直径、生长速率都显著低于0 μ g/ mL维生素 k3生长条件下，表明VdA thit突变体菌株对活性氧压力非常敏感；而所获得 的VdA thit-2突变体小种菌株对活性氧压力极敏感，在10 μ g/mL维生素 k3生长条件 下的菌落直径与生长速率极显著低于野生型和其回补，也显著低于另一个突变体小种 Vd Δ thit_7〇
[0020] 综上，本发明所构建获得的VdAthit突变体菌株的形态学特征、致病力、逆境胁 迫适应性等都出现显著的缺陷；其中，VdAthit-2突变体菌株的形态学特征、致病力、逆境 胁迫的适应性缺陷更显著，对活性氧压力的敏感性极显著，为研宄大丽轮枝菌活性氧信号 传导的代谢机理与致病机制提供了一个不可复制的菌株。
[0021] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0022] 硫胺素转运蛋白目前仅在人类等哺乳动物中对其进行功能分析，在大丽轮枝菌 Vd991菌株中还没有克隆并进行功能分析。本发明利用同源重组的方法获得大丽轮枝菌硫 胺素转运蛋白的敲除突变体，首次从反向遗传学的角度分析其功能，发现突变体的形态特 征、逆境胁迫的适应性都显著降低，尤其是其致病力相比野生型出现显著的降低；首次在大 丽轮枝菌的抗病应用中提供理论和试验基础。本发明所获得的VdA thit-2突变体菌株及 其回补菌株对活性氧压力的敏感性极显著，为研宄其活性氧信号传导的代谢机理与致病机 制提供了一个不可复制的菌株。
【附图说明】
[0023] 图1为用遗传霉素抗性基因表达盒取代大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白，获得其敲除 突变体；其中，A :通过同源重组获得VdAthit敲除突变体的过程；B :获得的VdAthit敲除 突变体的转化子；C :以Thit-J-F/Thit-J-R为引物，PCR检测Vd Λ thit敲除突变体；其中， 1-5 (突变体菌株）电泳通道没有扩增到Thit基因片段，而Wt (野生型菌株）电泳通道扩 增到111行基因片段，]\1是0嫩1^11?51';0:以恥〇^/他〇-1-1?为引物，？0?检测￥(1八让行 敲除突变体；其中，1-5 (突变体菌株）电泳通道扩增到遗传霉素基因片段，而Wt (野生型菌 株）电泳通道没有扩增到遗传霉素基因片段，M是DNA marker ;
[0024] 图2为转化子的PCR检测筛选（A，B);箭头是通过PCR检测获得的可能的Vd Athit 突变体菌株；
[0025] 图3为VdAthit突变体的回补的获得；其中，A :以Thit-J-F/Thit-J-R为引物， PCR检测Vd Athit突变体回补；1-4 (回补转化菌株）电泳通道和Wt (野生型菌株）电泳 通道都扩增到Thit基因片段，M是DNA marker ;B:以Hyg-J-F/Hyg-J-R为引物，PCR检 测VdA thit敲除突变体回补；1-4电泳通道（回补）中获得扩增到的潮霉素基因片段，而 Wt (野生型菌株）电泳通道没有扩增到，M是DNA marker ;
[0026] 图4为Vd Δ thit突变体和野生型菌株的形态学表型特征；其中，Vd Δ thit突变体 相比较野生型在不同碳源上（自上而下依次是蔗糖、果胶质、淀粉、半乳糖、木糖）的菌落直 径的测量生长表型；
[0027] 图5为Vd Δ thit突变体和野生型菌株的产孢量（A)和孢子萌发率（B)分析；
[0028] 图6为VdAthit突变体和野生型菌株侵染本生烟实验；其中，A :蘸根法接种 VdAthit突变体和野生型菌株的本生烟病程曲线；B :本生烟植株被侵染12天以后，25ng 的本生烟DNA中的大丽轮枝菌DNA的实时定量分析；
[0029] 图7为VdAthit突变体菌株和野生型菌株在逆境胁迫的生长表型；其中，A :紫外 照射；B、C :活性氧压力。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0031] 1、材料
[0032] 菌株和质粒：大丽轮枝菌Vd991 (中国农业科学院植物保护研宄所，简桂良研宄员 惠赠），根癌农杆菌AGL1、质粒pGK02、PCTHyg、pUC-Neo、pCAM-Neo (中国农业科学院农产品 加工研宄所，戴小楓研宄员惠赠）。
[0033] 培养基：LB用于大肠杆菌培养，YEB用于农杆菌液体培养，CM、PDA、Czapek培养 基用于大_轮枝菌的培养。MM 和 IM(Hooykaas P，Roobol C，Schilperoort R. Regulation of the transfer of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Microbiology，1979， 110(1) :99-109.)用于转化农杆菌的培养。
[0034] 实施例1大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体的构建
[0035] 1、实验方法
[0036] I. 1基因敲除质粒pGK〇-Ne〇-Thit的构建
[0037] Thit 基因的同源重组 DNA 片段构建米用 In-Fusion (Frandsen R.，Frandsen Mj Giese H. Targeted gene replacement in fungal pathogens via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[M]//Plant Fungal Pathogens. Humana ?1^%，2012:17-45.)克隆技术。以质粒pUC-Neo为模板，以Neo-F/R为引物（引物序列 见表1)，扩增长度为2. 6kb的遗传霉素抗性基因盒。以大丽轮枝菌Vd991基因组为模 板，分别以Thit-5F/5R和Thit-3F/3R为引物（引物序列见表1)，引物Thit-5R/3F 5' 端的16bp含有与Neo-F/R互为反向回补的接头，引物Thit-5F/3R 5'端的16bp含有与 pGK02(经EcoR I和Hind III线性化的片段）两段互为反向回补的接头，PCR扩增长度分 别为 0.8kb 和 Ikb 的 Thit 基因（VDAG_01137，Broad Institute) (klosterman S·，Subbarao K. , Kang S. et al. Comparative Genomics Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens. PLoS Pathogens，2011，Vol.7(N0. 7)·)上下游 DNA片段，获得末端含有相应互为反向回补序列的3个PCR产物。通过；[n_Fusi0nK) HD Cloning Kit User Manual (Clontech，USA)将3个片段整合到pGK02载体上，成功构建载 体pGK02-Ne0-Thit (图1A)。同样的方法将trpC-P、VdThit、Nos三段基因连接到PCTHyg 载体上，构建PCTHyg-VdThit载体。
[0038] 表1引物序列
[0039]
[0041] 1. 2农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化
[0042] 电击法将基因敲除质粒pGKO-Neo-Thit和PCTHyg-VdThit载体转化到农杆 菌AGL-I中，用于大丽轮枝菌的遗传转化。转化方法参照Mullins等（18. Mullins E. , Chen X, Romaine P, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transf