利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法
【专利摘要】本发明属于果树病害防治技术领域，具体公开了一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法。所述柑橘黄龙病防控药剂筛选方法是以染病柑橘接穗为对象，并运用real?time PCR定量检测经药剂处理后，染病接穗中黄龙病菌含量的变化，并以此来评价处理药剂的防控效果。本发明直接以染病柑橘接穗为研究对象，对药剂的药效评价更符合实际情况，免除中间寄主（如利用柑橘木虱或长春花进行的抗柑橘黄龙病菌的药剂筛选）所带来的影响。解决了目前抗柑橘黄龙病药剂筛选过程复杂，缺乏一套可靠、有效的评价体系等问题，为柑橘黄龙病的防治提供可靠的技术和理论依据。
【专利说明】
利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及果树病害防治药剂筛选的方法，具体涉及一种利用嫁接进行柑橘黄龙 病防控药剂筛选的方法，属于果树病害防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害，也是各个柑 橘主产区重点检疫对象。我国柑橘黄龙病病原菌属于亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. L. asiaticus)，是危害面积最广的黄龙病菌，它主要以柑橘木虱为天然 媒介进行传播。在HLB研究中，病原菌的分离培养是一个关键环节，也是目前研究工作的一 个瓶颈。虽然，Davis等(2008)和Sechler等(2009)分别通过共培养和纯培养获得病原菌，但 获得的培养物均无法完成继代培养，也未见其他研究人员完成相应的重复试验。病原菌无 法纯培养，对病原菌的生理生化研究也相对较少，导致有效的杀灭药剂筛选进展缓慢。在没 有理想的防治药剂和抗病品种的条件下，HLB的防治主要采取及时挖除病株、防治柑橘木虱 和推广使用无病苗木的防控策略。对于防治技术的研究，主要集中在柑橘木虱的防治上。通 过切断柑橘黄龙病的传播媒介，来阻止黄龙病菌的传播。
[0003] 目前，在国内外针对病原菌本身而开展化学防治药剂筛选试验均有所进展。但是， 所涉及的防治药剂筛选方法一般评价体系以植株发病症状变化为主，缺乏一套可靠、有效 的评价体系，且筛选周期一般都比较长。近年来，Zhang等（2010)和王华堂等(2015)分别利 用染病长春花和染病木虱进行柑橘黄龙病防治药剂筛选，并构建了相应的初筛体系。然而 这些体系并非在柑橘植株上进行，而是采用中间寄主进行防治药剂筛选，对筛选结果可能 会造成一定的影响。总而言之，目前在柑橘上进行黄龙病菌防治药剂筛选过程复杂，且缺乏 一套可靠、有效的评价体系。
【发明内容】
[0004] 本发明克服现有防治药剂筛选技术中的不足之处，提供了一种利用嫁接进行柑橘 黄龙病防控药剂筛选的方法。本发明利用嫁接技术，可直接以柑橘为对象，对防治柑橘黄龙 病的药剂进行快速筛选与可靠的评价。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 本发明利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，步骤如下： (1)健康砧木的培育：自己培育或从无病苗圃购买2年生枳壳幼苗，经real-time PCR检 测，确定为健康植株，保育在防虫温室中作为药剂筛选的砧木。
[0006] (2)感病接穗的采集:晴天下午3-5点，选取田间具有黄龙病典型症状的当年生徒 长枝或发育枝，粗度为0.4-1.0 cm的枝条，用修剪刀从母树上剪下;将米下的接穗截成长度 约为10-12 cm，含有4~5个芽眼，并留下生长顶端的2-3片叶片，提取其他叶片的叶中脉总 DNA作为real-time PCR检测模板;接穗采集后，做好保湿处理，并经real-time PCR检测，确 定为感病接穗，作为药剂筛选的接穗。其特征在于黄龙病典型症状为叶片出现黄化、斑驳或 果实出现红鼻果。所述保湿处理为及时用准备好的湿布包起来，并置于3-4 °C下保藏，避免 接穗因失水而影响后续嫁接成活率。
[0007] (3)待筛选药剂处理：取待筛选的药剂，根据药剂的有效成分，配制成适宜的处理 浓度，感病接穗浸泡待筛选药剂12_24h后取出，备用。
[0008] (4)接穗嫁接:选择2年生、主干枝条直径为0.5-2.0cm的健康枳壳幼苗作为砧木； 取出药剂处理后的接穗，选取饱满的芽，嫁接到健康枳壳砧木上，用薄膜将砧木和接穗全部 扎紧，并进行嫁接后日常管理。嫁接后日常管理为嫁接后2个月内，抹去砧木萌发的芽，防止 养分消耗，有利于嫁接部位愈合和接穗生长;待接穗上的芽长出1 cm时，挑开薄膜包扎物， 引芽出袋，当长至3-5cm时，除去全部薄膜包扎物;保持土壤湿度。所述保持土壤湿度一般为 60-90%〇
[0009] (5)抗黄龙病菌药剂的筛选:嫁接后3个月内，观察接穗的生长情况，同时，统计不 同药剂处理的接穗成活率和检测接穗上新生枝条的黄龙病菌含量，筛选出抗黄龙病菌的药 剂。
[0010] 有益效果： 1、结果可靠:本发明所涉及的方法，直接以柑橘植株为对象，实验结果更符合实际情 况，省去中间寄主(如利用长春花进行防治柑橘黄龙病药剂筛选)所带来的影响。
[0011] 2、评价体系准确:本发明所采用的real-time PCR方法能准确的定量出药剂处理 前后接穗上病菌含量的变化，为整个评价体系提供了准确、可靠的数据支撑。
[0012] 3、操作简便:本发明所采用的方法主要涉及嫁接和定量检测，这些技术都很成熟， 操作起来也很方便。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明染病柑橘接穗药剂处理后嫁接的生长情况图。其中：a:嫁接;b:嫁接 后15d; c:嫁接后30d; d:嫁接后45d; e:嫁接后60d。
[0014]图2为本发明二氯异氰尿酸钠(NaDCC)处理后染病柑橘接穗的嫁接成活率图。
[0015]图3为本发明盐酸四环素(TET)处理后染病柑橘接穗的嫁接成活率图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明： 利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，步骤如下： (1)健康砧木的培育：自己培育或从无病苗圃购买2年生枳壳幼苗，经real-time PCR检 测，确定为健康植株，保育在防虫温室中作为药剂筛选的砧木。
[0017] (2)感病接穗的采集:晴天下午3-5点，选取田间具有黄龙病典型症状的当年生徒 长枝或发育枝，粗度为0.4-1.0 cm的枝条，用修剪刀从母树上剪下;将米下的接穗截成长度 约为10-12 cm，含有4~5个芽眼，并留下生长顶端的2-3片叶片，提取其他叶片的叶中脉总 DNA作为real-time PCR检测模板;接穗采集后，做好保湿处理，并经real-time PCR检测，确 定为感病接穗，作为药剂筛选的接穗。其特征在于黄龙病典型症状为叶片出现黄化、斑驳或 果实出现红鼻果。所述保湿处理为及时用准备好的湿布包起来，并置于3-4 °C下保藏，避免 接穗因失水而影响后续嫁接成活率。
[0018] (3)待筛选药剂处理：取待筛选的药剂，根据药剂的有效成分，配制成适宜的处理 浓度，感病接穗浸泡待筛选药剂12_24h后取出，备用。
[0019] (4)接穗嫁接:选择2年生、主干枝条直径为0.5-2.0cm的健康枳壳幼苗作为砧木； 取出药剂处理后的接穗，选取饱满的芽，嫁接到健康枳壳砧木上，用薄膜将砧木和接穗全部 扎紧，并进行嫁接后日常管理。嫁接后日常管理为嫁接后2个月内，抹去砧木萌发的芽，防止 养分消耗，有利于嫁接部位愈合和接穗生长;待接穗上的芽长出1 cm时，挑开薄膜包扎物， 引芽出袋，当长至3-5cm时，除去全部薄膜包扎物;保持土壤湿度。所述保持土壤湿度一般为 60-90%〇
[0020] (5)抗黄龙病菌药剂的筛选:嫁接后3个月内，观察接穗的生长情况，同时，统计不 同药剂处理的接穗成活率和检测接穗上新生枝条的黄龙病菌含量，筛选出抗黄龙病菌的药 剂。
[0021 ]实施例1:药剂处理后染病接穗的嫁接 ① 统筹安排试验，嫁接行为一般选择在环境温度为20 °C时进行； ② 选择2年生枳壳幼苗，主干枝条直径约为15mm，在离土约为10 cm处用修剪刀截断，整 平截面，并保持5°斜面； ③ 取出接穗，选一个饱满的芽，在芽背面下方2cm削成斜面，斜面与纵轴约成30°夹角， 削开尖部皮层，让皮层与木质部分离至芽剪掉； ④ 在砧木的截面上，以不伤害木质部为前提，用嫁接刀由上至下在砧木的一侧皮上垂 直切开； ⑤ 把削好的接穗斜面朝下插入砧木，不留创伤面，用薄膜将砧木和接穗全部扎紧； ⑥ 嫁接后管理:嫁接后2个月内，抹去砧木萌发的芽，防止养分消耗，有利于嫁接部位愈 合和接穗生长;待接穗上的芽长出约1 cm时，挑开薄膜包扎物，引芽出袋，当长至4 cm时，除 去全部薄膜包扎物;生长期追少量肥料;保持土壤湿度为80%。
[0022]实施例2:柑橘黄龙病健康植株和染病接穗的检测 ① 柑橘叶片总DNA的提取(CTAB法） 剪取0.5 g叶中脉，置于研钵内，用液氮磨成细粉;将细粉转到2 mL离心管，加900 yL 2%CTAB，10 yL β-巯基乙醇，90 yL 10%SDS，2 yL蛋白酶K;65°C，水浴 1 h，期间每 10 min轻 轻摇勾1次;冷却至室温，12000 rpm离心10 min;取上清，加入等体积氛/氯仿/异戊醇(25: 24:1)，轻轻颠倒，静置5min，12000rpm离心10min;取上清，加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻 轻颠倒，静置5 111；[11，12000印1]1离心1〇1]1；[11;取上清，加入等体积异丙醇(或2.5倍体积无水 乙醇），置于-20 °C，2 h(或过夜）；12000 rpm离心10 min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次， 再将沉淀风干;将沉淀溶于30 yL TE(含RnaseA 50 yg/mL)，沉淀溶解后-20 °C保存； ② 病原菌的real-time PCR检测 本发明应用Li等(2006)建立的柑橘黄龙病实时荧光定量PCR检测体系(探针法），对待 测样品进行定量检测，扩增引物为HLBasf/HLBasrG' -TCGAGCGCGTATGCAATACG-3' /V -GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3')，探针为HLBpG' -FAM-AGACGGGTGAGTAACGCG-BHQ-3')，该 扩增引物及探针由大连宝生物有限公司合成。qPCR(probe)反应体系如下：2 XPrimerMix 12·5μL，6·25μΜ HLBasf/HLBasr各 1μL，3·75μΜ HLBp lyL，模板DNA 50ng，双蒸水补足至25μ L;反应程序如下:94 °C，3 min，94 °C，10 s，58 °C，30 s，扩增42个循环，58 °C同步采集荧 光。根据real-time PCR检测结果计算叶片中黄龙病菌含量。
[0023]实施例3:不同药剂处理后接穗的生长情况和嫁接成活率 如图1所示，接穗嫁接后15 d左右开始萌发，30 d后已完全萌发，此时应将嫁接包扎薄 膜挑开，引芽出袋;嫁接后45 d，芽已长成长度约为4 cm的枝条，此时将所有嫁接包扎薄膜 小心卸下;嫁接后60 d，枝条下部叶片开始老熟，再经过1个月后，待叶片完全老熟后可进行 采样，检测病菌含量。从图2和图3的结果可以明显看出二氯异氰尿酸钠(NaDCC)和盐酸四环 素(TET)药剂处理接穗时，总体嫁接成活率都比较高，但嫁接成活率随处理浓度的增加成下 降趋势，最低嫁接成活率分别为58%和50%。
[0024]实施例4:不同药剂处理后新梢黄龙病菌含量 利用real-time PCR定量测定药剂处理前后叶中脉的带菌量(CNHLB/g)。从表1可以看 出，经过药剂处理后，黄龙病菌的含量有明显的减少。其中，二氯异氰尿酸钠(NaDCC)在有效 氯含量约为313 mg/L时，病菌浓度变化最显著，病菌浓度降低了96.0%;当NaDCC在有效氯含 量约为5000 mg/L时，病菌浓度降低了88.26%。
[0025] 表1不同药剂处理对病菌含量的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，其特征在于步骤如下： (1) 健康砧木的培育：自己培育或从无病苗圃购买2年生枳壳幼苗，经real-time PCR检 测，确定为健康植株，保育在防虫温室中作为药剂筛选的砧木； (2) 感病接穗的采集:晴天下午3-5点，选取田间具有黄龙病典型症状的当年生徒长枝 或发育枝，粗度为〇 . 4-1.0 cm的枝条，用修剪刀从母树上剪下；将采下的接穗截成长度为 10-12 cm，含有4~5个芽眼，并留下生长顶端的2-3片叶片，提取其他叶片的叶中脉总DNA作 为real-time PCR检测模板;接穗采集后，做好保湿处理;经real-time PCR检测，确定为感 病接穗，作为药剂筛选的接穗； (3) 待筛选药剂处理:取待筛选的药剂，根据药剂的有效成分，配制成适宜的处理浓度， 感病接穗浸泡待筛选药剂12-24 h后取出，备用； (4) 接穗嫁接:选择2年生、主干枝条直径为0.5-2.0 cm的健康枳壳幼苗作为砧木;取出 药剂处理后的接穗，选取饱满的芽，嫁接到健康枳壳砧木上，用薄膜将砧木和接穗全部扎 紧，并进行嫁接后日常管理； (5) 抗黄龙病菌药剂的筛选:嫁接后3个月内，观察接穗的生长情况，同时，统计不同药 剂处理的接穗成活率和检测接穗上新生枝条的黄龙病菌含量，筛选出抗黄龙病菌的药剂。2. 根据权利要求1所述的一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，其特征 在于:黄龙病典型症状为叶片出现黄化、斑驳或果实出现红鼻果。3. 根据权利要求1所述的一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，其特征 在于:保湿处理为及时用准备好的湿布包起来，并置于3-4 °C下保藏，避免接穗因失水而影 响后续嫁接成活率。4. 根据权利要求1所述的一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，其特征 在于:嫁接后日常管理为嫁接后2个月内，抹去砧木萌发的芽，防止养分消耗，有利于嫁接部 位愈合和接穗生长;待接穗上的芽长出1 cm时，挑开薄膜包扎物，引芽出袋，当长至3-5 cm 时，除去全部薄膜包扎物;保持土壤湿度。5. 根据权利要求4所述的一种利用嫁接进行柑橘黄龙病防控药剂筛选的方法，其特征 在于:保持土壤湿度为60-90%。
【文档编号】A01G1/06GK105830749SQ201610198136
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】王贤达, 范国成, 胡菡青, 林雄杰
【申请人】福建省农业科学院果树研究所