高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及唾液检测的技术领域，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱技术检测 唾液中孕酮和睾酮的方法。
【背景技术】
[0002] 目前常用的检测唾液中孕酮和睾酮的方法有酶联免疫法、电化学发光免疫法等， 这些方法受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可 避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较 大，缺乏统一标准，导致检测结果偏差较大，参考价值较低。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决现有唾液中孕酮和睾酮检测方法技术中存在的部分问题，提 供一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法及试剂盒。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] -种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，包括如下步骤：
[0006] 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效 液相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度 比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；
[0007] (1)具体色谱条件为：
[0008] 流动相A:体积比为0.05 %的甲酸水；
[0009] 流动相B:甲醇，纯度为色谱纯；
[0010] 色谱柱型号：Phenomenex Kinetex_C18,50X2. lmm，2.6ym;
[0011] 采用梯度洗脱的方式，见表1;
[0012] 流速为0.2ml/min，柱温为40°C，进样体积为20μ1;
[0013] 表1流动相梯度洗脱参数
[0014]
[0015] ⑵质谱条件：
[0016]在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾电压为 5000V;碰撞气为6;气帘气为10;离子源气流GS1为50，GS2为50;离子源温度为500°C ;同时监 测目标物孕酮m/z 315.3-109.1、睾酮m/z 289.3-109.1、同位素内标d9-孕酮m/z 324.4 -100.1;孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2; [00 17]表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数
[0018] _
I. 〇
[0019] 优选地，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μ1于2ml离心管 中，加入50ng/ml内标溶液10μ1，混勾后，加 lml萃取液，祸旋混合5min，13000r/min离心 lOmin，取上清800μ1;氮气吹干，以10%甲醇水10(^1进行复溶，涡旋311^11;1300(^/1^11，离心 3min，进样检测。
[0020] 优选地，所述内标溶液配制:准确称取孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解后配制 lmg/ml的储备液;孕酮标准溶液储备液10μ1与睾酮标准溶液储备液1 ΟμL混合，再以纯甲醇 稀释至400μ1，得25μg/ml的工作液。
[0021] 优选地，所述萃取液为乙酸乙酯。
[0022] 优选地，所述氮气吹干温度为40~50°C。
[0023]本发明的另一方面通过以下方案实现：
[0024] 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，所述试剂盒包括如 下试剂：
[0025] (1)洗脱液：
[0026] 洗脱液A: 0.05% V/V的甲酸水；
[0027]洗脱液B:甲醇，色谱纯；
[0028] (2)标准品母液:孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；
[0029]配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ ml的母液；
[0030] (3)内标液:d9-孕酮的甲醇溶液；
[0031 ] 配制：精确称取10mg d9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母 液;用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
[0032] (4)稀释液：
[0033] 稀释液1:空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0034] 稀释液2:甲醇；
[0035] (5)萃取液：乙酸乙酯；
[0036] (6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)， 浓度分别为:50pg/ml、lOOpg/ml、250pg/ml;
[0037] 孕酮标准溶液储备液10μ1与睾酮标准溶液储备液10μ1混合，再以纯甲醇稀释至 400μ1，得25μg/ml的溶液A，取1 ΟΟμΙ溶液Α甲醇稀释至100ml得25ng/ml的溶液Β;
[0038] QC(H):取100μΙ溶液B，用稀释液1定容至10ml;
[0039] QC(M):取40μ1溶液B，用稀释液1定容至10ml;
[0040] QC(L):取20μ1溶液B，用稀释液1定容至10ml;
[00411 (7)复溶液:体积比为10%甲醇。
[0042]本发明的有益效果:通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批 量处理；同时ESI利用离子蒸发，液相离子化，适用于高分子量测定，大大提高了检测信号的 灵敏度;方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求;本发明 方法具有准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于唾液中孕酮和睾酮的检测。与酶联 免疫法相比，不仅提高灵敏度，操作简单，对操作环境要求不是很高，一般实验室均可完成， 而且节约分析成本，所需分析时间较短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾 病的筛查;检测孕酮的含量，对孕激素治疗监测、评价妊娠早期状态、诊断黄体功能状态方 面具有重要指导作用。检测唾液中睾酮含量，可以评估男性激素周期波动；同时检测唾液中 孕酮及睾酮的含量，可以进行女性更年期激素水平评估、女性激素周期波动评估。应用本发 明试剂盒检测唾液中孕酮和睾酮，前处理过程操作简单，灵敏度高、特异性强、准确性好。
【附图说明】
[0043]图1为孕酮和睾酮及内标d9-孕酮标准品的总离子流色谱图；
[0044] 图2为唾液中孕酮和睾酮及内标d9-孕酮的总离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0045] 为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。
[0046] -种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的方法，包括如下步骤：
[0047] 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的唾液中孕酮和睾酮，利用高效液 相色谱将孕酮和睾酮与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比 为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算孕酮和睾酮的含量；
[0048] (1)具体色谱条件为：
[0049] 流动相A:体积比为0.05 %的甲酸水；
[0050] 流动相B:甲醇，纯度为色谱纯；
[0051] 色谱柱型号：Phenomenex Kinetex_C18,50X2. lmm，2.6ym;
[0052] 采用梯度洗脱的方式，见表1;
[0053] 流速为0.2ml/min，柱温为40°C，进样体积为20μ1;
[0054]表1流动相梯度洗脱参数
[0055]
[0056] (2)质谱条件：
[0057] 在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾电压为 5000V;碰撞气为6;气帘气为10;离子源气流GS1为50，GS2为50;离子源温度为500°C ;同时监 测目标物孕酮m/z 315.3-109.1、睾酮m/z 289.3-109.1、同位素内标d9-孕酮m/z 324.4 -100.1;孕酮和睾酮及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2;
[0058] 表2孕酮和睾酮及内标的质谱参数 「00591
[00611 所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μ1于2ml离心管中，加入 50ng/ml内标溶液10μ1，混勾后，加 lml萃取液，祸旋混合5min，13000r/min离心10min，取上 清800μ1;氮气吹干，以10%甲醇水10(^1进行复溶，涡旋311^11;1300(^/1^11，离心31^11，进样 检测。
[0062] 所述内标溶液配制:称取孕酮同位素内标，甲醇溶解，配制lmg/ml的储备液；以甲 醇稀释至50ng/ml即得实验所需内标溶液。所述萃取液为乙酸乙酯。所述氮气吹干温度为40 ~5(TC〇
[0063] 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中孕酮和睾酮的试剂盒，所述试剂盒包括如 下试剂：
[0064] (1)洗脱液：
[0065] 洗脱液A: 0.05%的甲酸水；
[0066]洗脱液B:甲醇，色谱纯；
[0067] (2)标准品母液:孕酮的甲醇溶液，睾酮的甲醇溶液；
[0068]配制：分别精确称取10mg孕酮、睾酮标准品，分别用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ ml的母液；
[0069] (3)内标液:d9-孕酮的甲醇溶液；
[0070] 配制：精确称取10mg d9-孕酮的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母 液;用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
[0071] (4)稀释液：
[0072] 稀释液1:空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0073] 稀释液2:甲醇；
[0074] (5)萃取液：乙酸乙酯；
[0075] (6)质控品：孕酮和睾酮的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)， 浓度分别为:50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml;
[0076] 孕酮标准溶液储备液10μ1与睾酮标准溶液储备液10μ1混合，再以纯甲醇稀释至 400μ1，得25μg/ml的溶液A，取1 ΟΟμΙ溶液Α甲醇稀释至100ml得25n