专利名称：一种用于肝细胞癌早期诊断的分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用转基因动物寻找肝细胞癌发生早期的分子事件。具体地，本发明利用外源目基因定位整合致肝细胞癌小鼠模型进行分析，找到肝细胞癌发生早期的分子事件，从而找到可用于肝细胞癌早期诊断和靶向治疗的分子标记物。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是全球最主要的恶性肿瘤之一，尤其是在包括中国在内的亚太地区。全世界每年发生HCC的患者超过100万人(1)，5年存活率低于5％。HCC发生和发展与多种致病因素有关，尤其与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关。HBV是环状部分双链的DNA病毒，全长约3.2kb。HBV复制过程中以RNA拷贝为中间体，HBV具有随机整合到宿主基因组中的能力，整合了HBV的宿主称为携带者。携带者中都有病毒表面抗原(HBsAg)的表达，携带者呈现非症状的慢性感染。估计全世界至少有三亿五千万HBV慢性携带者(2)，75％以上的HBV慢性携带者分布在亚洲和西太平洋地区(3)。其中至少约20％有不同程度的慢性肝炎和肝硬化，部分最后可演变为原发性肝癌。中国是HBV的高携带区，携带率约为10-20％。临床及流行病学研究显示，HBV慢性携带者患HCC的风险高达40-50％。临床上，肝细胞癌最好的治疗手段仍然是在肝癌早期手术切除，因此早期诊断显得至关重要。至今还没有发现易于检测的血清和肝脏分子标记物，可用于尽早检测出可能会发生HCC的携带者。进一步研究HBV导致HCC发生的病理过程及其分子机制对于此类肝癌的早期诊断具有重要的意义。
肝细胞癌的发生与发展是多因素参与的复杂变化过程，涉及到多种基因的异常表达或突变及其彼此间的相互作用。HBV病毒感染及其基因表达产物与肝细胞蛋白或核酸分子的相互作用，可干扰正常的基因表达和信号转导，并可能激发原癌基因的异常表达，或在功能上灭活肿瘤抑制基因，从而导致肝细胞的非正常生长和分化，最终导致肝细胞癌变。流行病学调查表明，男性发生肝细胞癌的比例显著高于女性(4)，提示肝细胞癌的发生可能与性激素密切相关。我们利用基因打靶将乙型肝炎病毒的表面抗原基因(HBsAg)和X基因(HBx)定位整合到小鼠染色体的p21位点上，成功建立了肝细胞癌的小鼠模型(8)。统计发现，表面抗原基因的转基因小鼠15-24月龄，雄性小鼠发生肝细胞癌的比例为58.33％，而雌性小鼠不发生肝细胞癌。X基因转基因小鼠在18个月后，发生肝细胞癌，雌雄小鼠发生肝细胞癌的比例差别不明显。
雌激素受体β是Mosselman(5)和Kuiper(6)等相继克隆出来的一种新型的雌激素受体。雌激素受体β在人及其它高等动物的许多组织与细胞中都有分布，但在不同组织与细胞中含量相差很大，甚至在同一细胞的不同区域的分布也有很大差别。如在胎儿的睾丸、卵巢、肾上腺以及脾脏中雌激素受体β的mRNA含量丰富，而在垂体、皮肤、肾和大脑皮层中含量较低或极低。1997年，Tremblay(7)等成功地克隆了小鼠的雌激素受体β。小鼠的雌激素受体β主要分布于小鼠的前列腺、卵巢、睾丸、肺、乳腺、骨、尿道、中枢神经系统和心血管系统等。雌激素受体β可能与睾丸及附睾的发育、前列腺癌的发生及乳腺癌的发生等多种生理和病理现象密切相关。
发明内容
本发明涉及一种肝细胞癌发生早期的诊断分子的发现，它包括以下步骤①肝细胞癌小鼠模型的建立，具体步骤参见文献(8)；
②设计PCR反应的引物；③利用步骤2获得的PCR反应的引物进行PCR扩增；④将步骤3获得的PCR产物连入pGEM-T Easy Vector中；⑤小鼠肝脏及肿瘤RNA的提取；⑥Northern Blot分析。
图1显示了雌激素受体βPCR示意图。1、1kb ladders；2、野生型小鼠肝脏；3、HBsAg转基因小鼠肝脏；4、HBX转基因小鼠肝脏；5、小鼠睾丸；6、阴性对照。
图2显示了雌激素受体β携带载体的构建示意图。1、1kbladders；2-7、不同的细菌克隆。
图3显示了雌激素受体β在15-24月龄小鼠肝脏及肿瘤分布示意图。1、野生型(♂)；2、野生型(♀)；3、p21HBsAg/+(♂)；4、3的肿瘤；5、p21HBsAg/+(30月，♀)；6、5的肿瘤；7、p21HBsAg/+(♀)；8、p21HBsAg/HBsAg(♂)；9、8的肿瘤；10、p21HBsAg/ HBaAg(♀)；11、p21HBsAg/HBsAg(30月，♀)；12、11、的肿瘤；13、p21HBx/+(♂)；14、p21HBx/+(♂)；5、14的肿瘤；16、p21HBx/HBx(♂)；17、p21HBx/HBx(♀)。
本发明的第一方面是构建小鼠肝细胞癌的动物模型，具体步骤见文献(8)。
本发明的第二方面是制备雌激素受体β的cDNA片段，包括以下步骤利用Trizol提取小鼠睾丸中的总RNA，将1μg小鼠睾丸总RNA反转录成cDNA。以小鼠睾丸cDNA为模板，用引物1(5’-GGTATCATTACGGTGTCTGGT-3’)和引物2(5’-CTGTCACTGCGTTCAATAGGT-3’)扩增出831bp的雌激素受体β的cDNA片段，将cDNA片段连入pGEM-T Easy Vector中，测序正确后，用EcoRI进行酶切，回收850bp左右的片段。
本发明的第三方面是利用Northern Blot检测雌激素受体β在小鼠的表达情况，具体方法如下用Trizol提取小鼠肝脏及肿瘤的总RNA，取20μg总RNA进行琼脂糖甲醛变性胶电泳，通过毛细转移法将RNA转移到硝酸纤维素膜上。以雌激素受体β基因片段为探针进行Northern blot杂交，发现雌激素受体β基因在HBsAg转基因小鼠的肝脏肿瘤有表达，而在野生型小鼠的肝脏、HBsAg转基因小鼠的肝脏、HBx转基因小鼠的肝脏及肿瘤均未发现雌激素受体β基因的表达。
本发明人利用HBV的表面抗原基因(HBsAg)及X基因(HBx)定位整合致肝细胞癌小鼠(8)进行分子生物学分析。通过Northernblot杂交检测了不同年龄阶段野生型小鼠的肝脏及转基因小鼠肝脏及肿瘤的雌激素受体β基因的表达情况。发现雌激素受体β基因仅在HBsAg转基因小鼠的肝脏肿瘤有表达，而在野生型小鼠的肝脏、HBsAg转基因小鼠的肝脏、HBx转基因小鼠的肝脏及肿瘤均未发现雌激素受体β基因的表达。说明雌激素受体β与HBV的表面抗原基因(HBsAg)引起的肝细胞癌密切相关，为HBV的表面抗原基因(HBsAg)相关的肝细胞癌的诊断及治疗提供了可能的靶分子。
本文中所提到的对比文献的全部内容均引入本文以供参考。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。但是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的任何限定。
实施例1小鼠组织总RNA的提取1、将小鼠组织(肝脏和睾丸等)100mg放入2ml Trizol中，用匀浆器进行匀浆，于室温培养5分钟。
2、加入0.4ml氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2-3分钟。2-8℃，10000-12000g离心15分钟。
3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入1ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，2-8℃，10000-12000g离心10分钟。
4、弃上清，加入至少2ml 75％的异丙醇洗涤，2-8℃，不大于7500g离心5分钟。
5、弃上清，空气干燥5-10分钟，加入无RNase的水500μl，反复抽吸使RNA溶解。55-60℃保温10分钟，-70℃冰箱储存备用。
实施例2cDNA的合成采用TaKaRa公司的mRNA Selective PCR Kit(AMV)Ver 1.1系统，方法为1、在离心管中混合下列溶液。
2、按下列条件进行反应
30℃10分钟45℃30分钟5℃ 5分钟实施例3雌激素受体β基因片段的获得1、以小鼠睾丸的cDNA为模板，用引物1(5’-GGTATCATTACGGTGTCTGGT-3’)和引物2(5’-CTGTCACTGCGTTCAATAGGT-3’)进行PCR扩增，反应条件为94℃变性3分钟，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 90秒，循环反应30次，结果如图2所示。
2、将PCR产物1μl连入pGEM-T Easy Vector中，转化大肠杆菌(DH5α)，用IPTG和X-gal进行蓝白斑筛选，挑取白色克隆，提取质粒，并用EcoRI进行酶切鉴定，结果如图1所示。
3、将酶切鉴定正确的质粒，进行测序，测序引物为T7引物，结果为5’-GGTATCATTACG GTGTCTGGTC CTGTGAAGGA TGTAAGGCCT TTTNTAAAAGAAGCATTCAA GGACATAATG ACTATATCTG TCCAGCCACG AATCAGTGTACAATAGACAA GAACCGGCGT AAAAGCTGCC AGGCCTGCCG ACTTCGCAAGTGTTACGAAG TAGGAATGGT CAAGTGTGGA TCCAGGAGAG AAAGGTGTGGGTACCGAATA GTACGAAGAC AGAGAAGTGC CAGCGAGCAG GTGCATTGCCTGAACAAAGC CAAGAGAACC AGTGGGCACA CACCCCGGGT GAAGGAGCTACTGCTGAACT CTCTGAGTCC CGAGCAGCTG GTGCTCACCC TGCTGGAAGCTGAGCCACCC AATGTGCTAG TGAGCCGTCC CAGCATGCCC TTCACCGAGGCCTCCATGAT GATGTCCCTC ACGAAGCTGG-3’。
4、测序正确的质粒，用EcoRI进行酶切，回收850bp左右的片段，采用Promega公司的WizardDNA Clean-Up System进行回收。具体方法参见试剂盒说明书。
实施例4Northern杂交检测雌激素受体β基因在小鼠的肝脏及肿瘤中的表达1、将1.5g琼脂糖溶于117.2mlDEPC处理过的水中，冷却至70℃，加入3.5μl 10mg/ml的溴化乙锭(EB)，30ml 5×MOPS(0.1mol/lMOPS(pH7.0)，40mmol/l乙酸钠，5mmol/lEDTA(pH8.0))及2.8ml40％甲醛溶液。
2、将20μgRNA加入3倍体积的加样缓冲液(6.7ml甲酰胺，2.2ml40％甲醛，1320μl 10×MOPS，20μl 20mg/ml溴酚蓝)中，60℃处理10分钟，冰浴迅速冷却，上样。
3、120-160v电压电泳2-3小时，每半小时混合电泳两极的电泳缓冲液，溴酚蓝距加样孔8cm停止电泳。
4、电泳完毕的胶在20×SSC中浸泡两次，每次15分钟。
5、用20×SSC将RNA从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，用2×SSC洗膜5分钟。
6、紫外交联(1200μW/cm2)2分钟，80℃烤膜45分钟。
7、采用Promega公司的Primer A Labeling System(Cat #U1100)标记探针，方法为将待标记的DNA片段与95-100℃煮2分钟，迅速冰浴冷却，在1.5ml离心管中混合下列溶液表1
加无核酸酶的水至50μl，混匀。室温放置1小时。煮沸2分钟，冰浴骤冷，加EDTA至终浓度20mM，终止反应，待用。
8、膜于6×SSC中浸泡5分钟。将膜置于预杂交液(6×SSC，2×Denhardt，0.1％SDS，100μg/ml的变性鲑鱼精DNA)中，65℃预杂交2小时，将标记好的探针加入预杂交液中，65℃杂交18小时以上。
9、将膜置于1×SSC，0.1％SDS中室温洗20分钟，随后将膜置于0.2×SSC，0.1％SDS中，65℃洗膜3次，每次20分钟。
10、膜稍事干燥，置于X光片下，-70℃曝光。
10、洗片。
结果如图3所示。
参考文献1.Bosch FX.，Munoz N.Epidemiology of hepatocellularcarcinoma.InBannsch P，Keppler D，eds.Liver cellcarcinoma.DordrechtKluwer Academic，1989；3-12.
2.Zuckerman AJ.More than third of word’s population hasbeen infected with hepatitis B virus[Letter]。Br.Med.J19993181213.
3.Gust ID.Epidemiology of hepatitis B infection in theWestern Pacific and South East Asia.Gut 1996 38(suppl2)s18-s23.
4.Peters RL.In hepa tocellular Carcinoma(Eds.Okuda &Peters)1976 p109 John Wiley & SonsNew York.
5.Mosselman S.，Polman J.and Dljkema R.ER betaidentification and characterization of a novel humanestrogen receptor.FEBS Lett.1996 39249-53.
6.Kuiper GG.，Enmark E.，Pelto-Huikko M.Nilsson S.andGustafsson J-.Cloning of a novel receptor expressed inrat prostate and ovary.Proc Natl Acad Sci USA 1996935825-5930.
7.Tremblay GB.，Tremblay A.，Copeland NG.，Gilbert DJ.，Jenkins NA.，Labrie F.and Giguere V.Cloning，chromosomallocalization，and functional analysis of the murineestrogen β.Mol Endocrinol.1997 11352-365.
8.一种定位整合乙型肝炎病毒致肝细胞癌的小鼠模型。杨晓王友亮 崔芳 吕娅歆 黄翠芬 申请号02117467.9。
权利要求
1.一种用于肝细胞癌早期诊断的分子——雌激素受体β，其特征在于在表达HBsAg的肝细胞肿瘤中过度表达。
2.权利要求1的分子，作为肝细胞癌药物筛选的靶向分子。
3.权利要求1的分子，作为肝细胞癌药物治疗的靶向分子。
全文摘要
本发明提供了一种用于肝细胞癌早期诊断的分子——雌激素受体β，它特异表达于HBsAg转基因小鼠的肝脏肿瘤中。
文档编号G01N33/574GK1508267SQ0215669
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月19日 优先权日2002年12月19日
发明者杨晓, 王友亮, 崔芳, 黄翠芬, 杨 晓 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国人民解放军军事医学科学院生物工