专利名称：用于治疗肝细胞癌的药物组合物和药剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供用于治疗肝细胞癌(HCC)的包括Notch3抑制剂和化学疗法药剂的药 物组合物，用于制备所述组合物的方法和包括对有需要的患者施用所述药物组合物的医学 治疗。
背景技术：
肝细胞癌在全世界所有人类癌症中发病率占第五位，每年引起一百万人死亡。尽 管有很多有前途的治疗方法可选择，其包括外科切除、乙醇或射频消融、化疗栓塞、和肝移 植，但在晚期疾病患者中的长期预后依然不足。目前，栓塞是非切除性的HCC最广泛使用的初级治疗，其用于等待肝捐赠的患者 以预防HCC的发展的最常使用的治疗，所述HCC的发展会排除移植。栓塞剂通常与选择性 的内动脉细胞毒素一起施用，其中最常使用的是阿霉素。尽管这种疗法明显推迟肿瘤进程 以及血管入侵，这个方法仅在患者中得到部分响应。尽管有新治疗形式的近期发展，发现克服对HCC的化学疗法药剂的抵抗的治疗分 子需要依然很紧迫。Notch受体包含在增殖、分化和凋亡中。由于在人类癌症中Notch信号 通路的异常失控的增加的迹象，Notch受体为用于选择性杀死恶性细胞的潜在标靶。四个已知的Notch受体(Notchl-4)是单次跨膜受体，在发育的所有时期介导信号 从细胞表面至细胞核以调节增殖、分化和凋亡。Notch受体主要由Delta和Serrate/jagged 家族跨膜配体激活，跨膜配体在相邻细胞表面表达。配体介导的Notch的活化诱导Notch 细胞内区域(Ni⑶)的蛋白水解断裂和核转运，NI⑶结合至转录因子CBFl/RBP-Jk反式激 活靶基因，包括HESl。已经报导在多种不同的人类肿瘤中失控的Notch受体的表达。已经在人类的乳房 癌、胰腺癌以及霍奇金淋巴瘤中观察到增加的Notchl蛋白的表达。已经在恶性黑色素瘤、 胰腺癌和乳房癌中发现Notch3和Notch4的过量表达。Notchl信号通路在大白鼠肝脏再生中被激活，并发现Notchl的过量表达抑制体 外和体内的HCC细胞生长。看来Notchl的组成型活化可以通过诱导细胞生长停止，在小细胞肺癌细胞中、前 列腺癌细胞中和小鼠皮肤中，作为肿瘤抑制物起作用。近期发现Notch3在人类H印G2肝癌细胞系中高度表达，但到目前为止，没有关于 Notch3在HCC中的作用的研究。在肿瘤领域，基因治疗代表新的以及有前途的策略，该策略依赖于将基因材料转 移至细胞中以产生抵抗疾病的有益效果。小干扰RNA(SiRNA)是利用所有细胞的自然性质， 通过促进目标mRNA的降解或翻译的消除来指导特定基因沉默的新兴技术。在过去的几年 中，已开发多种手段来表达和传递短发夹环RNA(shRNA)，通过哺乳动物细胞的天然的RNA 加工机制有效地转化成siRNA。因此，由于已确定的相对于它们靶mRNA的高特异性，研究特 异性shRNA以用于抵抗包括癌症的多种人类疾病的潜在的新疗法的开发。
尽管已知Notch受体，依赖于它们在多种细胞环境中的表达水平，在恶性细胞的 凋亡抵抗中起重要作用，它们的作用机理仍然很大程度上未知，因此限制了抵抗与所述受 体相关的肿瘤医学治疗的可能性。关于HCC，抵抗以上列出的所述疾病的医学限制，在医学领域，加重了对提供抵抗 HCC恶性细胞的扩散和存在的有效治疗的药物的需要。
发明内容
在本发明中，研究了人类HCC组织样品和相邻的无HCC组织中Notch受体的表达； 并且评估了在H印G2细胞中，通过shRNA消除Notch3表达的生理学效果。已发现Notch3 选择性地在HCC中表达，而在周围的无HCC组织中不表达。与之前在HCC细胞系中的研究一致，该研究表明Notchl过量表达通过p21上调抑 制细胞生长，本发明的作者通过免疫印迹分析发现，通过目标shRNA敲除的Notchl表达的 缺失极大地减少了 P21蛋白表达(图6)。但是，与基于已知技术和在HCC中获得的Notch受体的其它结果相反，令人惊讶地 发现，通过目标shRNA或通过抗Notch3抗体的Notch3活性的抑制，没有改变IfepG2生长速 率。本文中，细胞生长参数在转染后一周通过碘化丙啶染色和流式细胞仪估定。获得的结 果显示，在H印G2细胞中，Notch3的敲除引起磷酸化的p53的积聚和p21的抑制，对细胞生 长或存活没有明显效果。因此，与Notchl相反，Notch3没有显现出对人类HCC增殖的贡献， 至少在这个体外环境中。引入注目地，通过台盼蓝染色排除试验显示，稳定表达Notch3shRNA (相比较于荧 光素酶shRNA阴性对照)的HepG2细胞的死亡率用阿霉素(或其它用于癌症治疗的分子) 处理6和24小时分别成两倍和三倍(图3)。另一方面，如图10中所示，Notchl的消除对药物诱导凋亡中没有可论证的效果。因此，Notch3的表达，通过阻止p53依赖的凋亡的活化，至少部分地作为多药抗性 的特定的阳性效应物起作用，以及作为结果，造成HCC对化学疗法或其它环境胁迫具有抗性。因此，本发明的目的是用于治疗肝细胞癌的包括Notch3抑制剂、抗肿瘤化学疗 法药剂和药物学合适载体的药物组合物，用于所述组合物制备的方法以及包括向需要的患 者施用所述组合物的医学治疗。
图1.相对于相邻的无HCC肝脏组织，在HCC中增加的Notch3免疫反应性。含有 HCC和周围的无肿瘤肝脏的福尔马林固定的石蜡切片用抗Notch3多克隆抗体免疫染色。免 疫反应性用HRP兔子EnVision系统显示，二氨基联苯胺作为色原体(褐色沉淀物)。片段 用Mayer的苏木精复染色。图片是HCC(A、C)和周围无HCC肝脏(B、D)用抗Notch3多克隆 抗体免疫染色的典型例子。图2.蛋白和基因表达。(A)在!fepG2感染细胞中，Notch3、p53、p-p53、p21、 Gadd45 α、p27的Western印迹。密度计量分析显示在Notch3细胞缺失的细胞中，p21水 平降低5倍，而p27 (2. 3倍)、Gadd45 (2倍)、p53 (5倍)和p-p53 (3. 2倍)的蛋白表达增力口。对于mRNA和蛋白水平，均使用β肌动蛋白作为参考对照。(B)Western印迹表明两个 Notch3shRNA产生相等的渗透的Notch3敲除。(C)在表达shRNA的!fepG2细胞中，HESU P53和WAF的RT-PCR表达分析。进行了两次独立的实验。CS :GL2阴性对照shRNA，N3S Notch3shRNA。图3.处理后细胞存活率。感染的细胞用100μ g/ml阿霉素处理预定次数。每次 阿霉素处理后，计算台盼存活率重复两次，每个样品计算至少200个细胞。两个独立实验的 柱状平均值；条纹，SE。CS :GL2阴性对照shRNA，N3S :Notch3shRNA。图4.凋亡分析。培养的感染的H印G2细胞用100 μ g/ml阿霉素处理6小时、12小 时、18小时和24小时，然后进行蛋白提取。蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分解，然后用单克 隆抗人分裂的PARP进行western印迹分析。β肌动蛋白用作蛋白水平参考对照。CS :GL2 阴性对照 shRNA，N3S :Notch3shRNA。图5. DNA损伤和阿霉素吸收的分析。(A)通过彗星实验检测DNA损伤。感染的 !fepG2细胞在含有100 μ g/ml阿霉素的完全培养基中培养1、3、6、12、18个小时，随后用彗 星实验测量DNA链破损量。基础DNA损伤(没有阿霉素)显示阴性对照H印G2细胞具有 与Notch3缺失细胞一样的损伤(P = 0. 6686)。(B)阿霉素吸收。感染的细胞用100 μ g/ ml阿霉素处理不同次数，通过FACS实验测量药物吸收。Notch3缺失细胞比阴性对照吸 收明显更高水平的阿霉素。两个独立实验的柱状平均值；条纹，SE。CS 对照shRNA，N3S Notch3shRNA。图6.在Notchl缺失细胞中减少的p21表达。Western印迹分析证明，相比于阴性 对照(CS)，在Notchl缺失细胞(NlS)中，p21的水平降低和p53及p-p53的水平未变化。图 7· p53 短干扰 RNA。感染的细胞用 40nM p53siRNA 或 40nM零乱 siRNA(scRNA)转 染，转染后48小时和72小时通过western印迹评估p53的敲除。N3S :Notch3shRNA ；CS :GL2 阴性对照 shRNA ；scRNA 零乱 RNA。1、7 :N3S/scRNA ；2、8 :CS/scRNA ；3、5 :N3S/p53siRNA ；4、 6 :CS/p53siRNA。图8.在Notch3缺失细胞中，p53siRNA降低对阿霉素的灵敏度。转染后48和72 小时的细胞用100 μ g/ml阿霉素处理24小时。每次阿霉素处理后，计算台盼存活率重复两 次，每个样品计算至少200个细胞。两个独立实验的柱状平均值；条纹，SE。CS:GL2阴性对 照 shRNA ；N3S :Notch3shRNA ；scRNA 零乱 RNA。图 9. HESl 短干扰 RNA。！fepG2 细胞用 40nM HESlsiRNA 或 40nM 零乱 siRNA 转染， 转染后72小时通过RT-PCR和western印迹分别评估HESl的敲除和p21蛋白水平。1 零 乱 RNA ；2、3 不同的 HESlsiRNA。图10.在Notchl缺失细胞中，阿霉素处理后细胞存活率。250X 103感染的细胞 用100 μ g/ml阿霉素处理24小时，每次阿霉素处理后，计算台盼存活率重复两次，每个样 品计算至少200个细胞。两次独立实验的柱状平均值，条纹，SE。CS 对照shRNA ；NlS NotchlshRNA。
具体实施例方式根据本发明，Notch3抑制能够在转录后水平被诱导，通过与Notch3mRNA杂交的靶 标siRNA或shRNA或靶标的合成寡核苷酸(即，通过RNA干扰，RNAi)，因此抑制Notch3受体的合成。短发夹环RNA (shRNA)是稳定发夹环形式的、在体内通过RNA干扰沉默基因表达的RNA分子。shRNA发夹环结构通过细胞加工机制剪切产生成熟的siRNA，其反义链被RNA诱导 的沉默复合体(RISC)特异吸收。之后的复合体结合mRNA并剪切mRNA，mRNA与包含在RISC 中的siRNA序列匹配，因此指导目标RNA降解。因此，所述抑制形成一个特定时期，由于预 先存在的受体将最终用尽而不能有效补充新合成的Notch3受体，导致Notch3受体从目标 细胞中缺失。可选地，受体可由使用抗Notch3抗体或分子抑制，抗Notch3抗体或分子影响 Notch3受体的功能，如，受体配体的拮抗剂。根据本发明的shRNA或siRNA可从已知的Notch3mRNA序列构建，或选自PCT申请 W02004047731中描述的那些或序列号1和2中的序列。这些RNA长度一般是21-23核苷酸，如在现有技术中报导的，长于30个核苷酸的 序列能够引发抗病毒样干扰素反应，导致所有蛋白合成的停止。用于设计siRNA或shRNA的方案和操作可在线利用(例如http //www. genelink. com/sirna/shRNAi. asp、http//www. ambion. com/techlib/misc/psilencer_converter. html)。因此，本领域技术人员在设计适于完成本发明的RNA时没有问题。所述shRNA可以插入任何适于基因治疗的载体。shRNA表达载体已经使用病毒(包 括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒载体)和质粒系统制造。这些载体使用来自小类别pol. III 启动子的启动子以驱动shRNA的表达。所有的载体必须包括人类polIII启动子。人类U6 启动子是研究的最好的常用于RNAi的类型III pol启动子。shRNA由Exportin5从核中输出，Exportin5识别短RNA环。一旦在细胞质中，通 过另一个术语为Dicer的RNaseIII酶剪切，前体miRNA和shRNA被加工成siRNA双链复合 物。重要地，Dicer结合shRNA基部，在茎上剪切21或22nt，留下另一个3’突出的2nt，并 形成siRNA双链复合物结构。RNA双链复合物由RNAi诱导的沉默复合体(RISC)吸收。RISC 放开双链RNA和含有相关反义链的活化复合体。在逆转录病毒中的遗传材料是RNA分子形式，而它们宿主的遗传材料是DNA的形 式。当逆转录病毒感染宿主细胞，将把它的RNA和一些酶一起转进细胞。在它可以被认作 是宿主细胞遗传材料的一部分之前，这个来自逆转录病毒的RNA分子一定产生来自它的 RNA分子的DNA拷贝。从RNA分子产生DNA拷贝的过程定义为逆转录。它通过病毒中携 带的一种酶，叫做反转录酶实现。在这个DNA拷贝产生以及释放在宿主细胞核中后，它一 定通过使用另一种携带在病毒中被称为整合酶的酶融合进宿主细胞的基因组中。使用逆 转录病毒的基因治疗的一个问题是整合酶能够将病毒遗传材料插入宿主基因组的任何位 置。如果遗传材料恰好被插在宿主细胞的一个原始基因的中部，这个基因将被破坏(插入 突变)。如果该基因恰好是调控细胞分裂，将产生不受控制的细胞分裂(如癌症)。本领 域最新的技术已经公开了使用锌指核酸酶或包括特定序列例如β球蛋白基因座控制区以 指导在特定染色体位点融合的逆转录病毒载体的应用。但是，本领域技术人员可以知道， 在本领域发展的水平中从哪里寻找迹象用于构造适用于本发明的药物组合物的载体。用 于所述RNA的表达和靶定的载体、试剂盒构建载体和载体构建的操作是本领域公知的，例如，INGENEX GeneSuppressorRetro构造试剂盒，或线上可用的，或在以下文献中描述的 GJ.等(2003) “表送用于基因功能的发现和确认的siRNAs的腺病毒载体”，《基因组研究 (Genome Res.)》，13 :2325_2332，证明基于腺病毒的shRNA在多种细胞类型中表达，包括 原始细胞。Matta，H等(2003) “用于小干扰RNA传递的慢病毒载体的应用”，《癌生物治疗 (Cancer Biol. Ther))), 2 :206_210，其中作者用 Invitrogen' spLenti6骨架表达 shRNA盒。 Tiscornia, G.等(2003) “使用表达小干扰RNA的慢病毒载体在小鼠中基因敲除的常规方 法”《美国国家科学院院刊》，100 :1844-1848，证明了用于传递shRNA至细胞和小鼠的慢病 毒载体的效用。
有利地，本发明的载体可以包括仅在肿瘤中驱动shRNA或SiRNA在细胞中表达的 肿瘤特异性启动子，或者可以替代地包括现有技术已知的肝脏特异性启动子，如清蛋白、 α 1抗胰蛋白酶、人类胰岛素样生长因子II。肝脏特异性启动子的详细列表可以在肝脏特 异性启动子数据库(http://rulai.cshl.edu/LSPD)中找到，以使得本领域技术人员驱动 逆转录病毒载体仅在肝脏中表达，即是Notch3抑制剂。这个具体实施方式
是非常有利的， 因为Notch3已经在这里被证明仅仅在HCC细胞中被表达，在健康或甚至肝硬化肝脏细胞中 不表达。因此，根据本发明的Notch3的抑制可以不引起瘤节周围无HCC的肝细胞中不想要 的分子改变。这是特别适用，由于在肝细胞癌患者中的高度的肝硬化。本发明的药物组合 物能够因此实现靶定的抗癌症治疗，与目标为反向推进慢性肝病进程的方法结合，以达到 使多数患者长期生存。本发明包括这样的载体的药物组合物的优点在于它能够仅在肿瘤中增加化学疗 法药物的细胞凋亡效果的事实，从而明显降低药物对周围健康的或甚至患病的非瘤细胞的 副作用。同样适用于本发明的Notch3抑制剂表示为抗Notch3抗体或由这里描述的任何其 它实施方式。通常，本发明的药物组合物非常有利，药物的当前使用剂量可以由于它仅在表达 Notch3恶性细胞中的效果的增加而减少。合成的寡核苷酸在分子生物学的研究、医疗诊断、 以及新治疗药剂的开发中很有用。事实上，它们在基因治疗中的应用产生被定义为反义的 新领域，提供新一代药物的合成。该过程基于通过寡核苷酸与mRNA的耦合来达到主体所表 达的蛋白被阻断，因此通过不同途径抑制基因表达。医学中，在人类药物试验中使用反义技 术已经开始，特别是作为抗病毒和抗白血病药剂。因此，作为对RNA干扰的选择，Notch3可以通过使用合成寡核苷酸而被抑制。这 样的合成寡核苷酸能够装载在脂质体/DNA复合体中，且通过门静脉注射直接传递至肝脏。在本发明的实施方式中，将本发明的合成寡核苷酸传递至细胞是通过脂质体/DNA 复合体(lipoplexes)或多聚物(polyplex)的构造完成，由于它们具有保护寡核苷酸在转 染过程中避免不希望的降解的能力。寡核苷酸，可以在类似胶囊或脂质体的组织结构中用脂质覆盖。当组织结构与核 酸联合，它被称为脂质体/DNA复合体。有三种类型的脂质，阴离子的(负电荷)、中性或阳 离子的(正电荷)。起初，阴离子和中性脂质用于合成载体的脂质体/DNA复合体的构造。 阳离子脂质，由于它们的正电荷，自然地与负电荷核酸联合；并且它们比中性脂质的阴离子 消耗少的时间去制备。另外，由于它们的正电荷，它们也与细胞膜相互作用，推动它们的细胞内吞作用和随后的细胞核向细胞质的释放。阳离子脂质同样保护经由细胞的核酸避免降解。本领域技术人员可以很容易在本领域找到实现本发明的脂质体/DNA复合体的方案。脂质体/DNA复合体最常的应用是基因向癌细胞的转移，其中提供的基因激活细胞中癌抑制剂控制基因和减少致癌基因的活性。新的研究已经显示脂质体/DNA复合体在 转染的呼吸道上皮细胞中有作用，所以它们可以用于遗传性的呼吸道疾病的治疗，如囊肿 性纤维化。在本发明的另一个实施方式中，Notch3抑制可以通过使用作为抑制剂的如抗 Notch3抗体或Notch3受体拮抗剂或任何其它能够阻滞Notch3受体的功能的分子完成。根据本发明，抗肿瘤化学疗法药剂可以从任何合适的已知的引起细胞凋亡或在细 胞增殖中起作用的化学疗法药剂中选择，但是并不限于这些；化学疗法药剂可以在包括阿 霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依维莫司、多激酶抑制剂(索拉非尼和 舒尼替尼)、EGFR抑制剂(西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的组中 选择。本发明的药物组合物可以以适于静脉内或组织内注射的形式制备，它的制备包括将 Notch3抑制剂与一种或多种如本发明所定义的抗肿瘤药物和药物学接受的载体混合的步 马聚ο可选地，两种活性化合物从两个分开的小瓶开始共同施用，或同时，或当抑制剂通 过Notch3mRNA的转录后抑制起作用，抑制剂可以在抗肿瘤化学疗法药剂的前6_48小时施用。因此，本发明的目的同样是用于治疗肝细胞癌的、用于共施用Notch3抑制剂、抗 肿瘤化学疗法制剂和药物学可接受的载体的药剂盒，所述药剂盒包括两个小瓶，其中一个 小瓶包含Notch3抑制剂和药物学可接受的载体，另一个小瓶包含抗肿瘤化学疗法药剂和 药物学可接受的载体。根据本发明，包含Notch3抑制剂的小瓶包含Notch3抑制剂，Notch3抑制剂从包括 与编码Notch3的mRNA互补的siRNA、与编码Notch3的mRNA互补的shRNA、与编码Notch3 的mRNA互补的合成寡核苷酸或抗Notch3抗体或Notch3拮抗剂的组中选择。所述siRNA或 shRNA将插入本发明的病毒载体中，而合成寡核苷酸将与合适的脂质联合形成脂质体/DNA 复合体。包含化学疗法药剂的小瓶将包括化学疗法药剂，化学疗法药剂从包含阿霉素、5氟 二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依维莫司、多激酶抑制剂(例如索拉非尼和舒尼 替尼)、EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的组中 选择。通常，当组合物包括RNA Notch3抑制剂，所述RNA将插在如上描述的合适的病毒载 体中。因此，本发明的药物组合物将包括上述提到的载体和在本说明书中指出的一种或 多种抗肿瘤药剂。当由本发明的寡核苷酸完成抑制，所述寡核苷酸将被复合进脂质体/DNA复合体， 所述脂质体/DNA复合体将在药物学可接受的适于静脉内注射溶液中与一种或多种抗肿瘤 化学疗法药剂(阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依维莫司、索拉非尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)一起 悬浮。假设是抗Notch3抗体，该抗体将在药物学可接受的适于静脉注射的溶液中与一 种或多种所述的抗肿瘤药剂一起悬浮。同样用于当Notch3拮抗剂或任何其它能够封闭Notch3作用的分子被用作Notch3 抑制剂。本发明的抗肿瘤化学疗法成分的剂量可以减少2-3倍，由于在Notch3抑制的环境 中所述药物的效果2-3倍增加。本发明的药物组合物可以有利地进一步包括用于其它肝脏疾病治疗的化合物，所 述其它肝脏疾病与HCC并存，例如用于肝硬化治疗的化合物和其它。用于本发明的组合物的制备的方法因此包括以下步骤a.选择功能性Notch3抑 制剂，所述抑制剂的特征为抑制Notch3受体的合成或抑制Notch3受体的功能；b.将a.中选择的抑制剂与一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载 体混合。当抑制剂是RNA，所述RNA将插在之前指出的合适的载体中，以使得所述RNA在肝 细胞中表达。本发明还包括上述药剂盒制备的方法，包括步骤a.制备包含Notch3抑制剂和药物学可接受的载体的第一个小瓶；b.制备包含一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体的第二个小瓶。抑制剂和化学疗法药剂将是本说明书中描述的那些。本发明的目的同样是HCC的医学疗法，包括对需要的患者施用上述药物组合物， 以治疗上有效的剂量或共施用本发明的药剂盒的小瓶的内含物，其中第二个小瓶可以与第 一个小瓶一起施用或在第一个小瓶施用的6-48小时内施用。在本发明的有利的实施方式中，医学治疗将通过注射本发明的药物组合物或本发 明的药剂盒的第一和第二个小瓶至门静脉中以直接传递至肝脏而实现。本发明的HCC的治疗同样有利地与上面解释的肝硬化的治疗结合。实施例1、患者和方法20名进行HCC手术的患者(12名男性和8名女性)进入该研究。根据NIH的指导 方针和最新版的赫尔辛基宣言从每名患者处获得知情同意。在分析之前，所有患者标识符 从所有组织样品中移除。组织样品在10%福尔马林中混合，并包埋在石蜡中用于组织病理 学检查和免疫组织化学。20个例子中13个存在肝硬化(CE)；剩余的例子表现出正常肝脏 (2个例子)或慢性活动性肝炎(CAH，5个例子)。慢性肝炎的原因，9个例子归结于HCV，5 个例子归结于HBV，4个例子归结于HBV和HCV共感染。由其它正常肝脏产生的HCC的2个 例子中没有发现病毒标记。根据埃德蒙森和斯坦纳的标准(31)评价HCC的组织病理学等 级。1个例子被评估为G1，5个例子为G2，12个例子为G3，剩下2个例子为G4。2、免疫组织化学将福尔马林固定、石蜡包埋的HCC及相邻的无肿瘤肝脏切片(4i!m厚)免疫染 色，以探测Notch受体。识别Notch3、Notch4的一抗从SantaCruz生物技术(Santa Cruz,CA)中获得，而用于Notchl的一抗从Abcam(Ab8925)中获得。将多克隆一抗稀释如下 Notchl(l 600)、Notch3(l 300)以及 Notch4(l 400)。用 HRP (辣根过氧化物酶)兔 子En Vision系统(DAKO，Denmark)和DAB (二氨基联苯胺)作为色原体(Sigma，圣路易， 美国)显示免疫反应。固定好的载玻片通过光显微镜法检查，并使用3级系统评估免疫反 应，其中0表示没有着色，1表示最小着色，2表示均质和强烈着色。仅具有第2级免疫反应 的样品被认为是阳性。3、细胞培养HCC IfepG2细胞系从美国标准培养物收集所(HB-8065，ATCC，洛克维尔，马里兰州， 美国)中获得。细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉 素(所有试剂均来自ATCC)的Eagle极限必需培养基(MEM)中，在37°C，5% C02培养器中保存。4、shRNA的逆转录病毒转导以shOligo表示的shRNA(短发夹环RNA)根据生产商的说明(OligoEngine， Seattle, WA) (32)插入在pSuper. pure表达载体中。对于Notch3和Notchl受体中 的每一个，我们制备了两个shOligos，以排除非靶shRNA效应的可能性。在Notch3和 Notchl 中两对革巴序列如下Notch3(#l) :5，一ctcccctcaccacctaataaa—3，；Notch3 (#2) 5，-gggggacctgccgccgtggctata-3，；Notchl (#1) :5，-ggccgtcatctccgacttca-3，； Notchl (#2) :5’ -gcctcttcgacggctttga-3'。对于阴性对照，我们制备包含表达GL2荧光素 酶特异的shRNA的pSuper. puro前病毒的HepG2细胞群(33)。通过使用磷酸钙沉淀方法(34)通过将pSuper. puro表达载体转染进Phoenix A 包装细胞(由Gary Nolan博士友情提供)中制备逆转录病毒。在转染后48小时和72小时收集病毒上清液，汇集、过滤(孔尺寸0.45i!m)并保 存在_80°C。感染前一天，每个平板6孔，每孔接种50-70，000个H印G2细胞。为达到 有效的逆转录病毒转导，将未稀释的病毒在8 yg/ml聚凝胺(Sigma)存在下，通过 spinoculation(32°C、2200RPM离心45分钟)施加于细胞，然后在32°C孵育5小时。病毒 上清液随后用新鲜的完全培养基代替，细胞在37°C恢复48小时。在含有1. 8 u g/ml嘌呤霉 素的生长培养基中筛选稳定感染的细胞群。嘌呤霉素的抗性通常在筛选4天后获得，其中 变换两次培养基。5、小干扰RNA的转染转染前24小时，Notch3shRNA和GL2感染的细胞接种在无抗生素的MEM 的6孔板中。生长至40 %汇集的H印G2细胞用40nM的有效的p53siRNA和零乱 RNA(scRNA) (Invitrogen)转染。转染前，马上将培养基移除，根据生产商的建议，使用 Lipofectamine2000和Opti-MEM培养基(invitogen)完成转染。转染后5小时，培养基用 新鲜的包含培养基的血清代替。通过用荧光素标记的siRNA(Invitrogen)的转染测定转染 效率是90%以上。在转染后48小时和72小时收集细胞，通过Western印迹或采用阿霉素 处理24小时以检查p53蛋白的表达。随后通过台盼蓝染色评估细胞的存活率。双向合成用于沉默人类HES1的两条siRNA序列，用40nM每种siRNA瞬时转染 HepG2细胞后72小时，评估HES1抑制。
6、阿霉素处理HepG2细胞的稳定转染的细胞群接种在6孔器皿中，并附着24小时，清洗并培养 在含有100 ii g/ml阿霉素(Sigma)的新鲜的完全培养基中1、3、6、12、18和24小时。通过 FACS计算10，000个结果探测阿霉素融合。7、细胞死亡和细胞毒性分析用所附的阿霉素处理后，在培养基中收集悬浮H印G2细胞，离心成球，通过台盼蓝 染色估计细胞死亡程度。通过标准的、临床LDH(乳酸脱氢酶)释放试验估定细胞坏死，该 试验用未处理和阿霉素处理的细胞的培养基完成。8、RNA 分析根据生产商的说明，用Triazoldnvitrogen，Paisley，苏格兰)制备总细胞RNA。 4微克的总RNA用DNAsel (Invitrogen)处理以消除污染的基因组DNA。在30 yl反应体系 中完成反转录至cDNAs，反应体系包括1XRT缓冲液、0. 4mM dNTPs、5mM二硫苏糖醇(DTT)、 0. 5iiM 寡聚 dT、3iiM 随机引物、240U Superscript II (所有试剂均来自 Invitrogen)。RT 反应在42°C、1小时下完成，然后95°C、5分钟灭活酶。通过半定量终点PCR扩增测定P53、 WAF1、Notchl、HES1和0肌动蛋白基因的相对表达。PCR产物在用溴化乙锭染色的2%琼 脂糖凝胶中分辨，通过荧光分析(Quantity one，Biorad，CA，美国)进行分析。PCR引物如 T" :WAF1 ( JE(n] 5' -aagaccatgtggacctgtca-3‘以U^t^l 5' _ggcttcctcttggagaagat_3，)； P53 ( IE (n] 5' -gacccaggtccagatgaagct-3' Jk 5' -accgtagctgccctggtaggt-3')； HES1 (正向 5，-gctggtgctgtctggatg-3，以及反向 5，-cattcctgctctcgccttc-3，)。9、蛋白分析培养的细胞溶解在裂解缓冲液中，裂解缓冲液包括10mM Tris_HClpH7. 4、2. 5mM MgCl2U% TritonX lOOUmM DTT、0. ImM 苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM Na3V04、lmM NaF 和蛋白 酶抑制剂(Sigma化学公司，圣路易，M0)。溶解产物在4°C、15，000 X g离心15分钟，通过 Bio-Rad蛋白试验(Bio-Rad)分析上清液的蛋白浓度。蛋白在1 XSDS(十二烷基硫酸钠) loading buffer (65mM Tris_HCl、pH7. 5，65mM 2-巯基乙醇，1 % SDS，10%丙三醇和0. 003% 溴酚蓝)中95°C煮10分钟，用聚丙烯酰胺凝胶分辨，点在硝化纤维膜(Hybond C Extra, Amersham Pharmacia, Little Chalfont，英国)上。膜用丽春红溶液(Sigma)染色，在PBS 中 用5%脱脂奶粉封闭50分钟，然后用适当的一抗孵育。一抗和稀释物如下抗Notch3多克 隆抗体(sc-5593，Santa Cruz 生物技术)1 300，抗Gadd45 多克隆抗体(AB3863，Chemicon International, Temecula, CA) 1 1000，抗 p21 单克隆抗体(克隆 SX118，Dako) 1 100， 抗P53单克隆抗体(克隆D0-7，Dako)l 500，抗Kipl/p27单克隆抗体(克隆57，BD生 物科学，San Jose, CA) 1 2300，分裂的PARP单克隆抗体(9546，细胞信号技术，Beverly， MA) 1 200，抗 p-p53 多克隆抗体(sc-18079-R，Santa Cruz 生物技术)1 300，抗 Notchl 多克隆抗体1 200和抗3肌动蛋白单克隆抗体(克隆AC-40，Sigma) 1 1000。在含有0. 吐温20的PBS(PBST)中反复清洗后，使用EnVision右旋糖酐多聚 体显示系统(Dako)将膜用抗鼠或抗兔的HRP结合的二抗孵育。将膜清洗，通过化学发光 反应(ECL试剂，Amersham)获得放射能照相。用Fluor-S多重图像扫描仪(BioRad)获 得放射能照相的数字图像，信号以使用参考放射能照相的光标度之后的吸收率单位、使用 Quantity-one密度计量学软件(BioRad，Hercules, CA)测定数量。
10、彗星实验通过碱性彗星实验定量DNA链的断裂。主要地，在接触阿霉素之后的不同的时间 点，将105细胞植入0.7%低熔点琼脂糖中，并转移至盖有显微镜载玻片的琼脂糖上。随 后，将载玻片在新鲜的裂解缓冲液(2. 5MNaCl、100mM Na2 EDTAUOmM Tris-HCl、1 % Triton X-100、pH 10. 0)中4°C孵育1小时。然后将载玻片置于充满冷冻的碱性解链/电泳缓冲液 (300mM NaOH、lmM Na2EDTA、pH 13. 0)的水平凝胶电泳槽上，25 分钟。电泳后(25V，300mA 25分钟)，用0.4M Tris(pH 7. 5)清洗载玻片，在纯乙醇中干燥2分钟，然后用溴化乙锭 染色。使用荧光显微镜(尼康，美国)分析彗星，并通过使用CASP软件测量“尾距”( ) (‘tailmoment’( ))测定数量。每个度量分析50个细胞以计算平均值。11、统计分析使用StatView 5. 0 (SAS Institute Inc，Cary NC)的统计功能分析数据。结果表 示为两个独立实验的原始数据的平均值+标准差(S.E.)。结果的统计显著性使用Student 的t-检验评价。P值小于0. 05被认为是具有统计显著性。12、Notch3蛋白表达的评价NotchUNotch 3和Notch 4受体的表达已通过免疫组织化学在20对HCC和周围 组织的样品中评价。正常的肝脏和慢性肝炎样品不表达这三个Notch受体中的任何一个。 在CE和HCC肝脏样品中，Notchl和Notch4的免疫反应没有显著差异。但是，在HCC的20 个中的15个(75% )肿瘤肝细胞中发现Notch3阳性表达，而在所有例中CE样品被认为是 阴性，因为偶尔可以在分离的肝细胞中看到Notch3(图1)。没有发现肿瘤等级、病毒感染和 Notch3表达之间存在联系，即使分析的例子大多数是高等级肿瘤。这个评估提供了第一个体内证据，即上调的Notch3表达与肝细胞肿瘤特异性相 关联，同样显示至少与Notchl和Notch4相比，Notch3可以选择性地参与到HCC存活信号 和/或进展中。13、在IfepG2细胞中Notch3的缺失对特定调节因子的影响HepG2细胞中Notch3的表达已经通过稳定的逆转录病毒转导用Notch3特异的 shRNA消除，并检查对细胞生长和阿霉素敏感性的相应效果。相比较于不相关的GL2荧光特 异shRNA对照病毒，在H印G2细胞中Notch3蛋白水平通过两个不同的Notch3特异shRNA 反转录病毒大幅度减少(见图2A的Western印迹)。两个Notch3的shRNA产生相等地渗 透 Notch3 敲除(图 2A-B)。Notch3敲除有差别地影响了与细胞增殖、DNA修复和凋亡相关的特定细胞蛋白的 水平。如图2A所示，p27和GADD45 a、P53和活性的p_P53的内在水平在Notch3缺失后提 高2-5倍，而p21蛋白水平降低4倍。图2C中呈现的RNA分析显示p53和p21基因转录的 比较结果。此外，Notch细胞内区域的直接目标的HES1的表达，同样通过Notch3敲除而减 少。14、在阿霉素处理的H印G2细胞中Notch3敲除效果已经研究过是否Notch3赋予H印G2肝癌细胞抗阿霉素诱导的细胞死亡的抗性。通 过在感染一周后用碘化丙啶染色和流式细胞仪评价(数据没有显示)，用任一 Notch3shRNA 的感染没有改变H印G2生长率。但是，在对阿霉素分别处理6和24小时的反应中，通过台盼 蓝染色排除显示，稳定表达Notch3shRNA的H印G2细胞的死亡率(与荧光素酶shRNA阴性对照比较)成两倍和三倍(图3)。阿霉素处理还引起了 PARP的分裂。PARP是包含在DNA 修复中的115kDa核蛋白，是在细胞凋亡反应中分裂的最早的蛋白之一。在阿霉素处理6小 时后，在Notch3缺失细胞中，观察到PARP细胞凋亡特异的89kDa分裂片段的积聚明显增加 (图 4)。彗星实验已大量用于测量对不同DNA破坏试剂的应答中的DNA损伤。在这个实验 中，分裂的DNA从核中移动形成显现为具有圆形头部和尾巴的细胞的彗星。通过彗星实验 测量的基础DNA损伤显示GL2对照细胞与Notch3缺失细胞具有相同的内在DNA损伤度(P =0. 6686)。做时间过程分析以检测在GL2对照和Notch3不足的细胞中由阿霉素诱导的 DNA链断裂。这个分析显示了在Notch3不足的细胞中，与明显更高的DNA损伤水平一同获 得的“TM”值有时间依赖性增加(图5A)。在用阿霉素处理24小时后，Notch3缺失的细胞 强烈地损伤以至于不可能定量DNA分裂程度。FACS分析同样显示Notch3缺失细胞比GL2 阴性对照细胞获得和/或保持更高的阿霉素水平，在阿霉素处理仅3小时后对阿霉素吸收 具有明显不同(图5B)。15、在阿霉素处理的IfepG2细胞中的Notchl缺失尽管不同的研究已证明高p21水平保护人类癌症细胞在化学疗法和放射疗法治 疗中免于凋亡，我们研究了在Notch3缺失细胞中下调的p21是否会涉及H印G2细胞对阿霉 素的敏感性。在先的HCC细胞系研究显示Notchl的过量表达通过p21上调抑制细胞生长。 与这个观察一致，通过免疫印迹分析已发现通过目标shRNA敲除的Notchl表达的损失极大 地减少了 P21蛋白的表达(图6)。但是，NotchlKD对p21表达的抑制效果与P53和p_P53 表达无关，因为它们的水平没有被Notchl缺失影响(图6)。重要地，不同于Notch3的消 除，Notchl的损失未能使HepG2细胞对阿霉素介导的细胞死亡敏感(图10)。因此我们在 HepG2细胞中的发现不能支持p21在HepG2细胞对阿霉素依赖的细胞凋亡的敏感性中的作 用。16、在阿霉素处理的Notch3缺失细胞中P53的消除在Notch3敲除细胞中消除P53的表达，以测定在对阿霉素处理的Notch3缺失细 胞增强的细胞凋亡反应中P53的重要性。在Notch3KD和GL2对照IfepG2细胞中消除内源 P53表达，通过有效的阳离子脂质介导的转染鸡尾酒p53特异性siRNA对照不相关的siRNA 的零乱混合物(scRNA)。Western印迹显示相比于scRNA阴性对照，转染P53特异siRNA后， P53蛋白水平引人注意地分别在48小时减少，在72小时无法检测到(图7)。转染的细胞用100ii g/ml的阿霉素处理24小时。有趣地，P53的下调明确地排 除了 Notch3缺失细胞的多数增强的细胞凋亡反应。如图8所示，在阿霉素处理后，在转染 p53siRNA的Notch3缺失细胞中细胞存活率为40%，相比于转染scRNA的Notch3缺失细胞 中细胞存活率为75%。但是，P53的损耗没有影响GL2感染细胞对阿霉素的敏感性(图8)， 因此说明内源Notch3阻止内源P53扩大阿霉素的死亡促进效果的能力。
权利要求
一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，包括Notch3抑制剂、一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的Notch3抑制剂从包括与编 码Notch3的mRNA互补的siRNA、与编码Notch3的mRNA互补的shRNA、与编码Notch3的 mRNA互补的合成寡核苷酸、抗Notch3抗体和Notch3拮抗剂的组中选择。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的siRNA或shRNA插在包含肿 瘤特异启动子或肝脏特异启动子的病毒载体中。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的合成寡核苷酸插入在脂质 体/DNA复合物中。
5.根据前述权利要求任何一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤化学疗 法药剂是引起细胞凋亡或在细胞增殖中起作用的药剂。
6.根据前述权利要求任何一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤化学疗 法药剂在包括阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依维莫司、多激酶抑制 剂、EGFR抑制剂的组中选择。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的多激酶抑制剂选自包括索 拉非尼和舒尼替尼的组，以及所述的EGFR抑制剂选自包括西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替 尼、Brivanib和拉帕替尼的组。
8.一种用于治疗肝细胞癌的用于共施用Notch3抑制剂、抗肿瘤化学疗法药剂和药物 学可接受的载体的药剂盒，所述药剂盒包括含有Notch3抑制剂和药物学可接受的载体的 第一个小瓶，含有一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体的第二个小瓶或 更多小瓶，每一个小瓶包含抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药剂盒，其特征在于，所述的Notch3抑制剂从包括与编码 Notch3的mRNA互补的siRNA、与编码Notch3的mRNA互补的shRNA、与编码Notch3的mRNA 互补的合成寡核苷酸、抗Notch3抗体和Notch3拮抗剂的组中选择。
10.根据权利要求9所述的药剂盒，其特征在于，所述的siRNA或shRNA插在包含肿瘤 特异启动子或肝脏特异启动子的病毒载体中。
11.根据权利要求9所述的药剂盒，其特征在于，所述的合成寡核苷酸插在脂质体/DNA 复合物中。
12.根据权利要求8-11任何一项所述的药剂盒，其特征在于，所述的抗肿瘤化学疗法 药剂在包括阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依维莫司、多激酶抑制 剂、EGFR抑制剂的组中选择。
13.根据权利要求12所述的药剂盒，其特征在于，所述的多激酶抑制剂选自包括索拉 非尼和舒尼替尼的组，以及所述的EGFR抑制剂选自包括西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替尼、 Brivanib和拉帕替尼的组。
14. 一种用于权利要求1-7任何一项所述的药物组合物的制备的方法，包括步骤a、选择功能性Notch3抑制剂，所述的抑制剂的特征为抑制Notch3受体的合成或抑制 Notch3受体的功能，b、将a中选择的抑制剂与一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体混合。
15.一种用于权利要求8-13任何一项所述的药剂盒的制备的方法，包括步骤a、选择功能性Notch3抑制剂，所述抑制剂的特征为抑制Notch3受体的合成或抑制 Notch3受体的功能，并将所述抑制剂与药物学可接受的载体等分至第一个小瓶中，b、向第二个小瓶等分一种或多种抗肿瘤化学疗法药剂和药物学可接受的载体。
16.一种HCC的医学疗法，包括对需要的患者施用治疗上有效量的权利要求1-7任何一 项所述的药物组合物。
17.—种HCC的医学疗法，包括对需要的患者共施用治疗上有效量的权利要求8-13任 何一项所述的药剂盒的第一个和第二个小瓶的内含物或第一个和更多个小瓶的内含物。
全文摘要
本发明提供用于治疗肝细胞癌(HCC)的包括Notch3抑制剂和化学疗法药剂的药物组合物，用于制备所述组合物的方法和包括对有需要的患者施用所述药物组合物的医学疗法。
文档编号A61P35/00GK101808648SQ200780100794
公开日2010年8月18日 申请日期2007年7月25日 优先权日2007年7月25日
发明者卡蒂亚·焦万尼尼, 帕斯夸莱·基耶科, 肯尼思·马尔库, 路易吉·博伦迪 申请人:博洛尼亚大学阿尔玛母校研究室