一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方 法。
【背景技术】
[0002] 随着生命科学的发展和生物技术的进步，蛋白质检测已经在临床检验、食品安全、 生物医药等领域得到了广泛的应用。例如，肿瘤标志物、屯、脑血管疾病标志物、内分泌疾病 标志物等，80% W上都是蛋白质；食品过敏原的检测和标识、重组蛋白药物的质量评价，同 样离不开蛋白质的准确定量。为了保证各领域蛋白质检测结果的准确可比，需要研制相应 的蛋白质标准物质作为分析定量时的标准，蛋白质标准物质通常采用比常规分析更为准确 的技术手段作为定值方法，如同位素稀释质谱法等。
[0003] 对于血清、食品等复杂基质中蛋白质的同位素稀释质谱定量过程一般如下；首先 对目标蛋白质进行生物信息学分析，筛选出对应于目标蛋白的特异性肤段。接着通过化学 法合成同位素标记及非标记的特异性肤段，并采用基于氨基酸分析的方法对非标记肤段进 行准确定量，然后将同位素标记肤段添加到待测样品中，混匀后进行酶切。酶切结束后W非 标记肤段为标准，W合成的同位素标记肤段为内标，对酶解液中的特异性肤段浓度进行同 位素稀释质谱分析，根据酶解液中特异性肤段的浓度计算样品中蛋白质的浓度。计算公式 见公式一：
[0004]
【主权项】
1. 一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 对目标蛋白进行特异性肽段筛选，采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切，得到各条 理论酶切肽段；将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索，确定出目标蛋白的特异 性酶切肽段； (2) 通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段；采用同位素标记的氨基酸合 成出同位素标记的特异性肽段，通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯 品，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数 ^peptide? (3) 获得待测目标蛋白的纯品，并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出 蛋白质纯品中蛋白质的质量分数PpMtein;称取蛋白纯品，配制成标准蛋白母液，计算其浓 度； (4) 对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定，得到样品中目标蛋白的粗测浓 度。1; (5) 对样品中的蛋白进行酶切，根据目标蛋白的粗测浓度Cl，添加适量的同位素标记特 异性肽段，并以合成的非标记特异性肽段为标准，采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中 特异性肽段浓度进行测定，浓度测定结果为cpeptide; (6) 根据粗测浓度Cl，在质量为W(l的样品中添加浓度为c^或其稀释液的待测目标蛋 白溶液Wl，使其浓度略有增加，添加后的浓度与添加前的浓度处于同一个数量级；接着按照 步骤（4)对添加后的样品进行酶切和特异性肽段浓度的同位素稀释质谱测定，测定结果为 cid 1 . ipepte丄， (7) 根据测定的酶解液中特异性肽段的浓度，计算蛋白浓度； (8) 计算添加目标蛋白为^时的酶切效率； (9) 重复步骤（6)到步骤（8)的过程，每次添加不同的蛋白量，得到一系列的酶切效率 值nn; (10) 以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图，通过拟合得到酶切效率与蛋 白添加量的关系图，将蛋白添加量外推至〇,得到原始样品中蛋白质的准确酶切效率。
2. 根据权利要求1所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 (1)中所述蛋白酶为胰蛋白酶或Glu-C。
3. 根据权利要求2所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 (3) 中所述标准蛋白母液的浓度通过公式二计算；
式中， c〇--蛋白母液浓度，单位g/g; m--称取的蛋白纯品的质量，单位g; w--溶液的质量，单位g; Pprotein--目标蛋白的质量分数。
4. 根据权利要求3所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 (4) 中对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定的方法采用ELISA、HPLC或HPLC-MS 方法。
5.根据权利要求4所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 (5)中cpeptide的计算通过公式三进行：
式中， Ppeptide一一非标记肽段的质量分数，单位g/g;ms一一样品中添加的同位素标记肽段的质量，单位g; Rs一一样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比； I：一一高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比； 12一一低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比； R：一一高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比； R2一一低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比；ws--称取的样品质量，单位g。
6.根据权利要求5所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 ⑵蛋白浓度的计算采用公式四和公式五分别计算蛋白的浓度；由肽段浓度 Cjreptide计算的 蛋白浓度为 Cprotein? 由肽段浓度 Cpeptidel计算的蛋白浓度为 ^ proteinl?
式中， Cpeptide一一通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度，单位g/g;Cpeptidel一一通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度，与Cpepti(J勺数 值不同，单位g/g; cprotein一一当肽段浓度为CpeptidJ寸酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度，单位 g/g; cproteinl一一当肽段浓度为Cpepti(to时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度，单位 g/g; Mpr〇tein--目标蛋白的分子量； Mpeptide一一特异性肽段的分子量； n一一一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数，通常情况下n= 1。
7.根据权利要求6所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法，其特征在于：步骤 (8)中酶切效率的计算采用公式六进行：
式中， n1--添加目标蛋白为…时的酶切效率； W0--样品质量，单位g; Wi--蛋白母液质量，单位g; cproteinl一一添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度，单位g/g; cprotein一一未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度，单位g/g; C〇--蛋白质母液的浓度，单位g/g。
8.采用权利要求7所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法测定奶粉中0 -乳球 蛋白酶切效率，其特征在于：包括如下步骤： (1) 通过生物信息学的手段进行数据库检索，选择TPEVDDEALEK，即TK-11作为0 -乳 球蛋白同位素稀释质谱定量的特异性肽段； (2) 采用氨基酸固相合成手段，合成出肽段TK-11，以及同位素氨基酸标记的肽段 TK*-11，通过反相高效液相色谱手段进行纯化，使其反相高效液相色谱纯度达到99 %以上； 以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标