专利名称：一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用，属于基因工程生物技术领域。
背景技术：
是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，2007年12月美国癌症学会(ACS)发布的数据显示肝癌年增66. 7万例，死亡59. 8万例，其中约50%的新患病例和死亡病例在中国，即肝癌对我国人民的健康威胁更大，已成为我国第二位肿瘤杀手，不仅使患者痛苦不堪，生存率低，而且给家庭、社会带来严重的经济和心理负担。单核苷酸多态性(SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP作为稳定遗传的早期突变，与疾病密切相关。当一种SNP在患者中的出现频率明显高于非患者，提示该SNP与此疾病相关，通过分析研究两者的单倍型和连锁不平衡性，可将基因组中任何未知的致病基因定位。SNP在致病基因定位中发挥的作用主要包括一是在寻找致病SNP，这种SNP的出现可导致基因在表达量和(或)蛋白表达产物结构的变化，从而导致某种疾病的发生或使得个体对某种疾病易感；二是SNP作为一种遗传标记，与疾病或者表型连锁。Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13ql2，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成。Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等。近年来，越来越多的研究发现klotho基因可以调节IGF、Wnt、TGF-β I、FGF等信号通路，参与氧化应激过程，并且与机体的免疫缺陷有关，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似抑癌基因的重要作用。因此可以利用klotho来作为肿瘤发生、分级的标志物以及作为靶点用于抗肿瘤的治疗。对现有技术的国内外文献和专利进行检索，至今未见任何klotho基因多态性与肝细胞肝癌易感性关系的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用。本发明提供了一种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的方法，采用PCR-RFLP方法，包括以下步骤
⑴以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，PCR扩增得到klotho基因外显子4区的包含rs648202单核苷酸多态的DNA序列，即SEQ ID No. I中第2190位至第2352位所示序列，
其中，PCR引物序列如下上游引物为 F: 5’- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3’
下游引物为 R: 5’- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3’
⑵对PCR扩增产物经限制性内切酶/fee III进行酶切后通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型，CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp ；CT基因型酶切后产生163 bpUOO bp,63 bp三种长度的DNA片段；TT基因型酶切后产生100 bp,63 bp 二种长度的DNA片段。本发明还提供了一种分离核酸，具有SEQ ID No. I中第2190位至第2352位所示序列，且在SEQ ID No. I中的第2255位的碱基为T。本发明还提供了一种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的特异性引物，上游引物为F: 5’- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3’ ，下游引物为R: 5’-TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3’ 。
本发明还提供了一种原发性肝细胞肝癌易感性的诊断试剂盒，它包括
(1)特异性扩增klotho基因单核苷酸多态性rs648202的引物，其中，上游引物为F:5’- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3’，下游引物为 R: 5’- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3’ ；
(2)检测扩增产物与正常的klotho基因相比是否存在变化所需的试剂。利用本发明所提供的与原发性肝细胞肝癌相关的多态性位点的核酸序列，可构建对原发性肝细胞肝癌易感人群进行遗传筛选的试剂盒，将其作为药物设计的靶点，找出具有调节klotho基因表达的活性分子，从而促进新的抗肿瘤药物的发现。本发明具有如下技术效果
(1)本发明所建立的方法可以简便快捷地检测位于人类染色体13ql2区域klotho基因外显子4区单核苷酸多态性位点rs648202的基因型，通过检测T等位基因的有无判断个体是否对原发性肝细胞肝癌具有易感性，从而有利于原发性肝细胞肝癌易感人群的筛查和原发性肝细胞肝癌的预防；
(2)利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，促进新的抗肿瘤药物的发现；
(3)利用本发明提供的引物序列和炫^III核酸内切酶可以简便、高效、特异地检测出rs648202 多态；
(4)利用本发明提供的原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性，构建对原发性肝细胞肝癌进行遗传性诊断的试剂盒；
(5)由于klotho参与了恶性增殖、凋亡、侵袭与转移等细胞活动相关的病理过程，因此本发明对今后深入探讨klotho与其他疾病的关系提供了经验和应用基础。
图I为使用特异性引物对klotho基因外显子4区进行PCR扩增、沿e III酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中M =DNA分子量标准；1 CT基因型；2 CC基因型；3 TT基因型；4 :空白对照。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明。需注意的是，以下实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I
权利要求
1.一种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，采用PCR-RFLP方法，包括以下步骤 ⑴以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，PCR扩增得到klotho基因外显子4区的包含rs648202单核苷酸多态的DNA序列，即SEQ ID No. I中第2190位至第2352位所示序列； 其中，PCR引物序列如下 上游引物为 F: 5’- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3’ 下游引物为 R: 5’- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3’ ⑵对PCR扩增产物经限制性内切酶/fee III进行酶切后通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型。
2.一种分离核酸，其特征在于，具有SEQ ID No. I中第2190位至第2352位所示序列，且在SEQ ID No. I中的第2255位的碱基为T。
3.—种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的特异性引物，其特征在于，上游引物为F: 5’- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3’，下游引物为R: 5’-TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3’ 。
4.一种原发性肝细胞肝癌易感性的诊断试剂盒，其特征在于，它包括 Cl)特异性扩增klotho基因单核苷酸多态性rs648202的引物，其中，上游引物为F:·5，- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3，，下游引物为 R: 5，- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3，； (2)检测扩增产物与正常的klotho基因相比是否存在变化所需的试剂。
全文摘要
本发明提供了一种与原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性、其构建方法及其应用。本发明具有如下技术效果1)本发明所建立的方法可以简便快捷地检测位于人klotho基因外显子4区的单核苷酸多态性，诊断个体是否对原发性肝细胞肝癌具有易感性，从而有利于原发性肝细胞肝癌易感人群的筛查和原发性肝细胞肝癌的预防；2)利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，促进新的抗肿瘤药物的发现；3)利用本发明提供的引物序列和HaeIII核酸内切酶可以简便、高效、特异地检测出rs648202多态；4)利用原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性，构建对原发性肝细胞肝癌进行遗传性诊断的试剂盒。
文档编号C12N15/11GK102796820SQ201210299748
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者黄曙, 季国忠, 杨昀, 范志宁, 王敏, 汤小伟 申请人:黄曙, 南京医科大学第二附属医院