂、乳化剂、无水载体(包括食用油)、和/或者防腐剂。可以任选配制所述片剂使得其中的活性成分能够缓慢或有控制地释放。片剂的包装可以包括每月一次的单个药片。适于肠胃外施用的配制剂包括含水和无水的无菌注射液，其中任选含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使剂型与目的接受者的血液等张的溶质；以及含水和无水的无菌悬液，其中可选包括悬浮剂和/或稠化剂。所述配制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前只需添加无菌液态载体例如盐水、注射用水，即配即用。可选，所述配制剂可以是连续输注的形式。即用即配的注射液和悬液可以用上述的无菌粉末、颗粒和片剂制备而成。适于直肠施用的配制剂包括带有标准载体如可可脂(cocoabutter)或聚乙二醇的栓剂。适于局部口腔施用诸如经颊或舌下施用的配制剂，包括糖锭(lozenges)，其中含有的活性成分存在于增香基剂(flavoredbase)如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄芪胶(tragacath)中；和软锭剂(pastille)，其中含有的活性成分存在于基剂例如白明胶、甘油、蔗糖或阿拉伯胶中。对于鼻内施用，本发明组合物可用作液体喷雾剂、可分散性粉剂或滴剂。滴剂可以用含水或非含水的(non-aqueous)基剂配制而成，其中还含有一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。对于通过吸入的施用，所述组合物要能便利地从吹入器、雾化器(nebulizer)、加压包装(pressuredpackage)或者递送气溶胶喷剂的其它便利器具中释放出来。加压包装可以包括合适的推进剂如二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、三氯氟甲烷(trichlorofluromethane)、二氯四氟乙烷(dichiorotetrafluoroethane)、二氧化碳或其它合适气体。就加压气溶胶而言，可以通过提供可定量递送的阀确定剂量单位。可选，就吸入或吹入施用而言，所述组合物可以采用干粉组合物的形式，例如，活性化合物和合适的粉末基剂例如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述粉末组合物可以单位剂型存在，例如胶囊、药筒(cartridge)、白明胶或发泡药包(blisterpack)中，其中所述粉末可借助于吸入器或吹入器来施用。其它剂型包括可植入用具(implantabledevice)和粘性贴片(adhesivepatch)；它释放治疗药剂。当需要时，可以采用经改进能持续释放活性成分的上述配制剂。所述药物组合物还可含有其它活性成分，如抗微生物药剂(antimicrobialagent)、免疫抑制剂和/或防腐剂。应理解，除上面具体提及的成分之外，根据目的配制剂的类型，本发明所述配制剂可包括本领域其它惯用药剂，例如，适于口服施用的配制剂可以包括增香剂。优选的单位剂量配制剂，如下所述，含有有效剂量的活性成分或其合适部分。对于上述每种疾病，所述组合物例如多肽和有机化合物可通过口服或注射以约0.1-约250mg/kg/天的剂量施用。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，最优选为约100mg-约3g/天。以分离单位提供的片剂或其它单位剂型可方便地包含这样的量，使得在以所述剂量或所述剂量的倍数使用时所述组合物有效，例如每个单位含有约5毫克-约500毫克，通常为约100毫克-约500毫克。采用的剂量取决于许多因素，包括受试者的年龄和性别，要治疗的具体病症及其严重程度。另外，给药途径还可以随病症及其严重程度而变化。在任何情况下，本领域技术人员都能参考上述因素按常规计算合适的和最佳的剂量。本发明各个方面将在如下实施例中进一步描述。这些实施例仅为说明目的而绝非为了限制权利要求中所述的本发明范围。实施例1材料和一般性方法患者和组织样品所有肝细胞癌组织及相应的非癌性组织均得自同意接受实验的已接受手术的患者的手术样品。全基因组的cDNA微阵列此研究中使用了包含23,040个基因的全基因组的cDNA微阵列。从显微解剖(microdissected)的组织提取的总RNA用DNaseI处理后，用AmpliscribeT7转录试剂盒(EpicentreTechnologies)扩增，随后在逆转录过程中用Cy-染料(Amersham)标记；来自非癌性组织的RNA用Cy5，来自肿瘤的RNA用Cy3标记。如上所述进行杂交、洗涤、和检测(Ono，K.，等，CancerRes.，605007-5011，(2000))，并用ArrayVision软件(AmershamPharmacia)产生每个靶点的Cy5和Cy3荧光强度。在减去背景信号后，对每个点的一式两份的值作平均。然后，对玻片上的所有荧光强度进行标准化来调整每个玻片上52个管家基因的平均Cy5和Cy3强度。将Cy3和Cy5的强度低于25,000个荧光单元的将那些基因从进一步的研究中排除，而剩下的那些Cy3/Cy5信号比率＞2.0的基因被选作进行进一步评价。细胞系人肝癌细胞系Alexander和HepG2和猴成纤维细胞系COS7获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。其他的肝癌细胞系Huh7获自研究生物资源日本保藏中心(JapaneseCollectionofResearchBioresources(JCRB))，而SNU423、SNU449和SNU475获自韩国细胞系库(Koreacell-linebank)。所有细胞系均在合适的培养基中单层生长Dulbecco改良的Eagle培养基用于Alexander、Huh7、HepG2和COS7；RPMI1640用于SNU423、SNU449和SNU475，基中均添加10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。所有细胞在37℃含有5％CO2的潮湿空气中保持(Alexander、Huh7、HepG2、SNU423、SNU449、SNU475和COS7)。RNA制备物和RT-PCR总RNA用QiagenRNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(LifeTechnologies，Inc.)根据厂商的方案来提取。将10微克等分(aliquot)的总RNA用多聚dT12-18引物(AmershamPharmaciaBiotech)通过SuperscriptII逆转录酶(LifeTechnologies)逆转录成单链cDNA。每个单链cDNA制备物被稀释，随后通过在12μl体积的PCR缓冲液(TAKARA)中进行的标准RT-PCR试验来作PCR扩增。在GeneAmpPCR循环9700(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)中进行扩增，其包括在94℃变性4分钟，然后进行21轮(对于GAPDH而言)或(对于MGC47816而言)35轮的94℃30秒、60℃30秒、和72℃60秒的循环，或35轮(对于HES6而言)94℃30秒、60℃40秒、和72℃60秒的循环。引物序列如下对于GAPDH正向引物5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’(SEQIDNO3)和反向引物为5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’(SEQIDNO4)；对于MGC47816正向引物为5’-CAAATAGGCAGACTGGAAAGATG-3’(SEQIDNO5)和反向引物为5’-CTAGGGAAGCAGTAGGATTTGGT-3’(SEQIDNO6)；对于HES6正向引物为5’-GAGCTCCTGAACCATCTGCTC-3’(SEQIDNO20)和反向引物为5’-CAAGATGTACAGAGCATCACAGC-3’(SEQIDNO21)；Northern印迹分析使人多-组织印迹(Clontech，PaloAlto，CA)与MGC47816和HES6的32P标记的PCR产物进行杂交。根据供应商的推荐来进行预杂交、杂交和洗涤。在-80℃将所述印迹在增感屏上放射自显影72小时。构建表达载体MGC47816的完整编码区用如下基因特异性引物组5’-ATTGTCGACGCTCGCCCTACTGAGCGAGCG-3’(SEQIDNO7)，和5’-AATCTCGAGAGCAGGAATTCACTTAAGTTTTAACTC-3’(SEQIDNO8)通过RT-PCR来扩增。HES6的完整编码区用如下基因特异性引物组5’-ATTGAATTCGCATGGCGCCACCCGCGGCG-3’(SEQIDNO22)，和5’-AATGGTACCTCACCAAGGCCTCCAGACACTCC-3’(SEQIDNO23)通过RT-PCR来扩增。将PCR产物克隆到pCMV-HA载体(CLONTECH)的合适的克隆位点。免疫印迹pCMV-HA-MGC47816和pCMV-HA-HES6转染的细胞用PBS洗涤两次，然后在裂解缓冲液(150mMNaCl，1％TritonX-100，50mMTris-HClpH7.4，1mMDTT，和1×完全蛋白酶抑制剂Cocktail(Boehringer))中进行收集。将细胞均质化并以10,000×g离心30分钟后，通过Bradford测定法(Bio-Rad)对上清进行蛋白浓度标准化。采用10％SDS-PAGE分离蛋白，用大鼠抗HA(Roche)抗体作免疫印迹。HRP-偶联的山羊抗大鼠IgG(SantaCruz)用作ECLDetectionSystem(Amersham)的第二抗体。免疫组织化学染色pCMV-HA-MGC47816和pCMV-HA-HES6转染的细胞用包含4％的低聚甲醛的PBS固定15分钟，然后在室温用包含0.1％TritonX-100的PBS处理2.5分钟使其具有可透过性。随后，在4℃用PBS中的2％BSA覆盖(cover)细胞12小时以阻断非特异性杂交。将1∶1000稀释度的大鼠抗HA(ROCHE)抗体用作第一抗体，在与罗丹明偶联的抗大鼠第二抗体(LeincoandICN)一起温育后显示该反应。细胞核用4’，6’-二脒基-2’-苯基吲哚(phenylindoledihydrochloride)(DAPI)复染。在ECLIPSEE800显微镜下获得荧光图像。表达MGC47816-siRNA和HFS6-siRNA的质粒的构建及其作用为制备表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体，对于H1RNA而言，含有启动子区的H1RNA基因的基因组片段通过PCR用如下引物组5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTATA-3’(SEQIDNO9)和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQIDNO10)、以人胎盘DNA为模板来扩增。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)根据供应商的方案将所得产物纯化并克隆到pCR2.0质粒载体中。将含有H1RNA的BamHI和XhoI片段克隆到pcDNA3.1(+)质粒的核苷酸1257到56的片段，它通过PCR用5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNO11)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNO12)来扩增。以用于连接的DNA作为PCR扩增的模板，对于H1RNA所用的引物为5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQIDNO13)和5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQIDNO14)。将产物用HindIII消化，然后自连接以产生psiH1BX3.0载体质粒。对照质粒psiH1BX-EGFP是通过将5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO16)的双链寡核苷酸克隆到psiH1BX3.0载体中的BbsI位点制备的。表达MGC47816-siRNAs和HES6-siRNAs的质粒是通过克隆双链寡核苷酸到psiH1BX3.0载体中来制备的。用于MGC47816-siRNAs的寡核苷酸是5’-TCCCGTGTCCGCTGACAGAACAATTCAAGAGATTGTTCTGTCAGCGGACAC-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAGTGTCCGCTGACAGAACAATCTCTTGAATTGTTCTGTCAGCGGACAC-3’(SEQIDNO18)(psiH1BX-MGC47816-3)。用于HES6-siRNAs的寡核苷酸是5’-TCCCACTTTTAGGGACCCTGCAGTTCAAGAGACTGCAGGGTCCCTAAAAGT-3’(SEQIDNO24)和5’-AAAAACTTTTAGGGACCCTGCAGTCTCTTGAACTGCAGGGTCCCTAAAAGT-3’(SEQIDNO25)(psiH1BX-HES6-2)。根据供应商的推荐用FuGENE6试剂(Roche)或Nucleofector试剂(Alexa)，将质粒psiH1BX-MGC47816-3转染到Alexander和SNU449细胞中并将psiH1BX-HES6-2转染到Alexander和HepG2细胞中。转染后48小时从所述细胞提取总RNA。细胞在存在400-800μg/ml遗传霉素(geneticin)(G418)的条件下培养14天并用吉姆萨溶液(MERCK，Germany)如其他处所述来染色。MTT测定法在10cm-皿中的1×106细胞用siRNA表达载体或对照载体利用FuGene6(Roche)根据供应商的方案来转染。细胞生存力在转染后7天用MTT测定法来评估。向每个皿以1/10体积的浓度加入计数细胞(Cell-counting)的试剂盒-8(DOJINDO)，并在37℃再温育所述平板2个小时；然后用MicroplateReader550(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)在490nm测定吸光度，并以630nm作为参照。统计学分析对数据进行方差分析(ANOVA)和Scheffé’sF检验。实施例2结果鉴定其表达在人类HCC中高频率上调的D4999用包含23,040个基因的cDNA微阵列对20例HCC的表达图谱与它们的相应非癌性肝组织进行比较。在HCC中高频率上调的基因中，内部登录号(in-houseaccessionnumber)为D4999、与UniGene群的Hs.420244中的EST(MGC47816)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)对应的基因，在11例HCC中的7例中与相应的非癌性肝组织相比是过表达的(图1)。为说明微阵列的结果，进行半定量RT-PCR，这表明与相应的非癌性肝组织相比，D4999的表达在另外8例HCC中的7例中是上升的(图2)。MGC47816的鉴定、表达和结构采用NationalCenterforBiotechnologyInformation中的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用D4999序列在公共数据库中进行的同源性检索鉴定了EST，其包括MGC47816(GenBank登录号NM_173642)和位于染色体带1q34.1的GenBank登录号AA971400的基因组序列。比较MGC47816cDNA及基因组序列表明此基因由5个外显子组成。推定的全长cDNA由1528个核苷酸组成，其中1176个核苷酸的开放阅读框架(SEQIDNO1)编码391个氨基酸的蛋白(SEQIDNO2)。预测的MGC47816蛋白的氨基酸序列显示与小鼠假定(hypothetical)蛋白B930030J24具有88％的同一性。采用简单模块结构研究工具(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)对蛋白基序的检索表明该预测的蛋白包含氨甲酰基-磷酸合酶L链和ATP结合区(密码子71-253)(图3)。HA标记的MGC47816蛋白的亚细胞定位为了研究MGC47816蛋白的亚细胞定位，将表达HA标记的质粒(pCMV-HA-MGC47816)瞬时转染至COS7细胞中。采用细胞提取物以及抗HA抗体的Western印迹分析揭示了与标记的蛋白对应的50-KDa的条带(图4a)。随后用这些抗体对细胞进行的免疫组织化学染色表明该蛋白主要存在于细胞质中(图4b)。表达MGC47816-siRNA的质粒对HCC细胞生长的影响为了研究MGC47816蛋白在癌细胞中的功能，我们构建了表达MGC47816-siRNA的质粒，并检测了它们对MGC47816表达的影响。用psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)、psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)转染Alexander和SNU449细胞表明，与psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)相比，psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)显著抑制细胞中的MGC47816表达(图5a)。为了检测抑制MGC47816是否可以导致肝细胞癌细胞的生长抑制，我们用psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)、psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)转染了Alexander和SNU449细胞。转染了psiH1BX-MGC47816-3(Si-3)的存活细胞与转染了psiH1BX-EGFP(EGFP)或psiH1BX-mock(Mock)的那些细胞相比显著减少，这提示MGC47816表达的降低抑制了肝细胞癌细胞的生长(图5b)。鉴定其表达在HCC中高频率发生上调的C2298用包含23,040个基因的cDNA微阵列对20例HCC的表达图谱以及相应非癌性肝组织进行分析。在HCC中高频率上调的基因中，内部登录号为C2298、与HES6(在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/的UniGene群的Hs.42949)对应的基因，在12例HCC中的11例中与相应的非癌性肝组织相比是过表达的(图6a)。为说明微阵列的结果，进行半定量RT-PCR，这表明与相应的非癌性肝组织相比，HES6的表达在另外8例HCC中的7例中是上升的(图6b)。HES6的鉴定、表达和结构采用NationalCenterforBiotechnologyInformation中的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)用C2298序列在公共数据库中进行的同源性检索鉴定了cDNA序列，其包括对应于HES6的GenBank登录号BC007939和位于染色体带2q37、GenBank登录号AA357675的基因组序列。HES6的cDNA序列由1375个核苷酸组成，其包含编码推定的224个氨基酸的蛋白(SEQIDNO28)的675个核苷酸的开放阅读框架(SEQIDNO27)(GenBank登录号BC007939)。第一个ATG侧接与在真核生物生物中启动翻译的共有序列一致的序列(GGCATGG)。比较HES6cDNA及基因组序列表明此基因由4个外显子组成。另外，用HES6的PCR产物作为探针实施多-组织Northern-印迹分析，检测出在睾丸、脊髓(spinalcode)和骨骼肌中表达的1.4kb的转录物(图7)。采用简单模块结构研究工具(SMART，http//smart.embl-heidelberg.de)对蛋白基序的检索表明该预测的蛋白包含螺旋-环-螺旋结构域和桔黄结构域(密码子31-80，94-135)(图8)。HA标记的HES6蛋白的亚细胞定位为了研究HES6蛋白的亚细胞定位，将表达HA标记(pCMV-HA-HES6)的质粒瞬时转染至COS7细胞中。采用细胞提取物以及抗HA抗体的Western印迹分析揭示了与标记蛋白对应的30-KDa的条带(图9a)。随后用这些抗体对细胞进行的免疫组织化学染色表明该蛋白主要存在于细胞核中(图9b)。表达HES6-siRNA的质粒对肝细胞癌细胞生长的影响。为了研究HES6蛋白在癌细胞中的功能，我们构建了表达HES6-siRNA的质粒，并检测了它们对HES6表达的影响。用psiH1BX-HES6-2、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock转染Alexander和HepG2细胞表明，与psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock相比，psiH1BX-HES6-2显著抑制细胞中的HES6表达(图10a)。为了检测抑制HES6是否可以导致HCC细胞的生长抑制，我们用psiH1BX-HES6-2、psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock转染了Alexander和HepG2细胞。转染了psiH1BX-HES6-2的存活细胞与转染了psiH1BX-EGFP或psiH1BX-mock的那些细胞相比显著减少，这提示HES6表达的降低抑制了肝细胞癌细胞的生长(图10b)。实施例3讨论cDNA微阵列技术已经发现了在多种人类肿瘤中的基因表达综合图谱。此方法揭示了癌细胞的复杂特性，并且使得能够对癌发生有更深入的理解。另外，该方法利于鉴定出在肿瘤中表达水平失调的基因，从而可以更精确地诊断肿瘤并开发出新的治疗策略。为揭示癌发生机理而设计的实验已经鉴定了数个抗-肿瘤剂的分子靶标。例如，最初为抑制与Ras相关的生长-信号途径而开发的法呢基转移酶抑制剂(FTI)已经显示能有效治疗动物模型中的Ras-依赖性肿瘤，其中Ras的活化依赖于翻译后法呢基化(SunJ.等，Oncogene161467-73，(1998))。在人类中，已使用抗癌药物与用以拮抗原癌基因受体HER2/neu的抗-HER2单克隆抗体trastuzumab的组合对人进行临床实验，其改善了乳腺癌患者亚组的临床反应和总存活率(MolinaMA，等，CancerRes614744-9.(2001))。已经开发了选择性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571用于治疗慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的构成性活化在白细胞转化中发挥着重要的作用。这种物质被设计用于抑制具体基因产物的致癌活性(O′DwyerME，等，CurrOpinOncol12594-7，(2000))。从药物动力学角度，抑制致癌信号比活化肿瘤抑制效果更易于操作。因此，通常上调的基因产物如MGC47816和HES6蛋白明显代表了用于设计新型抗癌药物的有希望的潜在靶标。如上所述，用小干扰RNA(siRNA)抑制MGC47816和HES6的表达显著降低了癌细胞的生长。尽管小干扰RNA(siRNA)抑制生长的精确分子机理仍需要弄清楚，本文的数据清楚地表明上述基因是HCC的良好候选诊断标记，并可代表用于开发治疗这些顽固性肿瘤的有效药物的分子靶标。工业实用性全基因组水平的cDNA微阵列的前述基因表达分析将MGC47816和HES6鉴定为特异性上调的基因。本发明认为MGC47816和HES6也可作为癌症预防和治疗的靶标。基于MGC47816和/或HES6的表达，本发明提供了鉴定或检测HCC的分子诊断标记。本文描述的方法还可用于鉴定预防、诊断和治疗HCC的其他分子靶标。本申请报道的数据使得对HCC的理解更全面，有利于开发新的诊断策略，并有助于鉴定治疗药物和预防药剂的分子靶标。这些信息使得对肝细胞肿瘤发生有了更深入的认识，并为开发诊断、治疗并最终预防HCC的新策略提供了启示。所有本文引用的专利、专利申请及文献都全文引入本文作为参考。进一步地，虽已参照具体实施方案对本发明进行了详细描述，应理解上述说明书是为了举例和说明，它应该说明本发明及其优选的实施方案。通过常规的试验，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明的精神和范围的情况下对说明书进行各种变动和修改是显而易见的。因此，本发明不应受上述说明书及如下权利要求书及其等效物的限制。序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPYSCIENCE，INC.)东京大学(THEUNIVERSITYOFTOKYO)<120>诊断肝细胞癌的方法<130>ONC-A0305P<150>US60/505,632<151>2003-09-24<160>28<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1528<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(133)..(1308)<223><400>1ccacgcgtccgcgggagcggagccgtggcgcgctcgccccggacgccggccgcccctccg60ctcgccctactgagcgagcggcccggggcgccgaggggtccgcgccgcgcggggcgcacc120gccctggccgccatgtgctcccagctctggttcctgacggaccggcgcatc171MetCysSerGlnLeuTrpPheLeuThrAspArgArgIle1510cgcgaggactacccgcaggtgcagatcctgcgcgccctccggcagcgc219ArgGluAspTyrProGlnValGlnIleLeuArgAlaLeuArgGlnArg152025tgctccgagcaggacgtgcgcttccgggcggtgcttatggaccagatc267CysSerGluGlnAspValArgPheArgAlaValLeuMetAspGlnIle30354045gccgtcaccatcgtcggcggccacctcggcctccagctaaaccagaag315AlaValThrIleValGlyGlyHisLeuGlyLeuGlnLeuAsnGlnLys505560gccctcaccactttcccggatgtggtgcttgtacgggtacccacaccc363AlaLeuThrThrPheProAspValValLeuValArgValProThrPro657075tcagtgcagtcagacagtgacatcactgtcctgcgacacctggagaag411SerValGlnSerAspSerAspIleThrValLeuArgHisLeuGluLys808590ctgggctgccggttggtcaatcgcccacagagcatcttaaattgcatc459LeuGlyCysArgLeuValAsnArgProGlnSerIleLeuAsnCysIle95100105aacaaattctggacgttccaagaactggctggacatggggtccccatg507AsnLysPheTrpThrPheGlnGluLeuAlaGlyHisGlyValProMet110115120125ccagacaccttctcctatggtgggcatgaagacttttcaaaaatgatt555ProAspThrPheSerTyrGlyGlyHisGluAspPheSerLysMetIle130135140gatgaagctgagcccctgggctacccagtcgtggtgaagagcacacga603AspGluAlaGluProLeuGlyTyrProValValValLysSerThrArg145150155ggccaccggggaaaagctgtttttctggcaagagataaacatcacctc651GlyHisArgGlyLysAlaValPheLeuAlaArgAspLysHisHisLeu160165170tctgacatctgccatctgatccgccacgatgtgccctacctgttccag699SerAspIleCysHisLeuIleArgHisAspValProTyrLeuPheGln175180185aagtacgtgaaggagtcccatggaaaggacatccgggtggtggtggta747LysTyrValLysGluSerHisGlyLysAspIleArgValValValVal190195200205gggggccaggtcataggctctatgcttcgctgctccactgatggacgg795GlyGlyGlnValIleGlySerMetLeuArgCysSerThrAspGlyArg210215220atgcagagcaactgctctctcggtggcgtgggcgtcaagtgtccgctg843MetGlnSerAsnCysSerLeuGlyGlyValGlyValLysCysProLeu225230235acagaacaaggcaagcagttggctattcaggtgtccaacatcctaggc891ThrGluGlnGlyLysGlnLeuAlaIleGlnValSerAsnIleLeuGly240245250atggacttctgtggcattgatctccttatcatggacgatggctccttt939MetAspPheCysGlyIleAspLeuLeuIleMetAspAspGlySerPhe255260265gtggtgtgtgaggcaaatgctaatgttggcttcctagcctttgaccag987ValValCysGluAlaAsnAlaAsnValGlyPheLeuAlaPheAspGln270275280285gcatgcaacttagatgtgggtgggatcattgcagactataccatgtcc1035AlaCysAsnLeuAspValGlyGlyIleIleAlaAspTyrThrMetSer290295300ttgctgccaaataggcagactggaaagatggctgtcctcccaggactg1083LeuLeuProAsnArgGlnThrGlyLysMetAlaValLeuProGlyLeu305310315tcgagtccaagggagaagaacgagccggatggctgtgcttcagctcag1131SerSerProArgGluLysAsnGluProAspGlyCysAlaSerAlaGln320325330ggagttgcagagagcgtctataccatcaacagtgggtctacctctagc1179GlyValAlaGluSerValTyrThrIleAsnSerGlySerThrSerSer335340345gaaagtgagcctgaactgggagagatccgggattcctcagcaagcaca1227GluSerGluProGluLeuGlyGluIleArgAspSerSerAlaSerThr350355360365atgggggccccaccctccatgctgcccgaacctggctacaacattaac1275MetGlyAlaProProSerMetLeuProGluProGlyTyrAsnIleAsn370375380aacaggattgcttctgagttaaaacttaagtgaattcctgctttttggcagca1328AsnArgIleAlaSerGluLeuLysLeuLys385390tttaaaccaaatcctactgcttccctagtagttttgagtgaataaaatctggactaatgt1388gatttcatttgcacagaaactagaaatcccatctgggcactcagcattttttctaacgat1448gatttaagcaaatggcctagctttgtggtttttacaaagacaaatataaaaacactcaca1508agaacaaaaaaaaaaaaaaa1528<210>2<211>391<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2MetCysSerGlnLeuTrpPheLeuThrAspArgArgIleArgGluAsp151015TyrProGlnValGlnIleLeuArgAlaLeuArgGlnArgCysSerGlu202530GlnAspValArgPheArgAlaValLeuMetAspGlnIleAlaValThr354045IleValGlyGlyHisLeuGlyLeuGlnLeuAsnGlnLysAlaLeuThr505560ThrPheProAspValValLeuValArgValProThrProSerValGln65707580SerAspSerAspIleThrValLeuArgHisLeuGluLysLeuGlyCys859095ArgLeuValAsnArgProGlnSerIleLeuAsnCysIleAsnLysPhe100105110TrpThrPheGlnGluLeuAlaGlyHisGlyValProMetProAspThr115120125PheSerTyrGlyGlyHisGluAspPheSerLysMetIleAspGluAla130135140GluProLeuGlyTyrProValValValLysSerThrArgGlyHisArg145150155160GlyLysAlaValPheLeuAlaArgAspLysHisHisLeuSerAspIle165170175CysHisLeuIleArgHisAspValProTyrLeuPheGlnLysTyrVal180185190LysGluSerHisGlyLysAspIleArgValValValValGlyGlyGln195200205ValIleGlySerMetLeuArgCysSerThrAspGlyArgMetGlnSer210215220AsnCysSerLeuGlyGlyValGlyValLysCysProLeuThrGluGln225230235240GlyLysGlnLeuAlaIleGlnValSerAsnIleLeuGlyMetAspPhe245250255CysGlyIleAspLeuLeuIleMetAspAspGlySerPheValValCys260265270GluAlaAsnAlaAsnValGlyPheLeuAlaPheAspGlnAlaCysAsn275280285LeuAspValGlyGlyIleIleAlaAspTyrThrMetSerLeuLeuPro290295300AsnArgGlnThrGlyLysMetAlaValLeuProGlyLeuSerSerPro305310315320ArgGluLysAsnGluProAspGlyCysAlaSerAlaGlnGlyValAla325330335GluSerValTyrThrIleAsnSerGlySerThrSerSerGluSetGlu340345350ProGluLeuGlyGluIleArgAspSerSerAlaSerThrMetGlyAla355360365ProProSerMetLeuProGluProGlyTyrAsnIleAsnAsnArgIle370375380AlaSerGluLeuLysLeuLys385390<210>3<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>3acaacagcctcaagatcatcag22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>4ggtccaccactgacacgttg20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>5caaataggcagactggaaagatg23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>6ctagggaagcagtaggatttggt23<210>7<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>7attgtcgacgctcgccctactgagcgagcg30<210>8<211>36<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>8aatctcgagagcaggaattcacttaagttttaactc36<210>9<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>9tggtagccaagtgcaggttata22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>10ccaaagggtttctgcagtttca22<210>11<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>11tgcggatccagagcagattgtactgagagt30<210>12<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>12ctctatctcgagtgaggcggaaagaacca29<210>13<211>47<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>13tttaagcttgaagaccatttttggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaac47<210>14<211>34<212>DNA<213>人工的<220><223>用于RT-PCR的人工合成引物序列<400>14tttaagcttgaagacatgggaaagagtggtctca34<210>15<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>对于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>15caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>对于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>16aaaagaagcagcacgacttcttctctcttgaagaagaagtcgtgctgcttc51<210>17<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>对于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>17tcccgtgtccgctgacagaacaattcaagagattgttctgtcagcggacac51<210>18<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>对于siRNA的人工合成寡核苷酸序列<400>18aaaagtgtccgctgacagaacaatctcttgaattgttctgtcagcggacac51<210>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C的方法，该方法包括向所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物降低MGC47816或HES6的表达。17.权利要求16的方法，其中所述siRNA包含有义链，该有义链含有选自SEQIDNO19或26的核苷酸序列作为靶序列。18.治疗或预防受试者中的HCC的方法，该方法包括向所述受试者施用药学有效量的抗体或其片段的步骤，所述抗体或其片段与MGC47816或HES6编码的蛋白相结合。19.治疗或预防受试者中的HCC的方法，该方法包括向所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含(a)MGC47816或HES6编码的多肽，(b)所述多肽的免疫活性片段，或(c)编码所述多肽的的多核苷酸。20.治疗或预防受试者中的HCC的方法，所述方法包括施用根据权利要求8-13任一项的方法获得的化合物的步骤。21.用于治疗或预防HCC的组合物，所述组合物包含药学有效量的相对于MGC47816或HES6的反义多核苷酸或小干扰RNA(siRNA)作为活性组分，并包括药学可接受载体。22.权利要求21的组合物，其中所述siRNA包含有义链，所述有义链含有选自SEQIDNO19或26的核苷酸序列作为靶序列。23.用于治疗或预防HCC的组合物，所述组合物包含药学有效量的与MGC47816或HES6编码的蛋白相结合的抗体或其片段作为活性组分，并包含药学可接受载体。24.用于治疗或预防HCC的组合物，所述组合物包含药学有效量的根据权利要求8-13任一项的方法选出的化合物作为活性组分，并包含药学可接受载体。25.小干扰RNA，其中其有义链包含选自SEQIDNO19或26的核苷酸序列作为靶序列。全文摘要本文描述了检测、诊断、治疗并预防肝细胞癌(HCC)的客观的方法。具体地，本发明涉及两个与正常细胞相比在HCC细胞中上调的基因，在本文称为MGC47816和HES6。在一个具体实施方案中，诊断方法涉及测定在肝细胞癌细胞和正常细胞间有差异的MGC47816或HES6的表达水平。本发明进一步提供了筛选在HCC治疗中有用的治疗物质的方法、治疗HCC的方法、和为预防HCC对受试者进行接种的方法。文档编号G01N33/574GK1890382SQ20048003472公开日2007年1月3日申请日期2004年9月14日优先权日2003年9月24日发明者中村佑辅,古川洋一申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司