专利名称：柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体及其制备方法，以及该抗体在检测柑橘黄龙病菌中的应用。
背景技术：
柑橘黄龙病是柑橘生产上防治难、危害重、威胁大的一种毁灭性病害，被人们称作柑橘上的“艾滋病”，广泛分布在我国几乎所有的柑橘产区。浙江省于上世纪80年代在温州南部首次发现该病害，随着气候变暖和柑橘生产的发展，疫情北扩，目前除衢州和杭州尚未有报道外，台州、温州等主要柑橘产区病情严重。作为一种毁灭性病害，柑橘染病植株往往在2 3年内丧失结果能力或死亡，甚至造成毁园。柑橘黄龙病的猖獗危害和蔓延扩散，对柑橘产业的稳定和发展造成了严重的威胁，已经成为柑橘产业发展的重大障碍。目前对柑橘黄龙病尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗性品种，因此综合防治是当前该病害防治的主要方法。其中，严格的植物检疫是保护无病区和新区柑橘的前提，建立无病毒苗圃、培育和种植无病毒苗木是预防黄龙病的基础，及时消灭传病木虱和彻底挖除病树是防止病害流行的关键措施。然而，这些工作的开展都必须建立在明确柑橘材料内是否存在黄龙病菌的基础之上。因此，对黄龙病菌快速准确地检测和诊断是当前该病害有效防控的重要前提。现有对柑橘黄龙病的检测和诊断，已经发展了多种方法和技术，如田间诊断、指示植物鉴定、显微镜观察、血清学检测、核酸杂交检测及PCR检测等。虽然这些方法促进了人们对柑橘黄龙病的深入研究起一定的作用，然而在柑橘实际生产应用中却表现出不同程度的局限性。如在田间诊断过程中，由于病害症状复杂多变，且易与缺素、病毒病害和药害等症状相混淆，因此常导致诊断错误；而嫁接成功率不高和稳定性差等问题影响了通过指示植物进行鉴定的效率，且该方法耗时较长(往往要经过几个月时间才能得知鉴定结果)；通过显微镜、血清学等方法鉴定则需要特定的仪器设备和专业的实验技能；核酸杂交和各种 PCR技术虽然可以快速准确地检测黄龙病，但与显微镜、血清学等方法一样，需要昂贵的仪器设备、试剂材料和熟练的实验技能。因此，迫切需要开发一种新技术或新产品，应用于柑橘实际生产中对黄龙病快速、准确地检测和诊断。胶体金标记免疫层析技术是一种新型的免疫学快速检测和诊断技术。以此为基础开发的胶体金免疫层析试纸条不仅具有灵敏度高、特异性强、使用方便、检测快速(通常可在10分钟内得到检测结果)等特点，而且在使用过程中不需要特定的仪器设备和复杂的操作技巧，因此特别适应于广大基础单位和个人的现场检测和诊断。胶体金免疫层析试纸条主要工作原理是抗原与抗体的特异性结合，因此制备高质量的抗体是研制理想的检测产品的关键。通过以往对黄龙病的血清学研究发现，制备的黄龙病菌抗体往往只与相似的抗原发生结合，有时甚至只与制备该抗体的抗原结合。并且目前黄龙病菌仍不能人工培养，所以用于制备抗血清的抗原只能从大量的植物病叶中提取，但该病菌仅局限存在于韧皮部筛管细胞中，含量较低且分布不均勻，因而所抽提的病菌浓度和纯度较低，进而导致所制备的抗血清效价较低、特异性较差。这些问题在很大程度上限制了黄龙病菌抗血清及相关产品或技术的开发和应用。通过原核细胞对蛋白进行高效表达是获取高产量、高纯度抗原的有效途径，革兰氏阴性细菌外膜蛋白(outer member protein，0MP)作为细菌外膜的重要组成部分，具有良好的免疫原性。目前已经获知黄龙病菌外膜蛋白基因序列，且分析发现其具有较强的表面抗原活性。但通过体外表达方式大量获得该蛋白，并以此为免疫原制备抗血清并将其用于柑橘黄龙病菌的检测并未有见报道。
发明内容
本发明的目的在于通过对柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因进行原核表达，获得了大量高纯度的目的蛋白，并以此为免疫原注射大白兔，制备并纯化了抗外膜蛋白的多克隆抗体， 同时提供柑橘黄龙病菌外膜蛋白的多克隆抗体的制备方法，以及该抗体在检测柑橘黄龙病菌中的应用。本发明柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体其特征在于由原核表达获得的目的蛋白作为免疫原注射大白兔后制备获得，分别与柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端和C端特异性结合，有效检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。本发明通过对柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因进行原核表达，获得了大量高纯度的目的蛋白，并以此为免疫原注射大白兔，制备并纯化了抗外膜蛋白的多克隆抗体。经效价测定和酶联免疫实验表明，所制备抗体效价高、特异性好，可用于田间感染柑橘黄龙病菌样品的检测。该产品为进一步开发可用于柑橘黄龙病菌现场快速检测的胶体金免疫层析试纸条奠定了基石出。本发明柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于1)根据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因序列，设计并合成特异性引物0MPN5 5' -AGC GGATCCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3‘和 0MPN3 5 ‘ -AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3'，以及引物0MPC5 5‘ -AGCGGATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3‘和0MPC3 5‘ -AGCAAG CTTTTACATGCGATTACCTATACG-3‘；2)利用CTAB法提取柑橘黄龙病菌侵染的柑橘叶片总DNA，然后以此为模板，以引物0MPN5和0MPN3扩增柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端-OMP-N基因片段，以引物0MPC5和0MPC3 扩增柑橘黄龙病菌外膜蛋白C端-OMP-C基因片段；3)回收两种扩增产物，分别将其与克隆载体PMD18-T连接，构建获得含有OMP-N基因片段的重组质粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重组质粒pMD_0MP-C，利用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切重组质粒pMD-OMP-N、pMD-0MP-C及原核表达载体pIGH3，回收后利用T4DNA连接酶将目的基因片段与表达载体连接，构建获得含有OMP-N基因片段的重组质粒PIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的重组质粒pIGH3-0MP_C ；4)分别将重组质粒转化到宿主菌BL21中，挑取含重组质粒ρIGH3-0MP-N和 PIGH3-0MP-C的菌落，于LB液体培养基中培养，菌液0D600为0. 5-0. 6时，加入0. 5mM的 IPTG进行诱导表达，4小时后离心收菌，通过SDS-PAGE电泳对表达产物进行检测；5)含重组质粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C菌液经IPTG诱导后离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液悬浮沉淀，利用超声波破碎仪破碎菌体细胞，离心收集包涵体蛋白，用8M的
4尿素变性溶解，过亲和层析柱纯化后于TGE复性液中透析复性，最后收集纯化的蛋白OMP-N 禾口 OMP-C ；6)以纯化的蛋白作为免疫原注射大白兔制备抗血清，开始以500μ g/500y 1蛋白配合等量弗氏完全佐剂注射，1周后以250μ g/500y 1配合等量弗氏不完全佐剂加强免疫， 共5次，最后于兔子耳动脉取血清，进行ELISA检测，然后提取抗血清；7)分别利用原核表达产物OMP-N和OMP-C制备抗原交联柱，抗血清经高速离心， 滤纸过滤后，过柱纯化，利用IOOmM的Glycine-HCl-pH2. 3洗脱抗体，收集洗脱抗体用Tris 缓冲液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小时，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4_8 个小时，即获得浓度分别为6. Omg/mL和4. 5mg/mL的多克隆抗体。本发明提供两种柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的制备方法主要通过原核表达系统获得大量高纯度的柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端和C端肽段，然后以此为免疫原注射大白兔制备抗血清，最后纯化抗血清获得对柑橘黄龙病菌外膜蛋白有特异性作用的多克隆抗体。本发明柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的应用，其特征在于通过间接ELISA法利用该抗体检测柑橘黄龙病菌，田间采集疑似柑橘黄龙病病害症状的样品材料，及作为阴性对照的健康柑橘叶片和作为阳性的感染柑橘黄龙病菌的柑橘叶片，用液氮和包被缓冲液研磨后包被酶标板，然后按照间接ELISA标准操作方法进行，即依次于酶标孔中加入封闭液、多克隆抗体、酶标记的羊抗兔二抗，最后加入酶作用底物显色观察，并于酶标仪中读取光吸收值，根据待测样品OD45tl/阴性对照OD45tl的比值判定样品是否感染黄龙病菌。本发明提供两种柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的应用该抗体可通过间接 ELISA法用于对田间柑橘黄龙病的诊断，可对不同柑橘品种中和不同地区分离物的柑橘黄龙病菌进行特异性检测。以往对柑橘黄龙病菌抗体的制备通常以提纯的柑橘黄龙病菌作为免疫原，因柑橘黄龙病菌不能人工培养，因此先要将感染黄龙病菌的柑橘枝条嫁接到长春花植株上，然后以感病的长春花枝条反复嫁接，获得大量感染病菌的长春花叶片，然后再通过超速离心、蔗糖密度梯度离心等方法获得黄龙病菌作为免疫原。该方法效率低、耗时长，且获得的免疫原往往数量较少且纯度不高，导致最后制备的抗体效价较低、灵敏度较差等。与之相比，本发明具有以下有益效果1)缩短了制备周期本方法通过原核表达方式获得大量目的蛋白作为免疫原，不需要通过嫁接等手段获得大量的样品材料，因此也就避免了嫁接周期长、嫁接存活率低等因素的影响，缩短了免疫原和抗体的制备周期，提高了效率。2)提高了免疫原的产量和纯度因柑橘黄龙病菌在植株中的含量较低，即使通过从大量病样材料中提取黄龙病菌，其最后的产量也往往较低，且植物体本身的一些组分不可能完全被分离掉，导致最后提取物纯度不够高。而本法通过原核表达系统只针对黄龙病菌外膜蛋白进行表达并分离纯化，可获得大量高纯度的免疫原。3)所制备抗体的特异性和灵敏度较高因作为免疫原的柑橘黄龙病菌提取物通常数量和纯度不高，而导致制备的抗体特异性和灵敏度不好。本法以高纯度的外膜蛋白作为免疫原制备的抗体，通过ELISA实验等检测表明，所制备的抗体能特异性检测柑橘黄龙病菌，而与缺素(如缺镁、缺锰、缺锌)和病毒性病害(如柑橘衰退病、柑橘碎叶病)引起的具有类似于柑橘黄龙病病害症状(如斑驳、黄化)的柑橘材料不产生阳性反应。另外，还可检测多个不同地区柑橘黄龙病菌分离物。
图1为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。M =DNA分子量标准，1 引物0MPN5/0MPN3 的扩增条带，2 引物0MPC5/0MPC3的扩增条带。图2为重组质粒pMD-OMP-N和pMD_0MP_C酶切产物电泳图。M =DNA分子量标准， 1 :pMD-0MP-N的酶切结果，2 :pMD-0MP-C的酶切结果。图3为重组质粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的酶切产物电泳图。M =DNA分子量标准，1 :pIGH3-0MP-N的酶切结果，2 :pIGH3-0MP_C的酶切结果。图4为原核表达载体pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的构建示意图。图5为诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图。M 蛋白质分子量标准，1 未诱导的含重组质粒PIGH3-0MP-N的菌体蛋白，2 诱导的含OMP-N的菌体蛋白，3 未诱导的含含重组质粒pIGH3-0MP-C的菌体蛋白，4 诱导的含OMP-C的菌体蛋白，图6为目的蛋白纯化产物的SDS-PAGE电泳图。M 蛋白质分子量标准，1 :目的蛋白 0ΜΡ-Ν, 2 目的蛋白 OMP-C。图7为抗体对目的蛋白的Western-blot检测结果。M 蛋白质分子量标准，1 =IOOpg OMP-N蛋白与抗体Anti-OMP-N结合的条带，2 IOpgOMP-N蛋白与抗体Anti-OMP-N结合的条带，3:100pg OMP-C 蛋白与抗体 Anti-OMP-C 结合，4 IOpg 0MP-C 蛋白与抗体 Anti-OMP-C 结
口 O
具体实施例方式实施例1外膜蛋白基因的扩增及表达载体的构建1.特异性引物的设计及合成利用生物信息学软件分析柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因序列，设计用于特异性扩增基因 N 端的特异性引物0MPN5 5 ‘ -AGCGGATCCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3 ‘和 0MPN3 5 ‘-AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3 ‘，用于扩增基因 C 端的引物 0MPC5 5 ‘ -AGCGG ATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3‘和0MPC3 5' -AGCAAGCTTTTACATGCGATTACCTATACG-3‘
，设计好的引物送交公司合成。2.柑橘叶片总DNA的提取田间采集柑橘黄龙病菌感染的柑橘叶片，取叶片中脉称重约0. 1-0. 2g，于无菌研钵中用液氮研磨至粉末状，加入适量的PVP和巯基乙醇，用改良的CTAB法抽提DNA，最后提取产物于15 μ L含RNase的TE溶液中溶解，取少量进行琼脂糖凝胶电泳以检测DNA的质量， 然后于-20°C保存备用。3.外膜蛋白基因的PCR扩增以1 -2 μ L总DNA为模板，分别以上述合成的特异性弓丨物0ΜΡΝ5/0ΜΡΝ3和0MPC5/ 0MPC3进行PCR，PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性Imin，58°C退火Imin，72°C延伸 Imin, 35个循环，最后72°C保温lOmin，PCR反应结束后，取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 并于凝胶成像系统中观察拍照。从扩增产物的电泳图谱中可观察到900bp和861bp左右大小的特异性条带(见附图1)，与预期结果一致，即为柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端(OMP-N)基因片段和C端(OMP-C)基因片段。4.目的基因的克隆目的基因与克隆载体的连接转化利用凝胶回收试剂盒回收上述PCR扩增产物， 取适量与克隆载体PMD18-T及连接液混合，然后放于16°C连接过夜；采用CaCl2法制备大肠杆菌DH5 α感受态细胞，采用热激法将上述连接产物转化到感受态细胞中，转化产物涂布 LB培养基平板，并于37°C培养过夜。阳性克隆的筛选鉴定挑取平板上生长的单克隆菌落，于液体LB培养基中震荡培养。用碱裂解法从培养菌体中抽提质粒，然后以质粒为模板利用引物0MPN5/0MPN3和 0MPC5/0MPC3进行PCR鉴定，同时用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定插入片段，从酶切产物的电泳图谱中可观察到2690bp左右的克隆载体条带和900bp、861bp左右的目的条带(见附图2)，表明已制备获得含有OMP-N基因片段的重组质粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重组质粒pMD_0MP-C。5.目的基因原核表达载体的构建目的基因与表达载体的连接转化用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切上述阳性克隆质粒pMD-OMP-N、pMD-OMP-C及原核表达载体pIGH3，利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。利用T4DNA连接酶将目的基因和表达载体的回收产物进行连接，于22°C连接过夜； 采用CaCl2法制备大肠杆菌DH5 α感受态细胞，采用热激法将上述连接产物转化到感受态细胞中，转化产物涂布LB培养基平板，并于37°C培养过夜。阳性克隆的筛选鉴定挑取平板上生长的单克隆菌落，于液体LB培养基中震荡培养。用碱裂解法从培养菌体中抽提质粒，然后以质粒为模板利用引物0MPN5/0MPN3和 0MPC5/0MPC3进行PCR鉴定，同时用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切质粒，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定插入片段，筛选阳性克隆，同时将阳性克隆送交公司测序鉴定。从酶切产物的电泳图谱中观察到5900bp左右的表达载体的条带和900bp、861bp左右的目的条带(见附图3)，且测序结果显示插入片段与黄龙病菌外膜蛋白序列一致，表明已成功构建含有OMP-N基因片段的原核表达载体pIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的原核表达载体pIGH3-0MP-C，构建流程见附图4。实施例2外膜蛋白的诱导表达及分离纯化1.外膜蛋白的诱导表达利用CaCl2法制备大肠杆菌BL21感受态细胞，将上述重组质粒pIGH3-0MP_N和 PIGH3-0MP-C分别转化到感受态细胞中，转化产物涂布LB培养基平板，并于37°C培养至菌落长出。挑取平板上的单克隆菌落，于LB液体培养基中震荡培养，至对数生长期(0D600为 0. 5-0. 6)加入0. 5mM的IPTG诱导目的蛋白的表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白的表达情况。结果显示在诱导后的菌体蛋白中有大小为58KD和55KD左右的特异条带出现(见附图5)，与预期目的蛋白大小一致。2.表达产物的分离纯化挑取含重组质粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的菌落，于3mL LB培养基中摇菌过夜，第2天将菌液按1 100的比例加入到300mL LB培养基中，0D600为0. 5-0. 6时，加入 0. 5mM的IPTG进行诱导，4小时后离心收菌。用PBS缓冲液悬浮沉淀，利用超声波破碎仪破
7碎菌体细胞，离心收集包涵体蛋白，用gM的尿素变性溶解，过亲和层析柱纯化后于TGE复性液中透析复性，最后收集纯化的目的蛋白OMP-N和0MP-C，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。结果显示表达产物中的大部分的菌体蛋白已去除掉，获得了较纯的目的蛋白(见附图6)。实施例3外膜蛋白多克隆抗体的制备及纯化1.抗血清的制备及效价测定分别取OMP-N蛋白和OMP-C蛋白500 μ g，用PBS补充到500 μ L，加等量弗氏完全佐齐U，乳化3次后，皮下注射大白兔(免疫前取阴性血清)，2周后用250 μ g/500 μ L蛋白加等量弗氏不完全佐剂加强免疫，之后分别在5周和8周后用250ug/500ul蛋白加等量弗氏不完全佐剂加强免疫，第10周牺牲大白兔，提取抗血清。于酶标板中分别包被OMP-N蛋白和 OMP-C蛋白，将阴性血清按1 1000和1 4000稀释，阳性抗血清按1 1000，1 4000， 1 16000，1 32000，1 64000，1 128000稀释，利用间接ELISA法测定抗血清效价。 ELISA检测结果表明，所制备的OMP-N抗体和OMP-C抗体效价均大于1 64000。2.抗体的纯化及检测分别利用5mg OMP-N蛋白和5mg OMP-C蛋白制备抗原交联柱，抗血清经过高速离心，滤纸过滤后，过柱纯化。首先用10倍柱体积PBS平衡交联柱，血清过柱流穿2次，再用含 IM NaCl的PBS缓冲液清洗柱子，最后用IOOmM的Glycine-HCl (pH2. 3)洗脱抗体，收集洗脱抗体用Tris缓冲液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小时，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4-8个小时，收取获得浓度分别为6. Omg/mL的OMP-N蛋白的多克隆抗体和4. Omg/ mL的OMP-C蛋白的多克隆抗体，置于_20°C冷冻保存。分别取10pg、100pg蛋白OMP-N和OMP-C，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，进行Western-blot实验，采用湿转法将蛋白转印到NC膜上，然后经过脱脂奶粉封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤后，进行曝光显色。结果显示所制备的抗体均能与目的蛋白特异性结合 (见附图7)。实施例4多克隆抗体的检测应用通过间接ELISA方法，利用所制备的抗体检测植物材料中的柑橘黄龙病菌，操作步骤如下1)采集植物叶片材料，取叶片中脉0. 1-0. 2g于研钵中研磨至粉末状，加入l_2mL 包被缓冲液充分研磨，同时处理健康的柑橘叶片和感染黄龙病的柑橘叶片分别作为阴性对照和阳性对照；2)将研磨液移入离心管中，于离心机中IOOOOrpm离心l_2min，取上清液加入酶标板中(10(^17孔)，371温育2-311或41孵育过夜；3)甩干酶标板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次间隔3_5min，每孔加入 200 μ L含有2% BSA的封闭液，37°C温育l_2h ； 4)甩干酶标板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次间隔3_5min，每孔加入 100 μ L适当稀释的多克隆抗体，37°C孵育2h ；5)甩干酶标板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次间隔3_5min，每孔加入 100 μ L辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，37°C温育l_2h ；6)甩干酶标板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次间隔3_5min，每孔加入
8100口1^底物显色缓冲液11^，371温育至出现颜色反应(一般10-3011^11)，加入5(^1^ 2M的 H2S04终止反应，将酶标板置于酶标仪中读值；7)根据S/N(待测样品OD450/阴性对照OD45tl)的比值判定样品是否感染黄龙病菌， 判定标准为S/N彡2. 1，判为阳性；1. 5彡S/N < 2. 1，判为疑似；S/N < 1. 5，判为阴性。1.抗体检测柑橘黄龙病样品的灵敏度田间采集栊柑、本地早、摱桔、甜橙等柑橘品种的叶片，以及通过嫁接感染柑橘黄龙病菌的长春花及健康长春花的叶片，每个品种10个样本，取其中部分材料用液氮研磨后提取DNA，用特异性引物A2 5 ‘ -TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3 ‘和J5 5 ‘ -ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3 ‘进行PCR扩增，鉴定待测样品中是否含有黄龙病菌； 剩余材料用包被缓冲液研磨后包被酶标板，利用所制备的抗体进行间接ELISA实验，同时比较PCR方法和ELISA方法对柑橘黄龙病样品的检出率。结果见表1，可以看出该两种抗体可较好地检测不同柑橘品种中感染的黄龙病菌，特别对于感染病菌的长春花样品，其S/N 值可达3. 0以上，其对柑橘黄龙病菌的检出率略低于PCR检测方法。表1间接ELISA法和PCR法对黄龙病菌的检测效果比较
权利要求
1.柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体，其特征在于由原核表达获得的目的蛋白作为免疫原注射大白兔后制备获得，分别与柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端和C端特异性结合，有效检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。
2.柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于1)根据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因序列，设计并合成特异性引物0MPN55' -AGCGGAT CCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3‘和 0MPN3 5' -AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3‘ ，以及引物 0MPC5 5 ‘ -AGCGGATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3 ‘和 0MPC3 5 ‘ -AGCAAGCTT TTACATGCGATTACCTATACG-3‘；2)利用CTAB法提取柑橘黄龙病菌侵染的柑橘叶片总DNA，然后以此为模板，以引物 0MPN5和0MPN3扩增柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端-OMP-N基因片段，以引物0MPC5和0MPC3 扩增柑橘黄龙病菌外膜蛋白C端-OMP-C基因片段；3)回收两种扩增产物，分别将其与克隆载体PMD18-T连接，构建获得含有OMP-N基因片段的重组质粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重组质粒pMD_0MP-C，利用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切重组质粒pMD-OMP-N、pMD-OMP-C及原核表达载体pIGH3，回收后利用T4DNA连接酶将目的基因片段与表达载体连接，构建获得含有OMP-N基因片段的重组质粒pIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的重组质粒pIGH3-0MP_C ；4)分别将重组质粒转化到宿主菌BL21中，挑取含重组质粒pIGH3-0MP-N和 PIGH3-0MP-C的菌落，于LB液体培养基中培养，菌液0D600为0. 5-0. 6时，加入0. 5mM的 IPTG进行诱导表达，4小时后离心收菌，通过SDS-PAGE电泳对表达产物进行检测；5)含重组质粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C菌液经IPTG诱导后离心收集菌体沉淀， PBS缓冲液悬浮沉淀，利用超声波破碎仪破碎菌体细胞，离心收集包涵体蛋白，用8M的尿素变性溶解，过亲和层析柱纯化后于TGE复性液中透析复性，最后收集纯化的蛋白OMP-N和 OMP-C ；6)以纯化的蛋白作为免疫原注射大白兔制备抗血清，开始以500μg/500y 1蛋白配合等量弗氏完全佐剂注射，1周后以250μ g/500y 1配合等量弗氏不完全佐剂加强免疫，共5 次，最后于兔子耳动脉取血清，进行ELISA检测，然后提取抗血清；7)分别利用原核表达产物OMP-N和OMP-C制备抗原交联柱，抗血清经高速离心，滤纸过滤后，过柱纯化，利用IOOmM的Glycine-HCl-pH2. 3洗脱抗体，收集洗脱抗体用Tris缓冲液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小时，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4_8个小时，即获得浓度分别为6. Omg/mL和4. 5mg/mL的多克隆抗体。
3.柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的应用，其特征在于通过间接ELISA法利用该抗体检测柑橘黄龙病菌，田间采集疑似柑橘黄龙病病害症状的样品材料，及作为阴性对照的健康柑橘叶片和作为阳性的感染柑橘黄龙病菌的柑橘叶片，用液氮和包被缓冲液研磨后包被酶标板，然后按照间接ELISA标准操作方法进行，即依次于酶标孔中加入封闭液、多克隆抗体、酶标记的羊抗兔二抗，最后加入酶作用底物显色观察，并于酶标仪中读取光吸收值， 根据待测样品OD45tl/阴性对照OD45tl的比值判定样品是否感染黄龙病菌。
全文摘要
柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体，其特征在于由原核表达获得的目的蛋白作为免疫原注射大白兔后制备获得，分别与柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端和C端特异性结合，有效检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。本发明通过对柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因进行原核表达，获得了大量高纯度的目的蛋白，并以此为免疫原注射大白兔，制备并纯化了抗外膜蛋白的多克隆抗体。经效价测定和酶联免疫实验表明，所制备抗体效价高、特异性好，可用于田间感染柑橘黄龙病菌样品的检测。该产品为进一步开发可用于柑橘黄龙病菌现场快速检测的胶体金免疫层析试纸条奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK102212134SQ20111009073
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者张利平, 杜丹超, 胡秀荣, 陈国庆, 鹿连明 申请人:浙江省柑桔研究所