鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物，以及应用该特异性引物鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的方法，是使用权利要求1所述微卫星标记特异性引物进行PCR扩增，将扩增结果进行电泳来进行鉴别的。本发明首次筛选到30个微卫星标记引物，通过基因扩增及电泳分析，将新疆各彩色棉的特异、特征引物及组合引物指纹图谱与数字信息相结合，提高了各品种与其他品种的鉴别能力，可有效为育种者提供品种知识产权及权益的保护。
【专利说明】鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用。
【背景技术】
[0002]目前对棉花品种的真实性纯度的鉴定依然采用品种形态特征鉴定，精度不高，速度慢，对操作人员经验等要求高，不能适应育种工作迅速发展和种子生产经营及种植需要。目前，0嫩指纹技术发展日新月异，研究较多的有1^1^、狀?0、4?1^、551? (Simple SequenceRepeat，微卫星DNA又叫简单重复序列)等分子标记技术，其中SSR为共显性分子标记，具有多态性丰富和PCR结果重现性高等优点。与其它遗传标记相比，SSR具有可直接检测DNA分子结构变异、反映研究材料本质差异、灵敏度高、稳定性好、操作简单等优点，在遗传多样性分析、种质鉴定、DNA指纹图谱构建、基因定位和分子标记育种等研究领域应用广泛。
[0003]分子标记鉴定技术已经成功构建了油菜、玉米、甘蔗、水稻、小麦等作物品种的DNA指纹图谱。棉花指纹图谱构建的研究已有一些报道，但有关于新疆彩色棉品种指纹图谱的构建未见报道。由于用于分子标记的引物目前还在不断开发中且分子标记引物扩增到的等位基因数目会随着建库材料的增加而增加，在有限的建库材料中进行指纹分析可能会引起引物多态性的降低，会出现一些特异的等位基因位点，但随着建库材料的增多在进行指纹分析时引物多态性可能会增高，特异或特征的基因位点就更加唯一。
[0004]特异引物是指:具有特异的等位基因位点，是该品种具有的唯一特有的等位基因位点，仅用这一对特异引物就可以直接、明显区分本品种与其它品种。特征引物是指:某个品种I对引物的指纹信息就可以区分该品种与其它品种。
[0005]本发明利用SSR分子标记技术，对我国新疆自治区截至到2012年审定的23个彩色棉新品种进行DNA指纹图谱分析，利用NTSYS-pcV2.10软件，采用Jaccard系数计算23个新彩棉品种遗传相似系数，遗传相似系数变化范围是0.3781-0.9298，平均为0.5511，表明，23个新彩棉品种间存在着丰富的遗传多样性，且各材料经严格自交纯化。利用各材料的特异引物或特征引物或组合引物，以及18对核心引物的数字指纹代码、可简便、快速、准确地鉴别品种的纯度及真实性，可为种子管理及经营单位提供快速、准确、科学的鉴定方法，为育种者保护了品种的知识产权和提供了育种理论指导。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的微卫星标记特异性引物，应用该特异性引物能准确的对新疆彩色棉系列I至23号品种进行区分。
[0007]本发明提供了鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的微卫星标记特异性引物，其特征在于:
鉴别新彩棉I号品种的微卫星标记组合引物为:BNL1317、CGR6410、DPL0296 ；鉴别新彩棉2号品种的微卫星标记组合引物为:DPL0528、NAU3468 ；
鉴别新彩棉3号品种的微卫星标记特异性引物为:CGR6932、NAU2265 ；
鉴别新彩棉4号品种的微卫星标记特异性引物为:DPL0376、SHIN0376、NAU2437 ; 鉴别新彩棉5号品种的微卫星标记组合引物为:CGR6932、TMB2295 ；
鉴别新彩棉6号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1233 ；
鉴别新彩棉7号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1362、NAU3995、DPL0917 ；
鉴别新彩棉8号品种的微卫星标记特异性引物为:MGHES44、BNL3261、BNL3255 ；
鉴别新彩棉9号品种的微卫星标记特异性引物为:MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042 ；
鉴别新彩棉10号品种的微卫星标记特异性引物为:TMB2295 ；
鉴别新彩棉11号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1125 ；
鉴别新彩棉12号 品种的微卫星标记组合引物为:BNL1317、TMB2295、BNL1421 ；
鉴别新彩棉13号品种的微卫星标记组合引物为:TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932 ；
鉴别新彩棉14号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3110、NAU3995 ；
鉴别新彩棉15号品种的微卫星标记组合引物为:TMB2295、NAU3110 ；
鉴别新彩棉16号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3995、CGR6410 ；
鉴别新彩棉17号品种的微卫星标记组合引物为:DPL0296、BNL1317 ；
鉴别新彩棉18号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3468 ；
鉴别新彩棉19号品种的微卫星标记特异性引物为:BNL1421 ；
鉴别新彩棉20号品种的微卫星标记特异性引物为:HAU1001 ；
鉴别新彩棉21号品种的微卫星标记组合引物为:GH132、MGHES44、TMB2295 ；
鉴别新彩棉22号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNLl 19、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296 ；
鉴别新彩棉23号品种的微卫星标记组合引物为:NAU934、NAU2437。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的方法，是使用权利要求1所述微卫星标记特异性引物进行PCR扩增，将扩增结果进行电泳来进行鉴别的。
[0009]进一步地，所述PCR扩增的条件为:
94°C3min ；
94 °C50sec,
(53 ~63) °C 45sec,
72 °Clmin, 35 个循环；
72 °CIOmin ；
4 °CIOmin0
[0010]进一步地，所述鉴别分为应用组合引物和应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别两种；
其中，所述应用组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是:按照组合引物中的先后顺序对新疆彩色棉系列I至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，最终鉴别得到相对应的新疆彩色棉系列品种；
所述应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是:应用特异性引物或特征引物对新疆彩色棉系列I至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，找出电泳条带与其他电泳条带位置不同的，即为相对应的新疆彩色棉品种。
[0011]本发明的第三个目的是提供新疆彩色棉系列I至23号品种的18对核心引物的十进制数字指纹代码，其中，
所述 18 对核心引物为:NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44,
所述新疆彩色棉系列I至23号品种在所述18对核心引物下的十进制数字指纹代码分别依次为:
【权利要求】
1.鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的微卫星标记特异性引物，其特征在于: 鉴别新彩棉1号品种的微卫星标记组合引物为:BNL1317、CGR6410、DPL0296 ； 鉴别新彩棉2号品种的微卫星标记组合引物为:DPL0528、NAU3468 ； 鉴别新彩棉3号品种的微卫星标记特异性引物为:CGR6932、NAU2265 ； 鉴别新彩棉4号品种的微卫星标记特异性引物为:DPL0376、SHIN0376、NAU2437 ; 鉴别新彩棉5号品种的微卫星标记组合引物为:CGR6932、TMB2295 ； 鉴别新彩棉6号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1233 ； 鉴别新彩棉7号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1362、NAU3995、DPL0917 ； 鉴别新彩棉8号品种的微卫星标记特异性引物为:MGHES44、BNL3261、BNL3255 ； 鉴别新彩棉9号品种的微卫星标记特异性引物为:MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042 ； 鉴别新彩棉10号品种的微卫星标记特异性引物为:TMB2295 ； 鉴别新彩棉11号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU1125 ； 鉴别新彩棉12号品种的微卫星标记组合引物为:BNL1317、TMB2295、BNL1421 ； 鉴别新彩棉13号品种的微卫星标记组合引物为:TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932 ； 鉴别新彩棉14号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3110、NAU3995 ； 鉴别新彩棉15号品种的微卫星标记组合引物为:TMB2295、NAU3110 ； 鉴别新彩棉16号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3995、CGR6410 ； 鉴别新彩棉17号品种的微卫星标记组合引物为:DPL0296、BNL1317 ； 鉴别新彩棉18号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3468 ； 鉴别新彩棉19号品种的微卫星标记特异性引物为:BNL1421 ； 鉴别新彩棉20号品种的微卫星标记特异性引物为:HAU1001 ； 鉴别新彩棉21号品种的微卫星标记组合引物为:GH132、MGHES44、TMB2295 ； 鉴别新彩棉22号品种的微卫星标记特异性引物为:NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNLl 19、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296 ； 鉴别新彩棉23号品种的微卫星标记组合引物为:NAU934、NAU2437。
2.一种鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种的方法，其特征在于:是使用权利要求1所述微卫星标记特异性引物进行PCR扩增，将扩增结果进行电泳来进行鉴别的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增的条件为: 94°C3min ； 94 °C50sec, (53 ~63) °C 45sec, 72 °Clmin, 35 个循环； 72 °C10min ； 4 °C10min0
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述鉴别分为应用组合引物和应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别两种； 其中，所述应用组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是:按照组合引物中的先后顺序对新疆彩色棉系列I至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，最终鉴别得到相对应的新疆彩色棉系列品种； 所述应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是:应用特异性引物或特征引物对新疆彩色棉系列I至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，找出电泳条带与其他电泳条带位置不同的，即为相对应的新疆彩色棉品种。
5.新疆彩色棉系列I至23号品种的18对核心引物的十进制数字指纹代码，其特征在于: 所述 18 对核心引物为:NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44, 所述新疆彩色棉系列I至23号品种在所述18对核心引物下的十进制数字指纹代码分别依次为:
6.权利要求1所述的微卫星标记特异性引物在鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种中的应用。
7.权利要求5所述的十进制数字指纹代码在鉴别新疆彩色棉系列I至23号品种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103614456SQ201310391563
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】尤春源, 聂新辉, 林忠旭, 秦江鸿, 赵图强, 雷江荣, 冯国礼, 吕军 申请人:石河子农业科技开发研究中心