一种唾液中乙醛-dna加合物的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于唾液样本的理化检验技术领域，主要设及唾液中炉-亚乙基-鸟嚷岭 (Iithylidene-化)和1,炉-丙醇-鸟嚷岭(P;ropan〇-dG)DNA加合物的测定技术领域，具体说是 一种采用液相色谱-串联质谱仪化C-MS/MS)测定唾液中乙醒-DNA加合物的方法。
【背景技术】
[0002] 乙醒是一种广泛存在于环境基质中的污染物。主要产生于有机物的不完全燃烧， 如工业废气、卷烟烟气、机动车尾气等。活泼的醒基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生 物体内亲核基团，如核酸中的鸟嚷岭、腺嚷岭、胞喀晚及胸腺喀晚形成DNA加合物。乙醒形成 的主要DNA加合物包括炉-亚乙基-鸟嚷岭（化hylidene-d口和1，炉-丙醇-鸟嚷岭(Propano- dG)，其中炉-亚乙基-鸟嚷岭(Ethylidene-dG)在单核巧酸状态下不稳定，需要将其在DNA酶 水解阶段还原为妒-乙基-鸟嚷岭(Et-dG)才能被检出。
[0003] 唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成 可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的祀器官，相关研究表明唾液中DNA的损 伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短， 唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌 物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。
[0004] 目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有3中-后标记技术、酶联免 疫技术(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱-串联质谱技术化C-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。目前，在唾液 中E；thy 1 idene-dG和Propano-dG的分析方法尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱化C-MS/MS 技术建立的唾液中乙醒-DNA加合物(Ethy 1 idene-dG和Propano-dG)的测定方法。该方法具 有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于唾液中乙醒-DNA加合物的同时定性定量分析。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的： 一种唾液中乙醒-DNA加合物的测定方法，目巧化如i dene-dG和Propano-dG的测定方法， 包括W下具体步骤： 曰、唾液采集:用化agene · DNA唾液采集器(0G-500)对人体唾液进行标准化采集。
[0007] b、唾液DNA的提取：0ragene唾液混合液于50°C水浴解育至少化后，加入化agene 净化液，满旋振荡，冰浴解育10 min;于室溫下离屯、;移取上层清液于一新的微量离屯、管中， 加入纯乙醇，轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀，离屯、并去上清液;加入70%的乙醇水 溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用化no化op 2000超微量分光光度计在260nm处检测 DNA的含量，对于双链DNA-个吸收单位(0D)相当于50 yg/mL。
[000引 c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500化的10 ml Tris-HCl/5 ml MgCb缓冲液(pH=7)中，加入30 mg NaB出CN，将化hylidene-dG还原为化-dG;加入20化混合 内标，加入30U脱氧核糖核酸酶I，在37°C中解育化，随后加入0.008U憐酸二醋酶I和1抓碱性 憐酸酶在37°C中继续解育化。水解液经Stra化-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于 100化30%甲醇水溶液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核巧酸 状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为10 ng/ mL的[15化化t-dG和[15化]Propano-dG。
[0009] d、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的化-dG和Propano-dG标准工作 溶液。
[0010] e、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶 液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰 面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
[0011 ]色谱条件：选取Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6 X 150 mm，3 μπι)，流动相体系选取A:0.01%甲酸甲醇和B: 10 mM乙酸锭水溶液，洗脱条件为梯度洗 脱：0-2 min:25% A，2-17 min:35% A,17-25 min:25% A;流速为0.38 mL/min。分析时间为 25 min,进样量为5化。
[0012] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多反应监测正离子扫描方式;喷雾电压:5500 V， 离子源溫度：550°C，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 口31，射入电压：1〇￥，碰撞能：9 0￥，驻留时间：1〇〇1113。监测离子对为化-(16:296.2一18〇.2 定量离子对，296.2一117.2定性离子对；内标[15化化t-dG为271.2一155.2 ;Propan0-dG: 338.3一222.1定量离子对，338.3一117.2定性离子对；内标[i5n日]Propano-dG为：343.2一 227.2。
[0013] 各分析物及内标的MRM参数见表1。整个分析过程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1软件来控制。
[0014] 表1多反应监测模式下分析物及其内标的MRM参数
*为定量离子 本发明方法的线性范围和检出限： 将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程W及相关系数。 Et-dG和Propano-dG标准曲线的点为0.02,0.05,0.1，0.2,0.3,0.5，1.0和2.0ng/mL。目标 物的线性良好，相关系数均大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰 十倍信噪比对应的浓度为定量限，Ξ倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及 定量限和检出限见表2。
[0015] 表2目标物的标准工作曲线及LOD和LOQ
本发明方法加标回收率和重复性： 采取唾液DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了 Ξ个添加水平，每 个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表3。目标物的回收率在 88.4%-107.5%之间，RSD小于10%，证明方法的准确性和重复性结果较好。
[0016] 表3分析物的加标回收率和重复性
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对唾液中乙醒-DNA加合物的色 谱条件进行了优化，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方 法具有如下优良效果： ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提 高，更有利于唾液中低含量的乙醒-DNA加合物的测定。
[0017]②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
[0018] ③本发明方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可W减少样品前处理过程中 引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱W及 洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机 溶剂的消耗量。
【附图说明】
[0019] 图1乙醒-DNA加合物的总离子流图。
【具体实施方式】
[0020] 本发明W下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0021] 一种唾液中乙醒-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用0G-500唾液采集管收集 唾液，对唾液进行DNA提取，DNA溶