柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及相橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物 学分子遗传鉴定技术领域。
【背景技术】
[0002] 黄龙病化uanglongbing)是一种世界范围的相橘毁灭性细菌病害，其病原物为初 皮部限制性难培养细菌。到目前已发现Ξ个种：亚洲种（Candidatus Liber ibacter asiaticus)、非洲种（Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种（Candidatus Liberibacter americanus)，其中亚洲种发生流行最为广泛，在我国发生流行的也是亚洲 种。黄龙病每年对我国相橘产业造成的经济损失高达数十亿元。及时确诊田间黄龙病感染 树并移除，是黄龙病综合防控中的重要一环。因此建立相橘黄龙病菌亚洲种的高灵敏性分 子检测方法对于黄龙病的防控极其重要。
[0003] 目前，相橘黄龙病菌亚洲种的定性分子检测方法大部分为常规聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR)法，但常规PCR法的检测灵敏度往往仅有1 X 103拷贝/μ L[i]WW。鉴于黄龙病菌在相橘植株体内分布不均匀，开发灵敏度更高的检测方法极其必 要。虽然巢式PCR(化sted PCR)法可有效提高检测灵敏度，其检测灵敏度较常规PCR法高 100-1000倍[^^，但由于在试验中需要在第一轮PCR完成后打开PCR管盖，加入其它试剂后 再开始第二轮巢式反应，或将第一轮PCR产物稀释后，再进行第二轮巢式PCR，运些步骤大大 增加了 PCR反应被污染的可能性，导致易出现假阳性W。也正因为运个缺陷，在实际分子检 测中，极少有用巢式PCR法来进行相橘黄龙病菌检测。最近出现的环介导等溫扩增化OOP- mediated Isothermal Amplification, LAMP) 技术 W 通过 4 条特异性 引物和 一种具有链置 换特性的DNA聚合酶，在等溫条件下可高效、快速、高特异性地扩增祀序列，并且与PC时目比， 环介导等溫扩增技术检测灵敏度更高，为几个拷贝，耗时更短，在Ih内可将祀序列扩增至 109倍，因此在病原微生物检测中得到广泛应用WW，最近在相橘黄龙病菌亚洲种的检测上 也有报道WW。但是，环介导等溫扩增技术由于扩增产物为一系列从大到小的核酸片段而 无标识性的1条或少数几条特定长度的核酸片段，因此存在着一定的缺陷：（1)扩增产物不 易分离；（2)若有非特异性扩增的产生，则不易辨别，易出现假阳性。因此，建立一种 检测灵敏度和环介导等溫扩增技术接近，但又易于判断是否有非特异性扩增（即降低假阳 性）的超灵敏度相橘黄龙病菌亚洲种定性分子检测方法，对于相橘黄龙病的诊断乃至黄龙 病的综合防控意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一，是提供一种相橘黄龙病菌亚洲种检测用引物。
[0005] 本发明的目的之二，是提供一种相橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒。
[0006] 本发明的目的之Ξ，是提供一种相橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应 (Polymerase Qiain Displacement Reaction,PCDR)检测方法。
[0007] 本发明先提取样品DM, WDNA为模板，采用特异性检测引物进行聚合酶链式置换 反应扩增，通过读取电泳结果，快捷方便地鉴定出相橘黄龙病菌亚洲种。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种相橘黄龙病菌亚洲种检测用引 物，包括W下碱基序列：
[0009] 上游引物：SEQ ID N0.1，
[0010] 下游引物:SEQ ID NO.2。
[0011] 序列信息见表1。其中上游引物结合位点位于相橘黄龙病菌亚洲种基因组上串联 重复序列区域，该串联重复序列区域位于相橘黄龙病菌亚洲种g邱sy株系基因组(基因库登 录号CP004005)上第683160~683213位核巧酸，含2个串联的大小为27bp的重复序列单元； 下游引物结合位点位于相橘黄龙病菌亚洲种g邱sy株系基因组上第683394~683420位核巧 酸，为相橘黄龙病菌亚洲种特异性序列。
[0012]表1相橘黄龙病菌亚洲种检测用引物
[0013]
[0014] -种相橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，包括上文所述的相橘黄龙病菌亚洲种检测 用引物。
[0015] 在上述技术方案的基础上，本发明还可W做如下改进。
[0016] 进一步，还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为从黄龙病阳性相橘植株上斑 驳型黄化叶片中脉组织提取的DNA，所述阴性对照为从健康相橘植株叶片中脉组织提取的 DNA。
[0017] 进一步，还包括聚合酶链式置换反应液，上述聚合酶链式置换反应液包括含1XSD Polymerase Reaction Buffe;r、3mmol/L MgCl2、375ymol/L dNTPs、0.2U/化 SD酶和d地2〇。
[0018] -种相橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其利用上文所述的试剂 盒，对样品DNA进行聚合酶链式置换反应方法检测，包括如下步骤：
[0019] (1)模板DNA的提取:从待测的相橘植株叶片中脉组织提取DNA，作为待测样品；
[0020] (2)构建聚合酶链式置换反应体系:反应体系总体积为20yL，其中： l〇xSD Pol vine rase 民'e￡ie t i o打 B'lrf f er 2 μ L lOOmmoVLMgCl?. 0. 6 μ L 2. 5mmol化加 TPs 3μ Ι 5 μ mol/L上游引物 1 μ L
[0021] 5 μ mol化下游引物 2jiL ?ου/μ LSD 酶 0. 4μΙ 10()ng/,Li L 脚A 模板 ΙμΙ ddH,0 9 μ ?
[0022] 聚合酶链式置换反应扩增反应:将待测样品、阳性对照和阴性对照分别进行聚合 酶链式置换反应扩增，所述聚合酶链式置换反应扩增反应的参数为:92°C，预变性2min; 92 °(：，变性3〇3;62°(：，退火/延伸2111111;35个循环;62°(：，延伸1〇111111;
[0023] (3)分别得到待测样品、阳性对照和阴性对照的聚合酶链式置换反应扩增产物；
[0024] (4)聚合酶链式置换反应产物进行电泳检测：分别取步骤(3)所得待测样品、阳性 对照和阴性对照的聚合酶链式置换反应扩增产物各扣L，进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝 胶电泳，并用凝胶成像仪观察并保存电泳结果，在234bp和261bp处各出现一条特异性扩增 条带或只在234bp处出现一条特异性扩增条带的为相橘黄龙病菌亚洲种阳性样品，不出现 扩增条带的为相橘黄龙病菌亚洲种阴性样品。
[0025] 本发明的有益效果是：
[00%] 1.本发明根据相橘黄龙病菌亚洲种基因组上的串联重复序列特征设计引物，配合 本发明研制的试剂盒和开发的聚合酶链式置换反应方法，可用于相橘黄龙病的高准确性分 子诊断。
[0027] 2.本发明的相橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测试剂盒，操作简单，市 场前景广阔，适合规模化应用。
[002引3.本发明对相橘黄龙病菌亚洲种的检测灵敏度极高，达到10拷贝AiL。与常规PCR 法相比，检测灵敏度高100倍;与环介导等溫扩增技术相比，检测灵敏度接近，但由于本发明 扩增产物为特定大小的片段，因此本发明的特异性检测效果更佳，假阳性的可能性也更低。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明的含2个串联的重复序列单元的DNA双链模板的聚合酶链式置换反应 反应示意图。
[0030] 图2为本发明的仅含1个重复序列单元的DNA双链模板的聚合酶链式置换反应反应 不意图。
[0031] 图1和图2中，各标号所代表的部件列表如下：
[0032] A、重复序列单元，B、重复序列单元互补序列，C、上游引物，D、下游引物。
[0033] 图3为本发明的相橘黄龙病菌亚洲种常规PCR检测方法灵敏度测试图（浓度为IX 1〇5拷贝/化~1 X10。拷贝AiL)。
[0034] 图3中，M: lOObp梯度的DNA分子量标准；1-3:TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 105拷 贝AiL 4-6: TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 104拷贝AiL 7-9: TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 1〇3拷贝AiL 10-12: TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 102拷贝ΑΛ; 13-15: TR-S重组质粒标 准品浓度为1 X 10l拷贝/μレ16-18:了3-5重组质粒标准品浓度为1 X 10^^拷贝/μレ 19-21:阴性 对照。
[0035] 图4为本发明的相橘黄龙病菌亚洲种常规PCR检测方法灵敏度测试图（浓度为IX 1〇3拷贝/化~1 X 1〇2拷贝AiL)。
[0036] 图4中，M: lOObp梯度的DNA分子量标准；1-3:TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 103拷 贝4-6:TR-S重组质粒标准品浓度为1/2 X 103拷贝AiL 7-9:TR-S重组质粒标准品浓度 为1/4 X 103拷贝ΛΛ; 10-12: TR-S重组质粒标准品浓度为1/6 X 103拷贝ΛΛ; 13-15: TR-S重组 质粒标准品浓度为1/8 X 103拷贝AiL 16-18: TR-S重组质粒标准品浓度为1 X 102拷贝AiL 19-21:阴性对照。
[0037] 图5为本发明的相橘黄龙病菌亚洲种聚