大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌的突变体菌株，尤其涉及大丽轮枝菌的硫胺素转运蛋白基 因敲除突变体菌株，本发明还涉及所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株的 构建方法及其在研宄大丽轮枝菌的致病机理中的应用，属于大丽轮枝菌突变体菌株的构建 及应用领域。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)是一种土传维管束真菌病害，侵染范围非 常广泛，能侵染包括木本植物、草本植物和藤本植物在内的两百多种经济作物，给中国乃至 世界造成极大的经济损失（HillocksI，1992)。而且其后期产生的微菌核可以在极其恶劣 的环境下存活数年甚至更长的时间（Klosterman et al，2011)，用药剂难于防治，成为作物 生产发展的瓶颈，严重危害各国的农业生产（Fradin et al，2006)。鉴于其严重的危害性， 探宄大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研宄的热点（Luo et al，2014)，如何提高寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病性是亟待需要解决的问题。
[0003] 迄今为止，有关大丽轮枝菌致病机理仍停尚留在初步探索阶段。Chu jun等人分 析比较在缺氮的环境条件下，大丽轮枝菌入侵程中分泌蛋白主要参与寄主植物细胞壁降 解、活性氧应答，还包括一些效应因子、新陈代谢蛋白因子等，或许这些分泌蛋白参与了大 丽轮枝菌的渗透侵染寄主植物的根部，达到入侵的目的（Hogenhout et al, 2009 ;Chu et al, 2014)。然而大丽轮枝菌定殖在寄主植物体内，如何适应寄主体内的细胞内环境和如何 吸收寄主细胞内营养成分至今还没报道。因此探索大丽轮枝致病机制过程中入侵繁殖机制 显得更加重要，寻找到参与吸收过程中关键的蛋白因子，能够为采用"反向遗传学"这一技 术手段培育抗病的新材料品种奠定重要的基础。
[0004] 硫胺素转运蛋白（Thiamine transporter)是一个质膜蛋白，属于还原型的叶酸转 运蛋白家族，包含膜嵌入底物结合蛋白、两个ATP结合蛋白和一个转运蛋白亚基（Lagarde et al，2004)。主要将外界低浓度的硫胺素转运到生物体内，供机体进行新陈代谢（Dutta et al, 1999 ；Larkin et al, 2012)〇
[0005] 目前有关大丽轮枝菌的硫胺素转运蛋白的研宄未见任何报道。构建一株大丽轮枝 菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株，对于研宄大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的功能， 乃至阐明大丽轮枝菌的致病机理，均有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是构建一株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除 突变体菌株，该突变体菌株在形态学特征、致病力和逆境胁迫适应性等缺陷显著，尤其是对 活性氧压力的敏感性极显著，可作为研宄工具材料应用于研宄大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白 的功能、大丽轮枝菌的致病机理及其活性氧信号传导的代谢机理；
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因 敲除突变体菌株的构建方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先构建硫胺素转运蛋白基因（Thit)的基因敲除质粒，通过同源重组的 方法获得5株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株，其形态学特征、逆境胁迫 适应性等都出现显著缺陷，尤其所获得的Vd Λ thit-2突变体菌株，在形态学特征、致病力 和逆境胁迫适应性等缺陷比其他硫胺素转运蛋白基因的突变体菌株更显著，尤其是对活性 氧压力的敏感性极显著。
[0010] 本发明将获得的大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体VdA thit-2菌株提 交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 10906 ;分类命名为：大丽轮 枝菌Vertivillium dahliae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏时间是2015年6月25日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研宄所。
[0011] 本发明所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株能够作为研宄的工 具材料应用于研宄大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的功能、研宄大丽轮枝菌致病机理以及研宄 大丽轮枝菌活性氧信号传导的代谢机理。
[0012] 本发明还公开了一种所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株的构 建方法，包括以下步骤：（1)构建硫胺素转运蛋白基因的基因敲除质粒；(2)将步骤（1)所 构建的基因敲除质粒转化农杆菌，进行野生型大丽轮枝菌的遗传转化；（3)筛选转化子，鉴 定，即得。
[0013] 其中，步骤（1)所构建的基因敲除质粒为PGKO-Neo-Thit。硫胺素转运蛋白基 因（Thit)的同源重组DNA片段构建采用In-Fusion(Frandsen R.et al·，2012)克隆技 术。本发明用同样的方法还将trpC-P、VdThit、Nos三段基因连接到PCTHyg载体上，构建 PCTHyg-VdThit载体。本发明所述野生型大丽轮枝菌为大丽轮枝菌Vd991菌株。
[0014] 本发明将基因敲除质粒pGKO-Neo-Thit和PCTHyg-VdThit载体转化到农杆菌中， 用于大丽轮枝菌的遗传转化。本发明共挑取到抗遗传霉素的转化子195个，PCR检测结果表 明有5个转化子没有扩增到Thit基因片段，可能是大丽轮枝菌Vd Λ thit缺陷突变体菌株。 本发明对上述5个转化子进行三代继代培养后再进行PCR验证，发现在野生型的菌株中能 扩增到Thit基因，不能扩增到Neo基因；而在5个Vd Δ thit转化菌株中没有扩增到Thit 基因，却可以扩增到Neo基因。以上结果表明，本发明用遗传霉素基因的表达盒取代VdThit 基因的0RF，获得了 5个大丽轮枝菌Vd △ thit缺陷突变体菌株，突变体菌株具有遗传霉素抗 性。经PCR验证，本发明还成功获得4个Vd Λ thit缺陷突变体菌株的回补转化菌株，都能 克隆到硫胺素转运蛋白基因和潮霉素基因片段。
[0015] 本发明随机挑选2个VdA thit缺陷突变体菌株进行形态学分析，结果表明，在 不同碳源培养基上培养的2个Vd Λ thit突变体菌株的菌落直径都显著低于野生型以及 Vd Λ thit突变体的回补转化菌株，而且生长速率也显著低于野生型以及Vd Λ thit突变体 的回补转化菌株，而小种Vd Λ thit-2的生长速率缺陷更加显著，表明Vd Λ thit突变体菌株 生长能力出现缺陷。
[0016] 产孢量和孢子萌发率测定结果表明，2个VdAthit突变体菌株的孢子产量显 著低于野生型及VdA thit突变体的回补转化菌株；孢子的萌发率也明显降低，而小种 Vd Λ thit-2的产孢量和孢子萌发率的缺陷更加显著，表明VdAthit突变体菌株表现出生 殖能力缺陷。
[0017] VdAthit缺陷突变体的致病力实验结果表明，其致病力与野生型相比显著降低； 而VdA thit-2突变体小种接种的本生烟仅有一到两片真叶出现感病症状。对感病本生烟 植株根基部往上Icm处茎段的大丽轮枝菌真菌生物量的测定结果表明，接种Vd Λ thit突变 体菌株的本生烟植株中大丽轮枝菌真菌生物量显著低于接种野生型菌株及Vd Δ thit突变 体的回补转化菌株的本生烟植株，而VdA thit-2突变体小种接种的本生烟的真菌生物量 更低。
[0018] 野生型菌株及VdA thit突变体的回补转化菌株对UV照射的逆境胁迫表现出一 定的适应性，而Vd Λ thit突变体菌株对UV照射的逆境胁迫能力降低，对紫外照射非常敏 感，经过UV照射的Vd Λ thit突变体菌株在UV照射5s后孢子存活率都在1 %以下，尤其 VdA thit-2突变体小种对紫外照射的敏感性更强。
[0019] 野生型菌株及Vd Λ thit突变体的回补转化菌株对活性氧压力不敏感；在IOyg/ mL维生素 k3生长条件下的VdA thit突变体菌株的菌落