专利名称：多西他奇在治疗肝细胞癌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝细胞癌的治疗。
肝细胞癌(HCC)在东南亚和非洲国家是最常见的癌症之一。在台湾，HCC是男性癌症患者死亡的最主要原因。HCC患者的幸存率非常低。这主要是由于缺乏有效的治疗。至今尚未证明放射和化学疗法令人满意；外科手术是最有效的治疗HCC的手段。然而，外科手术只适用于带有小的可切除肿瘤的患者。
近年来，抗有丝分裂药物(例如紫杉酚(paclitaxel))重新受到了关注。紫杉酚最初由浆果紫杉树的树皮分离而得。自从1971年就已经知道了紫杉酚的抗肿瘤作用。紫杉酚通过它对微管组装的作用来抑制肿瘤细胞分裂。应用肿瘤细胞的体外分析揭示了，紫杉酚抑制细胞主要发生在细胞周期的G2/M期[Schiff PB和Horwitz SB，美国国家科学院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)77，1561～1565，1980]。最近的研究表明，紫杉酚对各种恶性肿瘤细胞(例如，脑瘤、胃癌和前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤和卵巢癌)是非常有效的。
然而，紫杉酚对肝细胞癌无效。紫杉酚对HCC患者的II期临床试验被报道在英国癌症杂志(British Journal of Cancer)，78(1)，34～39，1998。该文总结出，紫杉酚对HCC患者没有明显的抗癌作用。
如上所述，已经发现紫杉酚的细胞毒性作用具有细胞周期依赖性，细胞周期抑制主要发生在G2/M期。然而，现已发现了，多西他奇(docetaxel)可达到在HCC细胞中无细胞周期依赖性的细胞毒性。这表明多西他奇对HCC细胞的细胞毒性作用可通过不同于紫杉酚的机理达到。此外，在浓度至多为1μM时，多西他奇抗HCC细胞的体外活性显著高于紫杉酚。已知紫杉醇类(taxoids)的高细胞毒性，低浓度下增长的活性表明，多西他奇不同于紫杉酚，将会在肝细胞癌的临床治疗中得到实际应用。
因此，本发明提供了多西他奇或其水合物在生产用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。
还提供了一种治疗患肝细胞癌的患者的方法，该方法包括，对所述患者施用有效量的多西他奇或其水合物。本发明还提供了一种改善肝细胞癌患者状况的方法，该方法包括，对所述患者施用有效量的多西他奇或其水合物。
多西他奇是一种已知化合物。它具有如下分子式 在EP-A-253738和EP-A-336841中描述了制备多西他奇的方法。
可应用例如呈无水形式或作为水合物的多西他奇。本文所用的对多西他奇的说明包括对它的水合物的说明。
多西他奇水合物可这样制备将无水多西他奇溶于有机溶剂(如丙酮、乙醇、乙腈或N，N-二甲基甲酰胺)中，以及通过将这样获得的溶液加到水中使多西他奇水合物重结晶。多西他奇水合物通常是二水合物、三水合物或四水合物。具体地说，发现三水合物特别稳定，因此多西他奇三水合物是优选的。多西他奇三水合物可通过EP-A-770070中叙述的方法制备。
多西他奇对抗肝细胞癌有意外的活性。特别是它可用来治疗肝细胞癌、纤维层变体和混合肝细胞胆管癌。
在本发明中，可按多西他奇给药的已知任何常规途径施用多西他奇。这样，例如，可胃肠外给药。通常，将它通过静脉内给药，优选通过静脉内输注。
在本发明中，通常作为一种药物上可接受的组合物配制多西他奇供给药，所述组合物含多西他奇和药物上可接受的载体或稀释剂。合适的载体和稀释剂包括无毒溶剂和悬浮介质，例如无菌水性介质。优选地，所述组合物呈水溶液或悬浮液的形式，例如，适合注射或输注的溶液，它可包含乳化剂、着色剂、防腐剂或稳定剂。
适合肠胃外给药的药物组合物包括无菌含水或非水溶液或悬浮液。合适的无菌非水溶液和悬浮液包括天然植物油(例如，橄榄油，芝麻油或液体石油)或者可注射的有机酯(如油酸乙酯)中的溶液和悬浮液。合适的无菌水溶液包括多西他奇在水中的溶液。通常，可适当地调节适合肠胃外给药的无菌水溶液的pH值。此外，通常将这类无菌水溶液配制成等渗的，例如用足量的氯化钠或葡萄糖。特别优选的是，适合通过输注给药的溶液具有与血液相似的pH值并且被配制成等渗的。
可通过加热或任何其它不会不利地影响组合物的方法来灭菌。
适用于本发明的包含多西他奇的药物组合物可进一步包含表面活性剂。优选的表面活性剂是聚山梨酯、聚氧乙烯二醇酯和聚乙二醇的酯醚和蓖麻油。合适的表面活性剂和包含表面活性剂的药物组合物的实例可见于AU-A-666859中。
可将多西他奇作为一种冻干的组合物配制而用于本发明中。这类冻干组合物具有良好的物理和化学稳定性，所以可长期贮存。包含多西他奇的冻干组合物可根据标准技术通过冻干多西他奇的水溶液制备。它们可进一步包含增量剂(例如乳糖)。它们还可包含张力调节剂(例如糖类和聚合物)。合适的张力调节剂实例包括葡萄糖，右旋糖和甘露醇以及聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)。
可在使用时将冻干组合物再溶于任何相容的和药物上可接受的可注射介质中。可能有利的是，用体积与需要冻干的溶液初始体积相等的注射级二次蒸馏水溶解冻干物。
适用于本发明的包含多西他奇的药物组合物通常包含至少0.01wt％的治疗活性产物。一般说来，药物组合物包含0.01～1000mg、优选0.1～500mg治疗活性产物。
优选地，适合静脉内注射的溶液包含38～42mg/ml、更优选大约40mg/ml的活性产物。通常，将这种溶液盛在含有20mg或80mg活性产物的小瓶中。
优选地，适合输注的溶液包含0.1～11mg/ml、优选0.1～10mg/ml、更优选0.3～0.9mg/ml的活性产物。
本发明用多西他奇的治疗处理可同时结合其它治疗方法(包括用其它抗肿瘤药物、单克隆抗体的治疗，免疫疗法或放射疗法或生物反应调节物)进行治疗。合适的生物反应调节物包括淋巴因子和细胞因子，例如，白细胞介素，干扰素(α、B或δ)和TNF。适用于治疗因异常细胞增殖而引起的障碍的其它化疗剂包括烷基化剂，例如，氮芥子气(例如，氮芥、环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)，烷基磺酸酯(例如，白消安)，亚硝基脲(例如，卡莫司汀、罗氮芥、司莫司汀和链佐星)，三氮烯(例如达卡巴嗪)，抗代谢物，诸如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)，嘧啶类似物(例如，氟脲嘧啶和阿糖胞苷)，嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤和硫代鸟嘌呤)，天然产物，诸如长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱和长春地辛)，表鬼臼毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)，抗生素(例如，放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博莱霉素、兽卡霉素和丝裂霉素)，酶(例如L-天冬酰胺酶)，各种作用剂，诸如铂的配位络合物(例如顺铂)，取代脲(例如羟基脲)，甲肼衍生物(例如，丙卡巴肼)，肾上腺皮质抑制药(例如，米托坦和氨鲁米特)，激素和拮抗剂，诸如肾上腺皮质类固醇(adrenocorticosteroids)(例如泼尼松)，孕酮(例如，己酸羟孕酮、醋酸甲氧孕酮(methoxyprogesterone acetate)和醋酸甲地孕酮)，雌激素(例如，二乙基己烯雌酚和乙炔雌二醇)，抗雌激素(例如他莫昔芬)，以及雄激素(例如，丙酸睾酮和氟羟甲睾酮)。
同时用环磷酰胺、5-氟脲嘧啶、依托泊苷、长春瑞滨或甲氨蝶呤的治疗是优选的，因为这些化合物与多西他奇之间可达到协同作用。此外，2-甲氧基雌二醇对抗肝细胞癌具有活性，并且发现对小鼠每日治疗达一个月后有良好的耐受性(Klauber等，癌症研究(CancerResearch)，57，81～86，1997)。因此，同时用2-甲氧基雌二醇治疗也是优选的，特别是需要长期治疗时。
在本发明中，以能治疗肝细胞癌的剂量施用多西他奇。剂量根据给药途径和患者的身体特征而变。合适的剂量包含对治疗由于异常细胞增殖而引起的障碍有疗效的剂量。可根据达到要求的疗效所需的频次施用多西他奇。
治疗人的多西他奇典型剂量是50～150mg、优选60～100mg、更优选约100mg多西他奇/m2患者皮肤表面积。当通过输注施用多西他奇时，输注率通常是每小时1～200、优选约100mg/m2多西他奇。
可根据需要重复上述剂量。通常，每日或每周重复。优选地，每三周重复一次。例如，可每3星期以约100mg/m2的剂量静脉内输注多西他奇1小时。
如下实施例阐述了本发明。实施例材料与方法除非另外说明，所用的方法是标准生化技术。所用的细胞系都是可商购的。细胞培养下面详述的试验涉及人肝癌细胞系Hep3B(ATCC名称HB 8064)、HepG2(ATCC名称HB 8065)和HA22T/VGH，以及鼠肝癌细胞系Hepa 1-6。将这些细胞在含10％胎牛血清(Hyclone)、0.01mg/ml庆大霉素和0.1mM非必需氨基酸的DMEM(GIBCO，BRL)中培养。使细胞在37℃下，含5％CO2和95％的滤过空气的CO2培养箱中生长。药物治疗在下面详述的试验中，用不同浓度的紫杉酚(0.001～10μM)和多西他奇(0.001～10μM)处理上述肝癌细胞达24小时和72小时。将紫杉酚溶于二甲亚砜(DMSO)和将多西他奇溶于乙醇中作为储备溶液。载体的最终浓度低于0.1％。细胞生存力研究MTT测定将细胞以4×104个细胞/ml的密度在96孔细胞培养聚簇(COSTAR)中培养。药物治疗24小时或72小时后，弃去培养基，用等体积(100μl)包含MTT(0.456mg/ml；3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓)的新鲜培养基代替，并且在37℃下保温1.5小时。然后，弃去上述新鲜培养基，再添加100μl DMSO。通过比色比较在570nm的吸收波长从微量培养板读数器(SPECTRA MAX 250)读取OD值而测定细胞生存力。
结果如
图1所示，其中，实心圆表示处理24小时后的数据，而空心圆则表示处理72小时后的数据。数据是平均值±平均标准误差(从三次独立试验的双份样本获得的)。碘化丙锭(PI)排斥测定使细胞在5-cm2烧瓶(CORNING)中生长，如上述那样用紫杉酚和多西他奇处理。然后，添加碘化丙锭(10μg/ml)，在37℃下保温15分钟。接着，在收获粘着的细胞前收集培养基。收集悬浮的和粘着的细胞，重悬浮于500μl PBS供下述流式细胞仪分析。通过FSC-SSC闸门除去碎片信号。
DNA含量的流式细胞仪分析将溶胞缓冲液(0.5％Triton X-100，0.2μg/ml Na2EDTA.2H2O，和溶于PBS中的1％牛血清白蛋白)加到细胞粒状沉淀上，再将细胞粒状沉淀放在冰上15分钟。然后将预先冷却到-20℃的100％的甲醇加到混合物中，再在300×g下离心5分钟。弃去上清液，用PBS洗涤细胞粒状沉淀。将该洗涤过的细胞粒状沉淀用DNA染色液(50μg/ml碘化丙锭，和5孔尼茨/ml的RNA酶A)在4℃下暗处染色30分钟。采用下述Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪测量每个细胞的DNA含量。流式细胞仪在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上用具有488nm入射光束的氩离子激光(15mW)分析这些细胞(10000)。就PI排斥测定而言，通过585 nm滤光器收集红色荧光，并且通过FSC-SSC闸门除去细胞碎片信号。应用Power Macintosh 7600/120计算机上的FACS/CELLQuest软件获取并分析数据。通过ModFit LT软件测定凋亡的细胞和处于特定周期的细胞。
流式细胞术的结果如表1和表2和图2所示。表1给出了用紫杉酚和多西他奇处理后肝癌细胞的细胞膜透性的数据。表2详述了用紫杉酚和多西他奇处理后发现的凋亡(sub-G0/G1)细胞的百分数。图2示出了详述紫杉酚和多西他奇对细胞周期进展的影响的DNA矩形图分析。
表1用紫杉酚和多西他奇处理后的肝癌细胞的细胞膜透性。
数据是平均值±平均标准误差(从至少三次独立试验的重复样品获得的)。用药物处理细胞24～72小时，膜透性是通过对存活肝癌细胞中丙锭的排斥的流式细胞仪分析测定的。数据是完整细胞膜的细胞百分数(与对比物比较)。
表2紫杉酚和多西他奇诱导的编程性细胞死亡
数据是通过流式细胞术测定的凋亡(sub-G0/G1)细胞的百分比。DNA断裂电泳分析DNA断裂评估是根据Herrmann等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)，22，5506～5507，1994中的方法进行的。
简单地说，用紫杉酚和多西他奇处理HEP G2细胞(2×107)72小时并离心。用NP-40溶胞缓冲液(1％NP-40于20mM EDTA中，50mMTris-HCl，pH7.5)重悬浮所得的细胞粒状沉淀。细胞溶解几秒后，收集上清液(在1600×g下进行5分钟)。用相同的溶胞缓冲液重复萃取。往上清液中添加SDS(最终浓度1％)和核糖核酸酶(最终浓度为2.5μg/μl)，在56℃下保温2小时，接着，在37℃下用蛋白酶K(2.5μg/μl)消化2小时。然后，将该混合物加到10M醋酸铵中，再在-20℃下用100％乙醇沉淀30分钟。通过离心(在12000×g下进行10分钟)收集DNA，接着，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果如图3所示。在图3中，M为100个碱基对标记。泳道1示出培养基对比物。泳道2和3示出平均紫杉酚(0.1和1μM)处理组。泳道4和5示出平均多西他奇(0.1和1μM)处理组。结果细胞生存力研究图1示出了紫杉酚和多西他奇对肝癌细胞系(Hep G2，Hep 3B，HA22T/VGH和Hepa 1-6)中细胞生存力的剂量依存性影响。从图1中很明显地看到，在0.01和0.1μM时几乎各情况下多西他奇都达到了生存力的降低。
在Hep G2细胞中，用紫杉酚或多西他奇处理后细胞生存力都表现出一个减弱的趋势。紫杉酚(10μM)组的Hep G2细胞的生存力在24和72小时分别是对比组的61.81％和39.45％。对多西他奇处理的HepG2细胞来说，在1μM多西他奇时观察到生存力降低最大。发现在10μM时生存力不再降低。用1μM多西他奇处理的细胞在24和72小时它们的生存力分别是65.03％和48.99％。
在Hep 3B细胞中，值得注意的是，用0.01μM多西他奇处理72小时后观察到生存力的显著降低(37.06％)。
在多西他奇处理过的Hepa 1-6细胞中，在24和72小时发现1μM多西他奇处理组分别具有最大细胞毒性(65.34％和30.71％)。碘化丙锭(PI)排斥测定表1表明，用紫杉酚和多西他奇处理的Hep G2细胞和Hep 3B细胞的膜透性是剂量和时间依赖性的。
至于HA22T/VGH细胞，与多西他奇组相比，紫杉酚(0.01～1μM)处理72小时后观察到膜透性的少量增长。值得注意的是，在0.01μM多西他奇处理72小时后只有55.44％的细胞具有完整的膜，然而，用相同剂量的紫杉酚处理后，92.58％的处理细胞具有完整的膜。细胞周期分析图2表明，1μM紫杉酚处理Hep G2细胞24小时导致明显的G2/M期抑制。在接触后72小时观察到相似的DNA柱状图。
如表2所示，用0.001μM、0.01μM、0.1μM和1μM的多西他奇处理24小时后，发现凋亡的细胞(sub-G0/G1)凋亡百分数分别为31.02％、45.24％、38.77％和28.33％。多西他奇处理(0.001～1μM)后72小时，凋亡百分数分别为21.92％、42.45％、42.44％和56.66％。
在Hep 3B细胞中，经24小时的0.1μM或1μM紫杉酚处理导致G2/M期抑制，而与0.1μM或1μM紫杉酚保温72小时导致sub-G0/G1的百分数分别增长到38.37％或47.01％。相反，用0.01μM、0.1μM或1μM多西他奇处理Hep 3B细胞24或72小时导致高水平的sub-G0/G1群体含量，即，24小时分别为59.14％、58.69％和65.74％，72小时为64.12％、81.66％和79.33％。
在HA22T/VGH细胞中，紫杉酚(0.001μM～1μM)增加的浓度和在24小时G2/M细胞提高的百分数有关。在0.1μM或1μM紫杉酚处理组72小时时观察不到明显的sub-G0/G1群体。与之相反，非常显著的是0.01μM多西他奇处理的HA22T/VGH细胞在24小时比0.1μM(18.61％)或1μM(22.94％)的多西他奇组有更高的sub-G0/G1百分数(41.75％)。当用多西他奇处理细胞72小时后，发现在0.01μM(56.64％)、0.1μM(58.61％)和1μM(60.98％)多西他奇处理的HA22T/VGH细胞中有显著的sub-G0/G1百分比。
就Hepa 1-6细胞来说，紫杉酚处理(0.01、0.1或1μM)24小时导致增加了sub-G0/G1群体(分别为24.02％、55.64％或64.38％)的形成，并且可在0.1μM和1μM紫杉酚处理组观察到G2/M期抑制。当用0.1μM和1μM紫杉酚处理Hepa 1-6细胞72小时后，大多数细胞都死了，并且没有明显的细胞周期分布。Hepa 1-6细胞的多西他奇处理(0.01μM、0.1μM或1μM)导致sub-G0/G1细胞的形成(分别在24小时为52.81％、50.76％和53.8％以及在72小时为31.25％、53.95％和62.49％)。DNA断裂分析图3表明紫杉酚(0.1和1μM)和多西他奇(0.1和1μM)处理诱导Hep G2细胞中的DNA断裂。
权利要求
1.一种用于治疗肝细胞癌的组合物，它包含作为活性成分的多西他奇或其水合物。
2.权利要求1的组合物，其中，所述水合物是三水合物。
3.权利要求1或2的组合物，它适合肠胃外给药。
4.权利要求3的组合物，它适合腹膜内、皮下、静脉内、肌内或胸骨内给药且包含38～42mg/ml的活性化合物。
5.权利要求3的组合物，它适合通过输注给药且含有0.1～11mg/ml的活性化合物。
全文摘要
本发明基于这一发现,即,在至多1μM的浓度时,多西他奇比紫杉酚对肝细胞癌具有明显更大的活性。所以,它提供了多西他奇或其水合物在生产用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。
文档编号A61P1/16GK1372466SQ00811450
公开日2002年10月2日 申请日期2000年8月29日 优先权日1999年8月31日
发明者戚谨文, 林恒良, 刘宗荣, 雷永耀, 周嘉扬 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司