Uplc-ms/ms法测定人血浆和尿液中绿原酸的浓度的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测人体液中绿原酸的浓度的方法。具体而言，本发明涉及通过超高 效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人体液中绿原酸的浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 引言
[0003] 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的缩酚酸，在食用和药用植物如金银花、杜仲、向 日葵中有较广泛的研究。大量的研究已经证明绿原酸具有抗炎、抗菌和抗病毒活动等广泛 的生物功能[1-4]。最近的研究显示绿原酸能够诱导人类肝癌细胞、神经胶质瘤细胞以及白 血病细胞的凋亡[5-8]。众所周知，癌症是世界范围的一个主要公共卫生问题，随着近年来 癌症患者的数量继续增加，绿原酸因具有抗癌活性和低毒性不断成为人们关注的焦点。绿 原酸作为生物反应调节剂免疫原性低（即不良反应少），通过激活机体自身的免疫系统，使 机体自身有针对性的产生特异性免疫效应，实现机体免疫平衡，可根据病变部位的免疫缺 失，稳定而适度地补充和表达内源性免疫效应分子，修正肿瘤微环境的免疫失衡，从而更好 地发挥对肿瘤治疗的作用，具有重要的临床价值。作为具有临床应用前景的化合物，其治疗 晚期恶性肿瘤的I期临床药代动力学研究正在进行中。
[0004] -些米用液相色谱串联质谱（1 i qu i d chromat ography-tandem mas s spectrometry，LC-MS/MS)技术测定生物样品中绿原酸的方法均有报道[9-11 ]。到目前为 止，只有一篇测定了人血浆中绿原酸的浓度，且单个样品的检测时间为5min[ll]，并且没有 测定在人尿液中绿原酸浓度的方法学报道。
[0005] 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)色谱运用 小颗粒(小于2wn)增加效能，从而增加仪器的解析度。UPLC具有高分离度、高速度、高灵敏度 的优点，提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。然而，UPLC对流动相，色谱柱，样品 前处理，质谱接口，数据采集系统都提出了更严格的要求。
[0006] 尽管对转换方法进行了一些研究，传统的高效液相色谱HPLC的条件不能直接应用 于UPLC，需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择等各项条件进行大量试验，才能 与这种小颗粒填料相匹配，实现UPLC快速检测分析。例如，周新等人的研究(HPLC与UPLC色 谱条件转换方法研究，分析试验室，第27卷第4期，2008年4月）表明直接将HPLC条件应用于 UPLC，不能达到对待测物质分离分析的目的；需要对实验条件包括例如流动相选择和配比 等进行充分试验才能获得分离状况良好的UPLC方法。
【发明内容】
[0007] 发明人已经建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC_MS/MS)技术检 测人血浆和尿液中绿原酸的浓度。单个样品的检测时间可达到2min。
[0008] 在一些实施方案中，本发明的方法可以采用葛根素为内标进行。在采用内标法时， 内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中 去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质（如化学结构、极性、挥发度 及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为和响应特征;在色谱分析条件下，内标物必须能与样品 中各组分充分分离。在一些实施方案中，发明人已经显示葛根素的基质效应与绿原酸一致， 能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。
[0009] 在一些实施方案中，本发明的方法可以采用ACQUITY UPLC Shield RP18column (100mm X 2.1mm，1.7μπι)作为分析柱进行。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的 要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。在本发明中，发明人发现嵌有亲水性氨基甲酸基 团的Acquity BEH Shield RP 18colum(100mmX2.1mm，1.7ym，Waters)能够实现绿原酸良 好分离和峰型，而其它色谱柱如Acquity UPLC C18柱(50mmX2.1mm，1.7ym，Waters)进行实 验时绿原酸呈现双峰，因此不适合使用。
[0010] 在一些实施方案中，本发明的方法可以采用流动相甲酸水:乙腈进行。在一些实施 方案中，流动相的体积比为0.5%甲酸水：乙腈(85/15^八)-0.5%甲酸水：乙腈(50/50，以 v)，包括0.5 %甲酸水：乙腈(80/20，v/v)-0.5 %甲酸水：乙腈(60/40，v/v)，优选的例如采用 0.5%甲酸水:乙腈(77/23，v/v)进行。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极 性，向流动相中加入改性剂等。
[0011] 在一些实施方案中，本发明的方法用于检测人血浆中绿原酸的浓度。在本发明的 用于检测人血浆中绿原酸浓度的方法中，已经发现通过蛋白沉淀法如甲醇和乙腈蛋白沉淀 处理血浆样品，存在明显的基质抑制效应，尽管这可以通过添加甲酸而降低，基质效应仍然 导致同一样品信号极不稳定。基质指的是样品中被分析物以外的组分，其常常对分析物的 分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，例如，溶液的离子强度会对分析物活度 系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应。在一些实施方案中，本发明的方法采用液液 萃取进行样品处理。在一些实施方案中，本发明的方法采用乙酸乙酯的液液萃取，优选的进 一步加入盐酸进行分析。已经发现，在本发明的萃取方法中加入盐酸可以提高回收率。在一 些实施方案中，本发明的方法进一步采用甲酸甲醇水进行复溶，优选的采用0.5%甲酸水 ： 甲醇（30/70，v/v)-〇· 5% 甲酸水：甲醇（70/30，v/v)，包括0.5% 甲酸水：甲醇(40/60，v/v)_ 0.5%甲酸水：甲醇(60/40，v/v)，优选的例如采用0.5%甲酸水：甲醇（50/50，v/v)进行。已 经发现仅采用甲醇水稀释时，基质抑制效应较大，而改用甲酸甲醇水稀释时可以显著改善 基质效应。
[0012] 在一些实施方案中，本发明用于检测人尿液中绿原酸的浓度。在一些实施方案中， 本发明的方法直接稀释法处理尿液样品，而不必进行其它预处理。当采用甲醇水稀释时，可 观察到40-50%的基质抑制效应，改用甲酸甲醇水稀释时，基质效应明显改善。在一些实施 方案中，本发明的方法采用甲酸甲醇水进行稀释，优选的采用0.5%甲酸水：甲醇(30/70，v/ v)-0.5%甲酸水：甲醇(70/30，v/v)，包括0.5%甲酸水：甲醇(40/60，v/v)-0.5%甲酸:水甲 醇(60/40^八），优选的例如采用0.5%甲酸水：甲醇(50/50^八)进行。已经发现仅采用甲 醇水稀释时，基质抑制效应较大，而改用甲酸甲醇水稀释时可以显著改善基质效应。
[0013] 通过本发明的方法，可以实现单个样品的分析时间为2min的快速检测，绿原酸在 血浆5~2,000ng/mL以及尿液50~20,000ng/mL范围内线性关系良好，日内、日间精密度 (RSD)均小于15%。
[0014]本发明的方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证，所述方 法已经成功应用于给予绿原酸注射液治疗肿瘤患者的血浆及尿液中绿原酸的浓度检测。
【附图说明】
[0015]图1:绿原酸(左)和内标(右)的分子结构和二级质谱图。
[0016]图2:绿原酸（左)和内标葛根素(右)特征性色谱图：双空白（Double-blank)，空白 (Blank sample)，低定量下限（LL0Q)和受试者第一天给药后lh血衆样品（浓度为568ng/ mL) 〇
[0017]图3:绿原酸（左）和内标葛根素（右)特征性色谱图：双空白（Double-blank)，空白 (Blank sample)，低定量下限(LL0Q)和受试者第一天给药后6-9h尿液样品（浓度为1310ng/ mL) 〇
[0018] 图4:绿原酸(血浆)标准曲线。
[0019] 图5:绿原酸(尿液)标准曲线。
[0020] 图6:受试者绿原酸第一天单次给药(0.5mg/kg. 0-1)的血药浓度-时间曲线。
[0021] 图7:受试者累计排泄率时间-曲线(O.Smg/kg.cf1)。
【具体实施方式】
[0022] 1.方法与结果
[0023] 1.1.药品与试剂
[0024]绿原酸和葛根素标准品均购自中国食品药品检定研究院（纯度分别为96.6 %和 95.5% )。色谱纯甲醇、乙酸乙酯、乙腈购自Fisher公司，甲酸购自Sigma公司，1M盐酸购自国 家化学试剂质量检验中心，实验用水为超纯水。
[0025] 1.2.设备和分析条件 [0026] 2.2.1色谱条件：
[0027] 流动相:0 · 5%甲酸水：乙腈(77/23，v/v)
[0028] 流速:0.3mL/min
[0029] 进样量：2yL
[0030] 柱温：40°C
[0031] 进样器内温度:4Γ
[0032] 2.2.2质谱条件：
[0033] 电喷雾离子化源(ESI)，MRM多离子反应检测，正离子模式，喷雾电压5500ν，温度 500°C，GAS 1流速为50mL/min，GAS2流速为45mL/min，CUR为 15mL/min，EP及CXP值分别为 110V 和13V。绿原酸及内标的DP分别为110V和130V。在ESI离子化方式下，绿原酸主要生成[M+H] + 准分子离子峰，为m/z 355.1，主要碎片离子为m/z 163.1，CE为20(图1)。内标葛根素主要生 成的[1+扣+准分子离子峰，为111/2 417.4，主要碎片离子为111/2 297.1观为35(图1)。
[0034] 1.3.标准溶液和内标工作液制备
[0035]绿原酸标准溶液的配制：取绿原酸对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂溶解，定 量配制成绿原酸浓度为lmg/mL的标准溶液储备液，再以甲醇定量稀释至50，100，200，500， 1000，2000,5000,10000，20000ng/mL(血浆用）以及500,1000,2000,5000,20000,50000， 100000,200000ng/mL(尿液用）的标准曲线工作溶液，及150，1500，15000叫/111以血浆）和 1500，15000，150000ng/mL(尿液）的质控溶液。
[0036]葛根素（内标)溶液的配制：取葛根素对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂溶解， 定量配制成葛根素浓度为lmg/mL的标准溶液储备液，再以甲醇分别定量稀释至250ng/mL (血浆