利用荧光定量pcr技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于棉花育种领域，涉及鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法，具体地 说，涉及利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的影响陆地棉品种最严重的病害之一，由于缺乏 有效的化学防治药剂，只有依赖棉花品种抗性的提高来减少产量损失，因此棉花品种抗黄 萎病鉴定是培育抗黄萎病品种的必要手段。目前用于棉花品种黄萎病抗性鉴定方法主要有 两大类，一类是田间鉴定方法，如自然病圃鉴定和人工病圃鉴定；一类是室内苗期鉴定方 法，如裸根蘸菌法、针刺接菌法、纸钵撕底法、无底塑钵菌液浇根法和毒素鉴定。
[0003] 田间鉴定方法中人工病圃鉴定被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗病鉴定方 法，在抗病育种过程中应用最为普遍，但此鉴定方法受鉴定病圃限制，并易受气候条件的影 响，一般需要2-3年重复鉴定才能出结果，历时太长。温室病圃鉴定也需要半年左右的时间， 鉴定时间长，不能做到早期诊断。
[0004] 室内苗期鉴定方法目前应用最多的主要有纸钵撕底法、无底塑钵菌液浇根法等， 但由于这些方法伤根程度很难做到统一，致使实验产生误差（简桂良，2001.简桂良，孙文 姬，马存.棉花黄萎病抗性鉴定新方法一无底塑钵菌液浇根法[J].棉花学报，2001，13(2): 67-69.)。而针刺接菌法使黄萎病菌强制侵入到棉株维管束系统，违背了病菌在自然条件下 的侵染规律，使棉花自身的部分防卫系统失效，不能客观反映鉴定材料的抗性(史认辉.棉 花抗黄萎病鉴定技术研究.华中农业大学硕士学位论文，2010))。毒素鉴定法，需要提取粗 毒素，较繁琐，且与上述方法相比，棉苗往往表现为发病偏重(杜威世，2003，杜威世.棉花黄 萎病抗性遗传及分子标记研究.[硕士学位论文〕.保定:河北农业大学图书馆，2003)。
[0005] 郭宝生等（郭宝生，王凯辉，刘素恩，赵存鹏，耿军义，张香云，华金平.陆地棉抗黄 萎病种质创新与抗病基因挖掘.棉花学报，2014，26(3): 252-259.)研究表明，陆地棉植株受 到黄萎病菌侵染后，植株内部会形成物理障碍或生化障碍来遏制棉花黄萎病菌在体内扩 展，但是由于不同品种的抗病基因表达调控水平不一，从而出现抗病差异。与黄萎病抗性相 关基因主要有植物抗毒素合成相关基因、植株组织结构防御蛋白相关基因等。这种黄萎病 菌侵染下不同陆地棉品种抗病相关基因的表达差异可以通过荧光定量PCR技术进行检测 ((郭宝生，师恭曜，等，黄萎病菌侵染下棉花Dirigent-like蛋白基因表达差异分析.中国农 业科学，2014,47(22) :4349-4359.)。荧光定量PCR技术（Bustin S A，Benes V，Nolan T， Pfaffl M ff.Quantitative real-time RT-PCR-A perspective.Journal of Molecular Endocrinology，2005，34:597-601.)是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物 进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度 也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监 测产物量的变化。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了避免上述田间和室内苗期鉴定方法的缺陷，提供利用荧光 定量PCR技术鉴定陆地棉品种黄萎病抗性的基因及方法。本发明是在棉花品种幼苗6叶期， 利用与陆地棉受黄萎病菌侵染下2个抗性相关关键基因，即植物抗毒素合成相关基因类一 多向耐毒性基因和植株组织结构防御蛋白相关基因---lateral organ boundaries domain family protein转录子焚光定量的表达差异鉴定出陆地棉品种是否为抗黄萎病品 种。
[0007] 陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因，其包括序列表中SEQ ID NO: 1所示的多向耐 毒性基因和SEQ ID N0:2所示的转录子基因。
[0008]陆地棉品种抗黄委病鉴定相关基因的PCR扩增特异引物，多向耐毒性基因的特异 引物上游序列见SEQ ID N0:3,下游序列见SEQ ID N0:4;转录子基因特异引物上游序列见 SEQIDN0:5，下游序列见SEQIDN0:6。
[0009] 利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，该方法包括如下步骤:① 待测棉花品种营养钵培养室育苗;②黄萎病病菌培养;③病菌浸根接种:用步骤②培养的病 菌菌液对步骤①育成的幼苗进行浸根接种;④总RNA提取:摘取步骤③中被病菌侵染过的幼 苗嫩片，提取叶片总RNA;⑤cDNA合成;⑥与陆地棉抗性相关关键基因即SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示基因，以及内参基因 GhACTIN14的荧光定量PCR特异引物的合成；⑦荧光定量 PCR检测;⑧结果分析。
[0010] 步骤①所述的待测棉花品种营养钵培养室育苗采用塑料周转箱内纸质营养钵培 养室育苗，培养条件:平均温度28 °C左右，每天保持光照14个小时。
[0011] 步骤③所述的病菌浸根接种，是指当待测棉花品种幼苗长至6叶期开始进行病菌 浸根接种，病菌孢子浓度为1〇6_1〇 8个/ml的孢子悬浮液。
[0012] 步骤④所述的总RNA提取，提取的是病菌接种侵染Oh和48h时的幼苗嫩片中的总 RNA；
[0013] 步骤⑤所述的cDNA合成反应体系为步骤④中提取的总RNA 2ul，Anchored oligo (dT)18 primer(0.5ug/ul)lul,2 X TS Reaction Mix lOul,Transcript RT/R1 Enzyme Mix lul，gDNA Remover lul,Rnase-free water 5ul〇
[0014] 步骤⑥所述的与陆地棉抗性相关关键基因和内参基因 GhACTIN14的的荧光定量 PCR特异引物的合成，合成引物GC含量50%，Tm在60°C_62°C，长度18-22个核苷酸，扩增片段 80-150bp;合成的多向耐毒性基因特异引物序列：上游序列AAGGCTGACGATAGGAGAAATG (SEQ ID N0:3)，下游序列GAAAGGTGGTGGAGCTATCTAAG(SEQ ID N0:4);合成的lateral organ boundaries domain family protein转录子基因特异引物序列：上游序列 AGCTATTCAAACCCACCATGT(SEQIDN0:5)，下游序列GGCTCTTCTGGTGGGAAATAG(SEQIDN0 : 6);内参基因 GhACTINl4特异引物序列：上游序列CTTATGTTGCCCTGGACTATGA(SEQ ID N0:7)， 下游序列CGGAATCTCTCAGCTCCAATAG(SEQ ID N0:8)。
[0015] 步骤⑦所述的荧光定量PCR检测，反应体系为SYBR?Premix Ex Taq TM 10ul， 步骤⑥中合成的相应被检测基因的特异上游引物（lOpm/ul )0.4ul，下游引物（lOpm/ul) 0.4ul，R0X Reference Dye 0.4ul，灭菌蒸馈水7.8ul，cDNA SulaRT-PCR反应程序：预变性 95 °C，30s; 95 °C，5s，60 °C，34s，40 个循环。
[0016] 步骤⑧结果分析所依据的检测标准是，利用荧光定量PCR数据采用相对定量 法，在接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值大于2和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值小于1的判定为抗病品种;在 接种黄萎病菌后48h多向耐毒性基因相对表达量倍值小于1和lateral organ boundaries domain family protein转录子相对表达量倍值大于2的判定为感病品种。
[0017] 本发明的有益技术效果：
[0018] (1)早期诊断。在陆地棉幼苗6叶期，即棉花播种育苗20天内就可鉴定出其抗性。
[0019] (2)可靠、准确。本发明从基因表达水平揭示陆地棉品种的抗病性，可靠性高；同时 针对2个基因进行检测，提高了鉴定准确度，鉴定结果准确度达到100 %。
[0020] (3)简便易行。本发明所使用的关键基因荧光定量PCR特异引物由专业公司合成， 所用仪器设备为一般的分子生物学实验室都具备，所用试剂亦为通用试剂，无需单独配制， 按照本发明操作步骤，一般科研人员都能进行陆地棉品种的抗性鉴定。
【附图说明】
[0021] 图1是育苗用的纸质营养钵和塑料周转箱示意图；图中，①为塑料箱;②为营养钵。 [0022]图2是抗病品种冀79和感病种质TM-1受黄萎病菌侵染0h_96h时的多向耐毒性基因 荧光定量相对表达量。
[0023] 图3是抗病品种冀79和感病种质TM-1受黄萎病菌侵染0h_96h时的lateral organ boundaries domain family protein转录子基因焚光定量相对表达量。
[0024] 图4是冀228棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的焚光定量相对表达量。
[0025] 图5是冀122棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ boundaries domain family protein的焚光定量相对表达量。
[0026] 图6是冀1096棉花品种受黄萎病菌侵染0h、96h时多向耐毒蛋白基因及lateral organ bou