专利名称：硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的 方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人 体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护 细胞膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免 疫功能，可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法如原子吸收 光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法 (ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微 量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS) 鉴定硒化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用硒依赖性的酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技
术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒诊断/ 测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切 实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢 过氧化氢+乙醇过氧化氢酶 乙醛+水 乙醛+还原型辅酶酒精脱氢酶 乙醇+辅酶 这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase; EC 1.1L1.9)酶(偶)联过氧化氢酶(catalase; EC Lll丄6)、酒精脱氢酶
(Alcohol dehydrogenase; EC 1.1.1.1)酶促反应连续监测法/速率比色法。 谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，再通过(偶) 联合过氧化氢酶、酒精脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有 吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型 辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降 的程度/速度，可以测算硒的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较 为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L10000U/L 12000U/L 10 mmol/L 8 mmol/L
过氧化氢酶 酒精脱氢酶 谷胱甘肽二硫 乙醇
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、
酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体
试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢 酶。
还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶、谷胱甘
肽二硫、乙醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、乙醇。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化氢酶、酒精脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶、谷胱甘
肽二硫、乙醇在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定硒浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括:三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶谷胱甘肽过氧化物酶过氧化氢酶酒精脱氢酶谷胱甘肽二硫乙醇
100mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L10000U/L10000 U/L12000 U/L10 mmol/L8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
谷胱甘肽二硫
乙醇
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
谷胱甘肽过氧化物酶
过氧化氢酶
酒精脱氢酶
10Ommol/L50 mmol/L
0.25 mmol/L10 mmol/L8 mmol/L
100mmol/L500 mmol/L10000U/L10000U/L12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始吸光
度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大
约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
谷胱甘肽二硫
乙醇
100 mmol/L50 mmol/L
0.25 mmol/L10 mmol/L8 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
过氧化氢酶
酒精脱氢酶
腦mmol/L500 mmol/L10000U/L12000U/L
试剂三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定硒浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达0.5mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.068 ±0.034 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒浓度测定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽过氧化物酶/Se</u>2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+乙醇 <u>过氧化氢酶</u> 乙醛+水乙醛+还原型辅酶 <u>酒精脱氢酶</u> 乙醇+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出硒的浓度大小测定结果。
2. —种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0.35 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶1000———80000 U/L过氧化氢酶訓O-——80000 U/L酒精脱氢酶1000-——80000 U/L谷胱甘肽二硫l一50 mmol/L乙醇1——50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在 此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、 酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、乙醇组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、 酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、乙醇组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、乙醇组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶组成。还原型 辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、 乙醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、乙醇组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、乙醇组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、过氧化氢酶、酒精脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、 谷胱甘肽过氧化物酶组成。还原型辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化 氢酶、酒精脱氢酶、谷胱甘肽二硫、乙醇在试剂l、试剂2或试剂3中 的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷胱甘肽二硫、乙醇、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、酒精脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464333SQ20071019212
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司