专利名称：用来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶从淀粉产生葡萄糖的制作方法
用来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶从淀粉产生葡萄糖交叉引用本申请要求2008年6月6日提交的美国临时专利申请系列号61/059，535的优先 权，该专利申请在此引用作为参考。序列表包含SEQ ID NO 1~24的序列表作为附件，并在此以其整体引入作为参考。 发明领域提供来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的α -淀粉酶(AmyE)、其变体、编 码AmyE或其变体的核酸以及含有该核酸的宿主细胞。公开了使用AmyE或其变体的方法， 其包括淀粉液化和/或糖化等。此类方法可以产生例如用于乙醇产生或高果糖玉米糖浆产 生的糖类。
背景技术：
植物淀粉，例如玉米淀粉被广泛用于工业制备诸如糖浆和生物燃料的产物。例如， 高果糖玉米糖浆(HFCQ是加工形式的玉米糖浆，其具有高果糖含量和与糖相当的甜度，使 得HFCS可在软饮料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生产目前代表了十亿美元的产 业。生产乙醇作为生物燃料也是不断增长的产业。可以通过催化淀粉降解为葡萄糖的酶促方法从淀粉产生糖浆和生物燃料。此酶促 方法通常涉及一系列酶催化的反应(1)液化α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)首先催化可含有30-40% w/w干固体(ds)的 淀粉悬液降解为麦芽葡聚糖(maltodextran)。α -淀粉酶是催化随机切割内部的α_1， 4-D-糖苷键的内水解酶(endohydrolase)。因为通常在高温，例如90-100°C下进行液化， 所以优选将热稳定的α-淀粉酶，如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α -淀粉酶 用于此步骤。目前用于此步骤的α -淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)、 解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus) (AmyS)的α-淀粉酶不产生显著量的葡萄糖。相反，产生的液化产物(Iiquefact)具有低 葡萄糖当量(DE)且含有麦芽糖和高聚合度(DPn)糖类。(2)糖化葡糖淀粉酶和/或产麦芽糖(maltogenic) α -淀粉酶催化液化后形成 的麦芽葡聚糖的非还原端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化产生富含葡萄糖 的糖浆或高麦芽糖糖浆。在前者的情况下，葡糖淀粉酶通常于升高的温度在酸性条件下 催化糖化，例如在60°C、pH 4. 3下。用于此方法中的葡糖淀粉酶通常获自真菌，例如用于 Optidex L400中的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉(Humicula grisea)葡糖淀粉酶。脱支酶，如支链淀粉酶可以辅助糖化。备选地，产麦芽糖α -淀粉酶可以催化糖化来形成高麦芽糖糖浆。产麦芽糖α -淀 粉酶通常具有比葡糖淀粉酶更高的最适PH和更低的最适温度，且产麦芽糖淀粉酶通常需 要Ca2+。目前用于此应用中的产麦芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、植物淀 粉酶以及来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的α -淀粉酶(Clarase L的活性成分)。
权利要求
1.使用枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)从寡糖或淀粉底物溶液产生葡萄糖的方法，其 包括(i)使AmyE与寡糖或多糖底物接触；并(ii)将底物溶液转化为含有葡萄糖的溶液，其中所述AmyE包含与SEQID NO :1的AmyE 具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述寡糖溶液主要含有麦芽七糖(DP7)或高级寡糖。
3.权利要求1的方法，其中所述淀粉溶液是未蒸煮的玉米淀粉。
4.权利要求1的方法，其中在所述转化期间，所述底物溶液的pH是约pH5.6至约pH5. 8。
5.权利要求1的方法，其中所述转化不包括使底物溶液与葡糖淀粉酶接触。
6.权利要求1的方法，其中步骤(i)进一步包括使淀粉底物与葡糖淀粉酶接触。
7.权利要求6的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶至低于约0.5GAU/gds的浓度。
8.权利要求7的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶至低于约0.02GAU/gds的浓度。
9.权利要求1的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少约0.2g/L葡萄糖。
10.权利要求9的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少约0.4g/L葡萄糖。
11.权利要求10的方法，其中所述含有葡萄糖的溶液包含至少约1.4g/L葡萄糖。
12.权利要求1的方法，其中所述AmyE选自包含SEQID NO U SEQID NO :2、SEQ ID NO 3, NCBI 检索号 ABW75769、NCBI 检索号 ABK54355、NCBI 检索号 AAF14358、NCBI 检索号 AATO1440, NCBI 检索号 AAZ30064、NCBI 检索号 NP_388186、NCBI 检索号 AAQ83841 和 NCBI 检索号BAA315^所示的氨基酸序列的AmyE。
13.权利要求1的方法，其进一步包括(iii)发酵所述含有葡萄糖的溶液来产生乙醇。
14.权利要求13的方法，其中所述乙醇浓度为至少约6%ν/ν乙醇。
15.权利要求14的方法，其中所述乙醇浓度为至少约14%ν/ν乙醇。
16.权利要求1的方法，其进一步包括(iii)使所述含有葡萄糖的溶液与葡萄糖异构酶 接触来产生高果糖玉米糖浆。
17.脱浆纺织品的方法，其包括(i)使纺织品与AmyE接触，和(ii)脱浆所述纺织品，其 中所述AmyE包含与SEQ ID NO 1的AmyE具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列。
18.洗涤物品的方法，其包括(i)使待洗涤的物品与含有AmyE的洗涤剂组合物接触，和(ii)洗涤所述物品，其中所述AmyE包含与SEQID NO :1的AmyE具有至少约85%序列 同一性的氨基酸序列。
19.权利要求18的方法，其中所述待洗涤的物品是餐具或衣服。
20.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂组合物是无粉尘颗粒或稳定的液体。
21.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂组合物还含有纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶或其 组合。
22.权利要求21的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶。
23.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂组合物还含有脂肪酶、过氧化物酶、甘露聚糖 酶、果胶酸裂合酶或其组合。
24.权利要求18的方法，其中所述洗涤剂组合物是手洗或机洗餐具洗涤洗涤剂组合物。
25.权利要求对的方法，其中所述洗涤剂组合物还含有蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、 淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶或其组合。
全文摘要
来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)从包括植物淀粉、麦芽七糖和麦芽三糖的多种糖类底物产生显著量的葡萄糖。此有利特性允许将AmyE或其变体用于具有减少的或消除的对葡糖淀粉需要的糖化反应中等。例如，减少或消除葡糖淀粉酶的需要显著改善乙醇或高果糖玉米糖浆的产生效率。
文档编号D06L1/00GK102112621SQ200980130315
公开日2011年6月29日 申请日期2009年6月4日 优先权日2008年6月6日
发明者A·R·托波扎达, A·肖, C·A·里夸德特, D·A·埃斯特尔, L·G·卡斯康-佩雷拉, L·华莱士, M·J·佩珀森, R·金, S·D·鲍尔, S·W·拉默, S-K·李, W·A·奎瓦斯 申请人:丹尼斯科美国公司