专利名称：一种可布置不同细胞密度的微流控芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微观结构技术和微生物学装置结合的领域，具体涉及一种可布置不同细胞密度的微流控芯片及其应用。
背景技术：
细胞的多种生理机能的实现，都受其周围微环境中很多因素调节，如营养、生长因子、气体分子及细胞间相互作用等等；而不同密度的细胞群落其调节因素的作用强度存在差异。为了更好的研究细胞周围调控因子对细胞的作用，及细胞与细胞的相互作用等问题，有效的富集一定密度的细胞群落具有非常重要的意义。以往，人们大多通过在培养皿上播种不同密度的细胞来实现不同密度细胞的富集，不仅消耗试剂较多，费时费力，而且对细胞密度的控制也不够精准。
微流控技术是近几年飞速发展的前沿学科，凭借其多元化、分析快、用量少、高通量和实时观测等优点，现已成为生物细胞分析领域中一个强有力的研究手段。近来，Luo 等人(Chunxiong Luo, Xuejun Zhu, Tao Yu, et al. , A fast cell loading andhigh-throughput microfluidic system for long-term cell culture in zero-flowenvironments, Biotechnology and Bioengineering, 2008,101, 190-195.)开发了一种可布置并长期培养细胞的高通量微流装置，且已被用于对酵母生长的研究，Wang等人(LiWang, Xiao Fang Ni, ChunXiong Luo, et al. , Self-loading and cell culture in onelayer microf luidic devices, Biomedical Microdevices, 2009,11，679-684.)对海拉细胞进行了生长的研究。但是，该装置需要人工更换不同密度的细胞溶液来获得不同密度的细胞群落。能够自动得到不同细胞密度的溶液，将对细胞的研究工作提供很大的便利。
发明内容
针对研究细胞领域的不足之处，本发明提出一种可以布置不同细胞密度的微流控
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心/T O本发明另一目的是提出制备所述微流控芯片的方法。本发明的第三个目的是提出所述微流控芯片的应用的方法。实现本发明上述目的的技术方案为一种可布置不同细胞密度的微流控芯片，其由多个细胞密度布置单元组成，每个细胞密度布置单元包括连接通道、细胞布置腔室、液体吸收腔室、栅栏通道，所述连接通道与细胞布置腔室连接，所述栅栏通道连接细胞布置腔室和液体吸收腔室。其中，所述栅栏通道的高度和/或宽度为O. 5-10 μ m。该高度和宽度中至少一个小于细胞的线度，保证细胞不会被流体带着通过栅栏通道。其中，所述细胞布置腔室的面积为2. 5 X IO3-I X IO5Um2,细胞布置腔室的高度为1-40 μ m。细胞布置腔室的高度不超过细胞线度的两倍，细胞为单层生长，有利于显微观察。其中，所述液体吸收腔室的面积为I X IO5-IXlOVm2,其高度为20-200 μ m。
其中，所述细胞密度布置单元有1-100个，各个细胞密度布置单元中细胞布置腔室和液体吸收腔室的体积之和不相同、相同或不完全相同。其细胞布置腔室，液体吸收腔室和栅栏通道的大小可在上述的不同面积中任意组合。细胞布置腔室的体积相同、但液体吸收腔室的体积不同，则各个细胞密度布置单元内细胞密度不同。当液体吸收腔室的体积的比值为一定比例时，细胞密度布置单元内细胞密度也成同样比例关系。同样，液体吸收腔室体积均相同，但细胞布置腔室体积不同，各个细胞密度布置单元内的细胞密度不同。本发明提出的微流控芯片的制备及其在细胞培养中的应用的方法，包括步骤I)用计算机辅助设计的方法绘制微流控芯片图形，将绘制的图形打印在胶片或光学掩膜上，套刻在涂有光刻胶的硅片上制成模具，然后用聚二甲基硅氧烷在模具上复制微流控芯片图形，加热固化，切下后使用；2)将所述微流控芯片固定于细胞培养装置上，然后使微流控芯片处于真空状态； 其真空状态优选真空度为5至IOOPa的状态；3)将含有细胞的溶液加在所述连接通道周围，含有细胞的溶液被吸入微流控芯片内部。其中，还包括当含有细胞的溶液进入微流控芯片内部后，将微流控芯片外部的残留的含有细胞的溶液更替的步骤。其中，所述溶液更替是先去除残留的溶液再换成不含有细胞的溶液，所述溶液优选细胞培养液。其中，所述步骤3)还包括覆盖所述细胞培养装置的步骤。盖上透明的上盖可防止液体蒸发，并在细胞培养环境下进行显微观测。本发明的有益效果在于本发明提出了一种能够实现不同细胞密度自动分布功能的微流控芯片。该装置可以实现向体系内加入相同密度的细胞溶液，在细胞腔室得到自动布置的不同密度的细胞群落，数量范围从单细胞、数个细胞到数十个细胞。并且，细胞在本微流控芯片上处在相对密闭的腔室中，装置外的液体流动并不会对细胞产生影响。另外，该装置储存的细胞培养液较多，可以为细胞提供充足的营养，适用于长期培养和观察。
图I是本发明实施例I计算机辅助绘制的微流控芯片图形。图2是本发明实施例I中一个细胞密度布置单元的俯视图。图3为实施例2得到的细胞密度实验数值和理论数值的比较。图中试验数值上方线段表示十次统计的方差的数值。图中，1为液体吸收腔室,2为栅栏通道,3为细胞布置腔室,4为连接通道。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中，刻制微流控芯片的方法为打印了微流控芯片图形的光学掩膜和塑料胶片覆盖在涂有光刻胶的硅片上，该掩膜或胶片的透明部分接受紫外线照射发生交联反应而聚合，未经紫外线照射的部分则可以被显影液溶解。之后硅片及其表面剩下的凸起的光刻胶成为制作微流控芯片的阳模。将PDMS预塑体(两种不同化学官能团的硅氧烷，A:B=10:1)浇铸在阳模上，紫外灯下照射过夜，完成固化。其中PDMS 预塑体为 RTV615 (GE Toshiba Silicones Co. Ltd, Shizuoka, Japan)。实施例中使用的真空装置为 TS2-60 (Longer-Pump Company , Baoding, Hebei, China)。本发明提出的微流控芯片可用于人体细胞、植物细胞、动物细胞的研究，其细胞线度为 IO-4-10-6Hi。实施例I :制备微流控芯片I)用L-Edit绘图，做出如图I的图形，将其打印在塑料胶片或光学掩膜上，作为曝光掩模。设计包括三层结构，分别为细胞布置腔室3、连接通道4、液体吸收腔室I、连接细胞布置腔室3和液体吸收腔室I但阻挡细胞通过的栅栏通道2。液体吸收腔室I、细胞布置腔 室3和连接通道4打印在塑料胶片上，栅栏通道2打印在光学掩膜上。2)利用步骤I)得到的掩模图形，通过多层对位套刻在硅片上制备光刻胶模具，其中细胞布置腔室层高度为20 μ m,液体吸收腔室层高度为70 μ m,连接的栅栏通道层高度为5 μ m，套刻完成后其中一个单元放大俯视图如图2。每块芯片包括10个独立的细胞密度布置单元。所有单元的细胞布置腔室面积不变，为200 X 200 μ m2的正方形,高度为均为10 μ m。而液体吸收腔室的面积包含 200 X 200 μ m2、400 X 400 μ m2、600 X 600 μ m2、800 X 800 μ m2 四种情况，其高度均为30 μ m。栅栏通道由20根长度为200 μ m且宽度、高度均为5 μ m的细通道组成。3)模具制备完成后，使用5mm厚度的PDMS (A:B=10:1)复制图形，在65°C固化30分钟，切下带有图形的PDMS，并与培养皿自然粘附。将该芯片置于紫外灯下照射过夜，以备使用。实施例2 用和实施例I 一样的步骤制备微流控芯片，每块芯片包括100个独立的细胞密度布置单元。所有独立单元的细胞布置腔室面积不变，为200X200 μ m2的正方形，其高度为10 μ m,而液体吸收腔室的面积包含200X200 μ m2,200X400 μ m2,200X600 μ m2,200X800 μ m2四种情况，其高度均为20 μ m。栅栏通道由20根长度为200 μ m且宽度为5 μ m、高度为10 μ m的细通道组成。模具制备完成后，使用3mm厚度的TOMS (A:B=10:1)复制图形，在75°C固化30分钟，切下带有图形的PDMS，并与培养皿自然粘附。将该芯片置于紫外灯下照射12h，以备使用。实施例3 用和实施例I 一样的步骤制备微流控芯片，每块芯片包括20个独立的细胞密度布置单元。各单元的细胞布置腔室面积包括100Χ200μπι2、200Χ200μπι2、200Χ300μπι2的正方形和长方形，不同面积的细胞布置腔室各5个。而液体吸收腔室的面积均为200 X 200 μ m2，其高度均为20 μ m。栅栏通道由20根长度为200 μ m且宽度为10 μ m、高度为5 μ m的细通道组成。模具制备完成后，使用6mm厚度的TOMS (A:B=10:1)复制图形，在80°C固化30分钟，切下带有图形的PDMS，并与培养皿自然粘附。将该芯片置于紫外灯下照射10h，以备使用。实施例4 :应用实施例I的微流控芯片实现在培养腔室中得到不同的肿瘤细胞密度。I)人乳腺癌细胞系MCF-7细胞，用含有10%血清(胎牛血清，FBS)和1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养液(含氨基酸和葡萄糖的培养液，Gibco)，在37°C和5%C02培养箱中培养。解离细胞使用O. 25%的Trypsin-EDTA (胰酶细胞消化液)溶液处理3_4分钟，再加入含有10%FBS的DMEM培养液中和，3000rpm离心，弃去上清液。使用培养液洗涤细胞，离心后重悬，获得含有的细胞悬浊液。使用细胞计数板计数，再稀释到需要的细胞密度(4*105/ml)。2)将装有芯片的培养皿放在真空装置中抽气30min后，真空度为80Pa，马上加入 步骤I)制得的含有细胞的溶液，由于负压的作用，I分钟内溶液会被吸入所有腔室。栅栏通道的尺寸小于细胞的尺寸，于是细胞被吸入并停留在细胞培养腔室。3)通过移液枪更替芯片周围的液体，去除芯片周围多余的细胞溶液，然后加入含有10%FBS和1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养液，以实现对细胞布置腔室内细胞环境的更替。盖上细胞培养皿上盖防止液体蒸发，并在细胞培养环境下进行显微观测。细胞培养腔室所拥有的细胞数目近似的等于所加的细胞密度乘以液体吸收腔室的体积。通过调节液体吸收腔室的体积即可以得到在细胞培养腔室的不同细胞密度。细胞密度试验数值和预期布置的理论数值的比较如图3 (细胞布置腔室的面积相对于液体吸收腔室较小，估算时忽略)。试验数值的方差分别为I. 06458,2. 977,2. 89756,3. 38071。实施例5步骤1)、3)同实施例4，步骤2)中抽真空的时间为40min，达到真空度lOOPa。实施例6步骤1)、3)同实施例4，步骤2)中抽真空的时间为20min，达到真空度5Pa。以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1.ー种可布置不同细胞密度的微流控芯片，其由多个细胞密度布置单元组成，每个细胞密度布置単元包括连接通道、细胞布置腔室、液体吸收腔室、栅栏通道，所述连接通道与细胞布置腔室连接，所述栅栏通道连接细胞布置腔室和液体吸收腔室。
2.如权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述栅栏通道的高度和/或宽度为O.5-10 μ m。
3.如权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞布置腔室的面积为 2.5 X IO3-I X IO5 μ m2，细胞布置腔室的高度为ト40 μ m。
4.如权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述液体吸收腔室的面积为I X IO4-I X IO7 μ m2，其高度为 20-200 μ m。
5.如权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞密度布置単元有1-100个。
6.权利要求1-5任一所述的微流控芯片制备及其在细胞培养中的应用的方法，其特征在于，包括步骤 1)用计算机辅助设计的方法绘制微流控芯片图形，将绘制的图形打印在胶片或光学掩膜上，套刻在涂有光刻胶的硅片上制成模具，然后用聚ニ甲基硅氧烷在模具上复制微流控芯片图形，加热固化，切下后使用； 2)将所述微流控芯片固定于细胞培养装置上，然后使微流控芯片处于真空状态； 3)将含有细胞的溶液加在所述连接通道周围，含有细胞的溶液被吸入微流控芯片内部。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在干，还包括当含有细胞的溶液进入微流控芯片内部后，将微流控芯片外部的残留的含有细胞的溶液更替的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述溶液更替是先去除残留的溶液再换成不含有细胞的溶液，
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)还包括覆盖所述细胞培养装置的步骤。
全文摘要
本发明提供一种可布置不同细胞密度的微流控芯片，其由多个细胞密度布置单元组成，每个细胞密度布置单元包括连接通道、细胞布置腔室、液体吸收腔室、栅栏通道，所述连接通道与细胞布置腔室连接，所述栅栏通道连接细胞布置腔室和液体吸收腔室。本发明提出的装置可以实现向体系内加入相同密度的细胞溶液，在细胞腔室得到自动布置的不同密度的细胞群落，数量范围从单细胞、数个细胞到数十个细胞。并且，细胞在本微流控芯片上处在相对密闭的腔室中，装置外的液体流动并不会对细胞产生影响。另外，该装置储存的细胞培养液较多，可以为细胞提供充足的营养，适用于长期培养和观察。
文档编号C12M3/00GK102796667SQ20121029960
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者罗春雄, 杨薇, 李昭君, 康显阶 申请人:北京大学