专利名称：来自大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdGRP1及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自大丽轮枝菌的致病相关蛋白及其编码基因。
背景技术：
由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)所引起的棉花黄萎病是威胁棉花生产的主要病害，多年来一直严重影响着我国棉花的品质和产量。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益， 1992)，1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。，80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993，1995，1996， 2002年在全国范围内连续大发生，损失严重。至今，我国大部分主产棉区已成为黄萎病重病区。黄萎病致病菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。关于棉花黄萎病的致病机制有多种解释，其中以导管堵塞和中毒两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉(Garber，1966)。马远莉等(1990) 对棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大(最大的有17.7%)，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等(197 认为，黄萎病菌在代谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质一脂多糖的复合体。该复合物对感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内K+和Na+大量渗漏。 而抗病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。Wang等Q004)从黄萎病原菌的菌丝中分离到一个新的具有对棉花叶片有致萎作用的蛋白VdNEP。该蛋白可以诱导烟草叶片形成坏死斑，也可以使拟南芥产生抗病反应，因此该蛋白可能参与了黄萎病菌对棉花侵染时的互作反应。但目前尚不清楚该蛋白是否与以前已分离的毒素蛋白是同一物质。现在越来越多的研究表明，黄萎病菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键生化因子，同时组织导管的阻塞影响水分运输可能加剧了病症的产生。大丽轮枝菌是一种土传真菌，在干燥恶劣的环境下能够产生其休眠结构微菌核， 从而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成与其致病性息息相关。2004年，DobinsonKF等 (Dobinson,K. F. , et al.，2004)利用改造了的EZ: TN转座系统，对来源于番茄的大丽轮枝菌的胰蛋白酶VTPl成功的进行了定向敲除。该基因能够促进微菌核的形成，但是敲除以后没有影响其致病性及生长特性。2005年，Dobinson KF等对来源于莴苣和番茄的大丽轮枝菌的细胞分裂素活化蛋白激酶基因VMKl进行了敲除。敲除VMKl后菌株对各种宿主的致病性严重衰退，说明MAP激酶介导的信号通路在真菌致病性上起着重要作用。并且基因的敲除减少了孢子的产生和微菌核的形成，说明该基因可能参与多个细胞进程。2006年Dobinson KF等(Klimes，A, et al,2006)又利用此系统对来源于番茄的大丽轮枝菌的类型2疏水蛋白基因VDHl进行了敲除。该基因的敲除减少了微菌核的产生，但不影响其致病性。对孢子的产生也没有影响，但影响了孢子对干燥环境的耐受力。说明VDHl基因的功能是多方面的，可能与大丽轮枝菌在土壤中长期的生存有关。2008年Dobinson KF等又研究了在微菌核的形成过程中VDHl基因的调控和表达，发现VDHl基因在微菌核、菌丝融合体及孢子中特异表达，进一步证明了该基因与微菌核的形成相关。由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。植物在与病原物的长期协同进化过程中获得了一系列复杂的防御机制保护自己，抗性表现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理生化抗性。对黄萎病抗性不同的棉花品种在组织结构方面存在一定差异，已被国内外不少研究证实。抗病品种木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚，且木质部中含有较多的髓射线。 另外，抗病品种的导管腔和木质部的纤维腔直径小于感病品种，说明棉花品种对黄萎病的抗性与其具有坚实的木质部有关。棉花的生理生化抗病性方面已有过较多的研究，研究较多的抗病相关因子包括植保素、单宁、可溶性糖、氨基酸及多种酶类。棉株在遭受病菌侵袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酚、植保素、单宁等，另外还与一些酶类、蛋白以及小分子物质如h202。它们的作用是非专化性，与植物的基础抗性相关。棉花抗黄萎病的机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多，因此不断深入研究这些抗病反应产物在基因表达水平上的规律，对于进一步深入了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗性具有重要意义。抗病基因的获得是选育抗病品种的重要基础，目前通过分子生物学手段已经克隆的植物抗病基因大概有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通锈病(Puccinia Sorghi)基因Rpl_D，且在海岛棉上已经克隆了 NBS-LRR类抗病基因。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年李成葆等161对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了 1 个海岛棉品种的抗性， 结果显示表现耐病和抗病的占85%。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展，但还没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究，另外黄萎病菌〔大丽轮枝菌，Veriicillium dahliae)小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。因此，研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理就至关重要。根癌农杆菌是一种革兰阴性土壤杆菌，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞， 将其Ti质粒(tumor inducing plamid，肿瘤诱导质粒)上的T-DNA (transfer DNA，转化 DNA)转入植物细胞并整合到植物的基因组，最终导致植物肿瘤的发生。因为这一机制，根癌农杆菌及其Ti质粒被用来进行植物细胞的转化，而且一直沿用至今。Bimdock等首次采用根癌农杆菌介导的方法进行了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的转化；deGroot 等也利用根癌农杆菌介导的方法成功地实现了丝状真菌的遗传转化。这些开创性的工作将 AMT应用于除了植物以外的其他宿主，并为丝状真菌的遗传转化开辟了一条全新而有效的途径。随着方法的不断完善，根癌农杆菌将在丝状真菌的转化中得到越来越广泛的应用，也为构建真菌T-DNA插入突变体库，克隆致病相关基因，深入研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理，控制黄萎病的发生奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自大丽轮枝菌的致病相关蛋白及其编码基因。本发明提供的致病相关蛋白，命名为VdGRPl(Glutamic acid-Rich Protein 1)， 来自大丽轮枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；幻将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。上述致病相关蛋白的编码基因(命名为VdGRPl)也很属于本发明的保护范围之内。上述致病相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第132-407位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述严格条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。序列1由5 个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的自5’端第132-407位核苷酸为ORF区，编码序列2中所述氨基酸残基序列的蛋白质，将序列2所示的蛋白命名为 VdGRPl JfVdGRPl蛋白的编码基因命名为VdGRPl。扩增上述VdGRPl基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述VdGRPl基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一目的在于提供一个DNA片段，其核苷酸序列是如下a)或b)a)序列表中序列3的第22位至240位所示的序列；b)序列表中序列3所示的序列。含有上述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围；所述重组载体优选是将序列表中序列3所示的片段插入pSUlPH-TN载体的多克隆位点构成的重组载体；所述pSUlPH-TN载体是序列表中序列4所示的片段插入pSULPH-GFP质粒构成的载体。本发明的又一目的在于提供一种培育致病性降低的真菌的方法。本发明提供的方法包括如下步骤降低所述真菌中的上述VdGRPl基因的表达，得到所述致病性降低的真菌。进一步讲，降低所述真菌中的上述VdGRPl基因的表达是通过将序列表中序列3所示的片段导入所述真菌中实现的。更进一步讲，上述序列表中序列3所示的片段可以通过含有上述DNA片段的重组载体导入所述真菌中。上述真菌为含有述VdGRPl基因的菌，具体可为大丽轮枝菌；所述致病性为致黄萎病性。本发明的发明人通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得了致病性减弱的突变菌株vdgrpl。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。本发明的发明人通过TAIL-PCR技术，获得了突变基因。通过基因互补试验，证实是该基因的突变导致了菌株vdgrpl致病性的减弱，说明该基因为真菌致病相关基因。另外，从表型上分析，基因VdGRPl与菌核的发育有一定的关系。Northern杂交证实在菌株从孢子到菌丝的整个发育阶段，基因VdGRPl都有较高的表达，随着培养时间延长成递增之势。基因VdGRPl在菌核期处于低表达水平状态。在液体培养菌液中加入棉花提取液，能提高基因VdGRPl的表达。表明大丽轮枝菌侵染棉花时，该基因可能受棉花诱导，并在致病过程中可能起着一定的作用。另外，基因VdGRPl的表达还受到环境胁迫如缺糖以及高渗胁迫如高浓度NaCl、高浓度甘露醇的诱导。说明基因VdGRPl在大丽轮枝菌应对环境胁迫的过程中有着一定的功能。为了通过基因沉默技术进一步验证基因VdGRPl的功能，本发明的发明人又构建了基因VdGRPl的RNAi敲除载体。通过农杆菌介导的转化，本发明的发明人获得了三株转基因菌株。Northern杂交证实，三个RNAi敲除菌株中VdGRPl的表达下调。致病性鉴定结果表明，与野生型相比，致病性减弱。说明能够通过基因沉默技术获得大丽轮枝菌致病性减弱的突变体。同时也进一步说明了该基因为真菌致病相关基因。
图1、突变菌株vdgrpl与野生型菌株V592生长性状的比较图示。图2、突变菌株vdgrpl与野生型菌株V592致病性比较图示。图3、突变菌株vdgrpl的southern杂交图示。图4、不同的生长时期，VdGRPl基因表达水平的northern杂交检测。图5、不同的环境胁迫及高渗胁迫下，VdGRPl基因表达水平的northern杂交检测。图6、菌核期及棉花汁液诱导条件下，VdGRPl基因表达水平的northern杂交检测。图7、菌丝及孢子中VdGRPl基因表达水平的northern杂交检测。图8、突变菌株vdgrpl经过互补试验获得的互补菌株vdgrpl/VdGRPl的致病性鉴定图示。图1、图2和图8中的592是构建突变体库所用的野生型菌株，vdgrpl是从突变体库中筛选到的致病性减弱的突变菌株，vdgrpl/VdGRPl是把VdGRPl基因的ORF序列构建到组成型表达的启动子下，转入突变体vdgrpl，通过菌落生长性状和恢复致病性鉴定的互补菌株，Control是对照。图9、野生型菌株V592与VdGRPl RNAi敲除菌株中VdGRPl基因表达水平的 northern杂交检测图示。图10、野生型菌株V592与VdGRPl RNAi敲除菌株的致病性鉴定图示。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、大丽轮枝菌突变体库的构建大丽轮枝菌菌株V592 (菌株V592是采自新疆棉花田，记载该材料的文献是棉花植株内黄萎病菌致病类型的快速检测.新疆农业科学2010，47 (4) :827-831，公众可从中科院微生物所获得)在PDA平板上25°C培养后将孢子接种于查氏液体培养基Qg NaN03,lg KH2P04, Ig MgSO4. 7H20, Ig KCUmg FeSO4. 7H20 和 30g 蔗糖/L)中振荡培养 5-8 天直至孢子浓度为1. OX 107mL，孢子培养液用4层无菌纱布过滤以除去菌丝。4000rpm离心IOmin得到孢子并用诱导培养基加AS (乙酞丁香酮)200mM将孢子浓度调节到1.0Χ106_7!Λ。将农杆菌(该农杆菌含PLL16质粒，PLL16质粒由美国普渡大学徐金荣教授馈赠， 现保存于本发明人实验室，需要通过美国普渡大学徐金荣教授授权获得)在30ml基本培养基(MM)〔含有 Kan 50mg/L, Rif 25mg/L)中培养 48h，4000rpm，离心 lOmin，沉淀用诱导培养基(IM)洗两次，重悬农杆菌至OD值为0. 2-0. 3并加200mM AS (乙酞丁香酮)、40mM MES以及Kan (50mg/L) ,28°C, 200rpm振荡培养6h。然后吸取100 μ L上述培养物与100 μ 1 的分生孢子悬浮液混合，泼于放在共培养基上的孔径为45 μ m的47mm直径的纤维素膜上， 在培养36h。用2mL基本培养基洗膜，收获真菌和细菌培养物，然后取200两涂于含 ΙΟΟμ g/mL氯嘧磺隆(Cholorimuron)的选择培养基平板上，抑制农杆菌的生长，挑取单个转化子转至选择培养基平板进行二次筛选并保存转化子。实施例2、突变体vdgrpl的获得通过菌株侵染水培棉花来鉴定突变体的致病性，从而筛选出致病性改变的突变体。挑选饱满的棉种(新陆早-16，购于新疆石河子大学农学院)，用15%的次氯酸钠浸泡 30min后，无菌水冲洗2-3遍，再用无菌水浸泡催芽过夜后平铺在培养盒中保湿，待芽长至 3cm，种于发芽盒中。在泡沫板上打取直径2cm、间距3cm的孔洞，用海绵条缠绕发芽棉子的根芽交界处，塞入泡沫板的孔洞中。将泡沫板置于盛满清水的塑料盒(高8-lOcm)上，于 25°C，光照16h，黑暗下培养他。待真叶长出时将清水换成1/3的MS培养液，每周更换一次培养液，1片真叶展平时接种。将_80°C保存的菌株经PDA平板活化3-4d，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，250C，220rpm摇培5d，过滤，滤液5000g离心5min，，清水稀释孢子，血球计数板计数，将浓度调至IX IO7个孢子/ml。将调好浓度的孢子悬浮液加入空塑料盒中， 棉苗浸根40min后接种。之后用1/3的MS培养液25°C光照16h，黑暗下继续培养棉苗8h。 每盒中种12株苗，每个品种3个重复，对照棉苗用清水浸泡40min。通过上述方法，本发明的发明人获得了菌核的产生及致病性均减弱的突变菌株 vdgrpl (图 1、图 2)。实施例3、突变基因的获得1)、Southern杂交确定突变体T-DNA插入拷贝数(图3)A、基因组DNA的提取方法如下在液体查氏培养基中，200rpm振荡培养菌丝。震荡培养的液体IOOOOrpm离心IOmin后用液氮研磨。加入500 μ L的提取缓冲液(IOOmmol/ LTris-HCl, PH8. 0,100mmol/L EDTA, 250mmol/L NaCl)，涡流使菌粉与提取缓冲液充分混合，然后加入50 μ L 20% SDS，轻摇Eppendorf管，使混合物混合均勻，置于37°C水浴lh，取出并加入75L 5mol/L NaCl，轻轻混勻，再加入65 μ L 10% CTAB及0. 75mol/LNaCl溶液，轻轻混勻，然后放入65°C水中温育20min，取出后加入700yL氯仿/异戊醇04 1)溶液， 混勻，12000rpm离心12min，取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，混勻后放入_20°C冰箱中至少30min，取出后在IOOOOrpm离心2min，弃上清，用70%酒精洗盐2次，干燥后，加入 40 μ L TE 溶解。B、提取的DNA分别用EcoR I和KpnI酶切酶切体系
权利要求
1.一种蛋白，是如下1)或幻的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4) 中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第132-407位；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下与1)或幻的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.一个DNA片段，其核苷酸序列是如下a)或b)a)序列表中序列3的第22位至240位所示的序列；b)序列表中序列3所示的序列。
6.含有权利要求5所述DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体是将序列表中序列3所示的片段插入pSUlPH-TN载体的多克隆位点构成的重组载体；所述 pSUlPH-TN载体是序列表中序列4所示的片段插入pSULPH-GFP质粒构成的载体。
7.一种培育致病性降低的真菌的方法，包括如下步骤降低所述真菌中的权利要求2 或3所述基因的表达，得到所述致病性降低的真菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于降低所述真菌中的权利要求2或3所述基因的表达是通过将序列表中序列3所示的片段导入所述真菌中实现的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述序列表中序列3所示的片段通过权利要求6所述的重组载体导入所述真菌中的。
10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述真菌为含有权利要求2或 3所述基因的菌，优选是大丽轮枝菌；所述致病性为致黄萎病性。
全文摘要
本发明公开了一种来自大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdGRP1及其编码基因。所述致病相关蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的发明人通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得了致病性减弱的突变菌株vdgrp1。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。本发明的发明人通过TAIL-PCR技术，获得了引起突变表型的基因。通过基因互补试验，证实是该基因VdGRP1的突变导致了菌株vdgrp1致病性的减弱，说明该基因VdGRP1为真菌致病相关基因。
文档编号C12R1/91GK102212121SQ20111009042
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月11日 优先权日2010年4月21日
发明者周邦军, 郭惠珊 申请人:中国科学院微生物研究所