专利名称：一种筛选金霉素产生菌的新方法
技术领域：
本发明属于抗生素发酵领域，涉及一种指示金霉素产生菌发酵液中金霉素含量高低的方法，特别是涉及一种通过简单操作快速比较不同金霉素产生菌发酵液中金霉素含量相对高低的方法。
背景技术：
金霉素(Chlortetracycline)，又称氯四环素，属四环素类中衍生物的一种。化学名:6~ 甲基 ~4~ _■甲氣基 _3,6,10,12,12a-五轻基-1，11- _-氧代 ~7~ 氣-1,4,4a, 5, 5a, 6，11，12a-八氢-2-并四苯甲酰胺。分子量:478.8 ;分子式=C22H23ClN2O8。金霉素抗菌谱广，对阳性菌、阴性菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体、某些原虫等均可产生抑制作用。金霉素的抗菌作用主要在于抑制细菌的生长，在其较高浓度时具有杀菌作用，其作用机制是干扰蛋白质的合成。适用于鸡白痢、伤寒、猪细菌性肠炎以及禽类副伤寒、霍乱等疾病。同时，作为理想的饲料添加剂它还具有预防 潜在感染、改善消化代谢、抑制肠道内有害微生物，促进有益微生物生长、提高饲料效能等。在全球范围内，金霉素是所有饲料药物添加剂中使用量最大的品种，是国际上重要的兽用抗生素之一。菌种是发酵的根本。每一发酵产品的生产水平跨越式提高都与菌种技术进步密不可分。为了提高金霉素发酵的工业生产水平，对金霉素工业产生菌进行选育，以期获得高产、遗传稳定的菌株，始终是金霉素研究工作中的一个热点。而菌种筛选技术是获得高产菌株的关键。要想得到优良的工业生产菌株，无法绕开大量烦琐的菌株筛选工作。从当前生物技术产业来看，高产的工业生产菌种的获得还是离不开包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，筛选工作量大，费时费力。这是因为产量性状受多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能获得稳定、高产的单菌落培养物(菌株)，每轮都有一个大量筛选过程，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此，随机筛选的盲目性特点就对筛选量提出了很高的要求。高通量菌种筛选是获得高效菌种的必要手段。在传统的金霉素产生菌的筛选中，为评价不同菌种产抗能力的高低，必须对不同菌种的发酵液效价进行测定，一般采用化学测定法。即利用金霉素在酸性溶液中经加热后能脱去一分子水，生成黄色的脱水金霉素，其色度与含量呈正比。此性质符合郎伯一比耳定律，故可利用比色法来测定其效价。具体做法为金霉素发酵液经草酸酸化过滤后，吸ImL滤液于9mL蒸馏水中，分别吸取ImL稀释滤液于2只50mL装有5mL的2mol/L盐酸的容量瓶中，一只用作对照，另一只于沸水中煮沸5分钟，冷却后加水定容至刻度，摇匀后用分光光度仪(波长440nm)测定。这种方法工作量大，效率较低，实验过程难以达到高通量筛选的要求。
发明内容
为了解决上面提到的金霉素发酵液的金霉素含量检测中遇到的传统化学法工作量大、效率低下的问题，本发明提供了一种有针对性的新型检测方法，可以降低高通量菌种筛选过程中金霉素发酵液效价检测的工作量，同时保证筛选结果的准确度，以较低的工作量达到同样的工作目的。本发明的目的通过以下技术手段实现:在金霉素生产菌的菌种选育过程中，在菌株进行摇瓶发酵培养后的产抗生素能力比较时，不直接测定其化学效价，而是预先制备直径3_的圆形滤纸片，蘸取发酵液的稀释液，在管壁上浙干，在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，每皿可放4-6片，倒置培养。培养后可形成可见抑菌圈，然后使用专门的微生物自动测量分析仪测量不同菌株产生的抑菌圈的大小值，以该值大小作为判断各个菌株产抗能力高低的依据。本发明的优点和有益效果为:1.这一措施的优点在于不必经过繁杂的处理过程，大为提高工作效率。2.这一发明在应用于高通量初筛时，不必测定准确的发酵液效价值，从抑菌圈的直径大小来判定产抗水平的高低，直观、便捷、有效。
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式
一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:图1是本发明的筛选金霉素产生菌的一种实施方式的示意图。
具体实施例方式本发明的目的是提供一种筛选金霉素产生菌的新方法，通过判断金霉素产生菌的发酵液中金霉素含量高低来筛选菌种，具体包含以下步骤:(I)完成培养的摇瓶发酵液加入适量草酸，放到摇瓶机上振荡酸化至pH在1.5-1.8 之间。(2)将酸化后的发酵液用滤纸过滤于干燥试管内，适当稀释。(3)用预先制备的直径3mm的圆形滤纸片，蘸取以上稀释液，在管壁上浙干，保证无多余液体。(4)将蘸取稀释液的滤纸片在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，每皿可放4-6片。(5)制备完成的双碟在35°C条件下倒置培养。(6)培养后形成的抑菌圈平板，使用专用抑菌圈测量仪直接读取抑菌圈大小值。(7)根据抑菌圈大小判断该菌株产抗能力高低。下面结合具体实施例，对本发明的可行性和实际应用效果做进一步说明。实施例1:在本实施例中，以对所拟定方法进行模拟为主:(I)以金霉素标准品分别配制浓度为100 μ /mL和10 μ /mL的标准溶液。(2)用预先制备的直径3mm的圆形滤纸片，分别蘸取以上标准溶液、纯水，在管壁上浙干，保证无多余液体。 (3)将上述滤纸片及未蘸取任何液体的滤纸片在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，共计4片。(4)制备完成的双碟在35°C条件下倒置培养。(5)培养后形成抑菌圈平板。所形成抑菌圈平板的典型效果如图1所示。由图1可以看出，蘸取不同浓度的金霉素溶液的滤纸片可以形成大小明显不同的抑菌圈，不含金霉素的滤纸片则不会形成抑菌圈。实施例2:在本实施例中，以对所拟定方法进行验证为主:(I)选取生长状态不同的菌株的发酵液，分别加入适量草酸，放到摇瓶机上振荡酸化至pH在1.5-1.8之间。(2)将酸化后的发酵液用滤纸过滤于干燥试管内，等比例稀释。(3)用预先制备的直径3_的圆形滤纸片，分别蘸取各稀释液，在管壁上浙干，保证无多余液体。(4)将上述滤纸片在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，每皿4片。(5)制备完成的双碟在35°C条件下倒置培养。
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(6)培养后形成的抑菌圈平板，使用专用抑菌圈测量仪直接读取抑菌圈大小值。(7)根据抑菌圈大小判断该菌`株产抗能力高低，并采用传统的化学效价法进行结果比对。通过上述方法对几株差异化的金霉素产生菌进行产抗能力测定，结果如表一所示，
权利要求
1.一种筛选金霉素产生菌的新方法，应用于金霉素生产菌的菌种选育过程中，其特征在于:在菌株进行摇瓶发酵培养后的产抗生素能力比较时，用圆形滤纸片，蘸取发酵液的稀释液，在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，倒置培养，培养后可形成可见抑菌圈，以抑菌圈大小作为判断各个菌株产抗能力高低的依据。
2.根据权利要求1所述的一种筛选金霉素产生菌的新方法，其特征在于:用预先制备的直径3mm的圆形滤纸片，蘸取预先制备的稀释液，在管壁上浙干，保证无多余液体。
3.根据权利要求1所述的一种筛选金霉素产生菌的新方法，其特征在于:将蘸取稀释液的滤纸片在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，每皿可放4-6片。
4.根据权利要求1所述的一种筛选金霉素产生菌的新方法，其特征在于:培养后形成的抑菌圈平板，使用专用抑菌圈测量仪直接读取抑菌圈大小值，并以此值作为判断该菌株产抗能力高低的标准。
全文摘要
本发明涉及一种筛选金霉素产生菌的新方法，包括(1)将金霉素产生菌发酵液处理后稀释，用预先制备的直径3mm的圆形滤纸片，蘸取预先制备的稀释液；(2)将蘸取稀释液的滤纸片在预先制备的金黄色葡萄球菌双碟上均匀放置，每皿可放4-6片；(3)培养后形成的抑菌圈平板，使用专用抑菌圈测量仪直接读取抑菌圈大小值，并以此值作为判断该菌株产抗能力高低的标准。本发明通过上述措施的采用，代替了传统的化学效价法，优点在于省去繁杂的处理过程，大为提高筛选效率；尤其在高通量初筛时，不必测定准确的发酵液效价值，从抑菌圈的直径大小来判定产抗水平的高低，直观、便捷、有效。
文档编号C12R1/445GK103074412SQ20121029926
公开日2013年5月1日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者李书至, 李冰, 朱晓丽, 张雪峥 申请人:驻马店华中正大有限公司