血清microRNA在肝癌诊断中的应用及诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学诊断领域，具体设及由血清microRNA组成的肝癌诊断组合， 所述的血清 microRNA 包括 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、 hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192, W及用于肝癌诊断的试剂盒及其 应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是世界范围内常见的高发病率、高致死率的恶性肿瘤，其中肝细胞肝 癌（简称肝癌，Hepatocellular Carcinoma,肥C)占原发性肝癌的90% W上。世界卫生组织 发表的《全球癌症报告2014》指出，2012年全球肝癌新发病例位列恶性肿瘤的第五位，其致 死率则位居第二位，其中中国肝癌的新发及死亡病例均约占全球病例的一半。由于缺乏有 效的筛查手段，导致60%-70%的肝癌患者诊断时已处于晚期，错失根治性切除机会。可见， 早期诊断，早期治疗是增加肝癌患者生存率，降低肝癌死亡率最有效的途径。
[0003] 肝癌的发生发展过程是一个多因素、多阶段、多步骤的过程。任何原因引起的肝硬 化是肝癌最常见的危险因素。在亚洲，慢性乙型肝炎病毒化BV)引发的肝炎、肝硬化是诱发 肝癌最主要的风险因素。绝大多数肝癌患者伴有肝炎和肝硬化病理改变，在历经肝炎、肝硬 化阶段后，最终发展为肝癌，人们称之为"肝癌Ξ部曲"。据估计，中国乙型肝炎携带者数量 近1.2亿，其中20%将发展成为慢性乙型肝炎患者，15%-40%的慢性乙型肝炎患者则将进 一步发展为肝硬化。因此，对肝癌高危人群进行长期监测，及早发现并预警早期肝癌，便于 确定针对性的个体化防治方案，延缓甚至防止肝癌的发生，有利于改善患者生存质量。
[0004] 目前临床上主要通过血清甲胎蛋白（AFP)检测或影像学检查筛查肝癌。虽然AFP已 广泛用于肝癌筛查，但其检出肝癌的敏感性不够高：在临床诊断出肝癌的患者中，约35- 60%肝癌患者的AFP水平仍低于警戒值（20ng/ml);在亚临床肝癌中的敏感性则仅为14- 40%。尽管超声、CT、MRI等影像学检查方法可W作为AFP检测的补充，然而由于长期随访筛 查则费用昂贵，而且运些方法的检出率有赖于肿瘤大小及操作者的经验，因而可能出现误 诊、漏诊的情况。因此，发现新的高敏感性、高特异性，且低廉又易于检测的肝癌早期诊断标 志物具有重要的临床意义。
[0005] MicroRNA是一类广泛存在于真核生物中的内源性小分子非编码RNA，长度为18-24 个核巧酸(ntKMicroRNA通过转录后水平抑制祀基因的表达，调控细胞分化、增殖、调亡等 生命活动，在胚胎发育、机体代谢、疾病发生发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。 近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到mi croRNA，提出循环mi croRNA的 概念。血液等体液标本易于获得，临床可操性强且创伤性小，而且循环microRNA稳定性好， 检测便利，因此，循环microRNA具有作为肿瘤等疾病无创性生物标志物的潜能，适用于高危 人群筛查。
[0006] 新近研究指出，肝癌患者与非肝癌对照具有不同的循环microRNA表达谱。例如， miR-21、miR-122、miR-223在肝癌患者W及皿V肝炎患者血清中的水平均高于健康人;而在 肝癌患者血浆中升高的miR-21在患者切除术后下调；Li等人通过检测513例个体血清 microRNA表达谱，确定了区分皿V肝炎患者与健康人W及肝癌患者与健康人的分类组合； Zhou等人检测了近千份血浆标本microRNA的水平，发现由11111?-122，11111?-192，11111?-21，1111尺- 223，miR-26a，miR-27aW及miR-801等屯个循环microRNA构成的分类模块，能区分肝癌与所 有非肝癌群体总和(包括健康人，肝炎、肝硬化患者），并可诊断AFP阴性的肝癌。运些研究提 示循环m i cr oRNA作为肝癌诊断标志物的潜能。
[0007]然而目前关于循环microRNA作为肝癌诊断标志物的研究仍存在W下不足：（1)大 部分研究只是挑选了前人报道的在肝癌组织表达失调的microRNA作为候选指标，可能无法 全面客观反映循环microRNA的情况；（2)部分研究样本量少，缺乏多中屯、验证；（3)对照设置 不完善，难W说明确定的标志物为肝癌特异的诊断标志物。因此，目前仍然有必要发现具有 临床应用价值的肝癌早期诊断标志物，用于肝癌高危人群的监测，从而及早预警早期小肝 癌，便于临床医生及时采取恰当的防治措施。
[000引 在中山大学的专利申请201410623463.3中，公开了由hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、 hsa-miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192W 及 hsa-miR-505共屯个 microRNA 组成的肝癌诊断标志物，其具有早期诊断灵敏性高、特异性好等特点。尽管如此，本领域仍 存在提供其他肝癌分析诊断标记物组合的需求。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对W上要解决的技术问题，提供一种操作简便、能够有效诊断 肝癌的肝癌诊断标志物。
[0010] 为实现上述技术目的，本发明提供了一种肝癌诊断标志物，所述肝癌诊断标志物 包括分别编码W下microRNA分子组合的核酸分子：
[0011] 1)组合一 ：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145;
[0012] 2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505;
[0013] 3)组合 S:hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR- 192；
[0014] 4)组合四：]13日-11111?-193日-59、113日-11111?-29日、113日-11111?-133日、113日-11111?-145、113日- miR-192、hsa-miR-505。
[0015]在一个优选的实施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、 乙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝 癌。
[0016] 另一方面，本发明还提供了用于肝癌诊断的microRNA分子组合，其包括W下 microRNA 组合：
[0017] 1)组合一 ：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145;
[001 引 2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505;
[0019] 3)组合 S:hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR- 192；
[0020] 4)组合四：]13日-11111?-193日-59、113日-11111?-29日、113日-11111?-133日、113日-11111?-145、113日- miR-192、hsa-miR-505。
[0021]在一个优选的实施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、 乙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝 癌。
[0022 ] 具体而言，本发明通过W下步骤得到了上述四种由血清mi croRNA组成的肝癌诊断 组合：
[0023] 1.通过高通量qPCR Array筛选肝癌患者与慢性乙型肝炎患者差异的候选血清 microRNA;
[0024] 2.实时巧光定量PCR验证候选血清microRNA;
[0025] 3.在由健康人、肝炎、肝硬化、肝癌患者组成的训练组中确立可区分肝癌与非癌对 照(包括健康人、肝炎及肝硬化患者）的血清mi croRNA组合；
[00%] 4.在两个独立验证组验证步骤3确立的血清microRNA组合诊断肝癌的效果；
[0027] 5.分析步骤3确立的血清microRNA组合在小肝癌、BCLC早期及AFP阴性的肝癌患者 中的诊断效果。
[00%]对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤1中，发明人通过高通量qPCR Array筛选确定了 19个候选microRNA,并在步骤2中验证了 19个候选microRNA在肝癌患者血 清中的水平均升高。进一步检测了候选microRNA在训练组(样本量为257份)中的水平，并确 立了区分肝癌与非癌对照的最优血清microRNA组合。进而在独立的验证组1及验证组2(样 本量分别为352、139份）中验证了该血清microRNA组合可W区分肝癌与非癌对照。与此同 时，发明人发现相较传统的肝癌筛查手段，如AFP，血清microRNA组合在小肝癌、B化C早期及 AFP阴性的肝癌患者中具有更好的诊断效果。
[0029] 在另一个方面，本发