一种唾液中6种醛类-dna加合物的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于唾液样本的理化检验技术领域，主要设及唾液中N6-径甲基-腺嚷岭 (H0Me-dA)、N2-径甲基-鸟嚷岭化 0Me-dG)、N2-亚乙基-鸟嚷岭（Ethylidene-dG)、l，N2-丙醇- 鸟嚷岭（CdG)、6-?基-l，炉-丙醇-2'-鸟嚷岭(α-Acr-dG)和8-?基-l，炉-丙醇-2'-鸟嚷岭 (丫 -Acr-dG)DNA加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪化C-MS/ MS )测定唾液中6种醒类-DNA加合物的方法。
【背景技术】
[0002] 甲醒、乙醒、丙締醒和己豆醒是一类广泛存在于环境基质中的污染物。它们主要产 生于有机物的不完全燃烧，如工业生产、卷烟烟气、机动车尾气和烹任油烟等。活泼的醒基 不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团，如核酸中的鸟嚷岭、腺嚷岭、胞喀 晚及胸腺喀晚形成DNA加合物。上述醒类形成的主要DNA加合物包括N6-径甲基-腺嚷岭 (H0Me-dA)，N2-甲基-鸟嚷岭化0Me-dG)，N2-亚乙基-鸟嚷岭巧地5^1(16116-(16)，1，妒-丙醇-鸟 嚷岭（CdG)，a-Acr-dG和丫-Acr-dG，其中H0Me-dA、H0Me-dG和ethylidene-dG在单核巧酸状 态下不稳定，需要将其在DNA酶水解阶段还原为N6-甲基-腺嚷岭(Me-dA)、炉-甲基-鸟嚷岭 (Me-dG)和妒-乙基-鸟嚷岭(Et-dG)才能被检出。
[0003] 唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成 可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的祀器官，相关研究表明唾液中DNA的损 伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短， 唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌 物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。
[0004] 目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有3中-后标记技术、酶联免 疫技术(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱-串联质谱技术化C-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。目前，在唾液 中 HOMe-dA、册 16-(16、61}1711(16116-(16、〔(16、日-4。尸(16和丫-4^-(16的高通量分析方法尚未见 报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱化C-MS/MS) 技术建立的唾液中6种醒类-DNA加合物（册Me-dA、册Me-dG、Ethy 1 idene-dG、CdG、a-Acr-dG 和丫-Acr-dG)的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于唾液中6种醒 类-DNA加合物的同时定性定量分析。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的： 一种唾液中6种醒类-DNA加合物的测定方法，即HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、 CdG、a-Ac;r-dG和丫 -Acr-dG的测定方法，包括W下具体步骤： 曰、唾液采集:用化agene · DNA唾液采集器(0G-500)对人体唾液进行标准化采集。
[0007] b、唾液DM的提取：0ragene唾液混合液于50°C水浴解育至少化后，加入化agene 净化液，满旋振荡，冰浴解育10 min;于室溫下离屯、;移取上层清液于一新的微量离屯、管中， 加入纯乙醇，轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀，离屯、并去上清液;加入70%的乙醇水 溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用化no化op 2000超微量分光光度计在260nm处检测 DNA的含量，对于双链DNA-个吸收单位(0D)相当于50 yg/mL。
[000引 c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500化的10 ml Tris-HCl/5 ml MgCl2缓冲液(pH=7)中，在DNA溶液加入30 mg化B出CN，加入20化混合内标，加入30U脱氧核 糖核酸酶I，在37°C中解育化，随后加入0.008U憐酸二醋酶I和1抓碱性憐酸酶在37°C中继续 解育化。水解液经Stra化-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100化30%甲醇水溶 液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核巧酸状态，通过固相萃取 和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为10 ng/mL的[i3Ci0i5N日]Me- dG、[化化化t-dG、[i5化]CdG、[i5化]a-Acr-dG、[化如 丫-Acr-dG和50 ng/mL的[化化]Me-dA。
[0009] d、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的6种醒类-DNA加合物标准工作 溶液。
[0010] e、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶 液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰 面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
[0011 ]色谱条件：选取Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6 X 150 mm，3 μπι)，流动相体系选取A:0.01%甲酸甲醇和B: 10 mM乙酸锭水溶液，洗脱条件为梯度洗 脱：0-2 min:25% A，2-17 min:35% A,17-25 min:25% A;流速为0.38 mL/min。分析时间为 25 min,进样量为5化。
[0012] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，多反应监测正离子扫描方式;喷雾电压:5500 V， 离子源溫度：550°C，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能:9 eV，驻留时间：50 ms。各分析物及内标的MRM参数见表1。
[0013] 整个分析过程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1 软件来控制。
[0014] 表1多反应监测模式下巧巾醒类-DM加合物及其内标的MRM参数
*为定量离子 本发明方法的线性范围和检出限： 将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程W及相关系数。 16-(16、61-(16、〔(16、日-4。'-(16和丫-4。尸(16标准曲线的点为0.02,0.05,0.1，0.2,0.3,0.5， 1.0和2.0叫/血，]\^-(^标准曲线的点为0.02,0.05,0.5，1.0,2.0,5.0，10,20和5011邑/1^， 目标物的线性良好，相关系数均大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目 标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，Ξ倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲 线及定量限和检出限见表2。
[0015] 表2目标物的标准工作曲线及L0D和L0Q
(4)本发明方法加标回收率和重复性： 采取唾液DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了 Ξ个添加水平，每 个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表3。目标物的回收率在 78.4%-110.7%之间，RSD小于10%，证明方法的准确性和重复性结果较好。
[0016] 表3分析物的加标回收率和重复性
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对唾液中6种醒类-DNA加合物 的色谱条件进行了优化，并对LC -MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发 明方法具有如下优良效果： ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提 高，更有利于唾液中低含量的醒类-DNA加合物的测定。
[0017]②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
[001引圏本方法能同时检测唾液样本中的6种醒类-DNA加合物，检测通量较高，有利于多 种醒类污染物暴露的风险评估。
[0019] 感本发明方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可W减少样品前处理过程中 引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱W及 洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机 溶剂的消耗量。
【附图说明】
[0020] 图1:6种醒类-DNA加合物的总离子流图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明W下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。