专利名称：玉米中与镰孢属穗霉菌抗性相关联的基因座的制作方法
技术领域：
本公开涉及用于增强玉米植株中镰孢属(Fusarium)穗霉菌抗性的组合物和方法。
背景技术：
镰孢属穗霉菌(也称为镰孢属穗腐病)是藤仓赤霉菌(Gibberella fuijkuroi) 复合种，即轮枝镰孢菌(F. verticillioides)、层出镰孢菌(F. proliferatum)和/或胶孢镰孢菌(F. subglutinans.)引起的玉米破坏性病害。它主要存在于美国东南部、欧洲南部、 墨西哥、巴西、阿根廷和南非，并影响籽粒产量和质量。镰孢属穗霉菌也可导致若干种真菌毒素包括伏马菌素(FUM)、串珠镰孢菌素(MON)和/或白僵菌素的污染，这些真菌毒素可引起许多人类和动物疾病。伏马菌素例如与若干种动物中毒症相关，这些动物中毒症包括脑白质软化(Marasas 等人(1988)Onderstepoort J. Vet. Res. 55 197-204 ;Wilson 等人 (1990)American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians :Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colo.，Madison, Wis.，USA)和猪肺水肿(Colvin 等人 (1992)Mycopathologia 117 :79-82)。伏马菌素也是可疑致癌物(Geary 等人(1971) Coord. Chem. Rev. 7 :81 ；Gelderblom 等人(1991) Carcinogenesis 12 :1247-1251 ；Gelderblom 等人(1992) Carcinogenesis 13 :433-437)，并且与人类出生缺陷相关(Missmer 等人(2006) Environ Health perspect 114:237-41)。虽然穗的物理损害和特定环境条件可导致镰孢属穗霉菌出现，但是镰孢属穗霉菌的病原学知之甚少(Nelson等人(1992)Mycopathologia 117:29-36)。当真菌生长条件为最适宜时，现有的栽培技术都不足以将真菌毒素水平减小到被美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration))视为“安全”的水平。已鉴定出镰孢属穗霉菌遗传抗性 (Gendloff 等人(1986)Phytopathology 76 :684-688 ；Holley 等人(1989)Plant Dis. 73 578-580)，并且经过若干次育种尝试，已鉴定出具有可遗传镰孢属穗霉菌抗性的玉米种质。 然而，在玉米自交系中引入该抗性很困难。采用表型选择来鉴别抗性的基因渗入，这种方式不仅耗时而且困难，并且由于镰孢属穗霉菌对环境条件较敏感，所以仅仅基于表型来进行年复一年的抗性正选择已被证明是不可靠的。此外，专门的病害筛查场所的运作高昂，并且植株必须生长成熟才能对抗性或易感性水平进行分类。通过使用与镰孢属穗霉菌抗性相关联的分子标记进行选择具有以下优点使得至少一些选择仅基于子代的遗传组合物进行。此外，镰孢属穗霉菌抗性在植株生命周期非常早的阶段甚至早至种子期就可确定。使用与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的分子标记可获得更高的选择率，这就意味着镰孢属穗霉菌抗性的植物育种可更迅速地开展，从而在相对较短的时间内生成商业上可接受的抗性植株。因此，希望提供用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的组合物和方法。可在育种程序中使用这些植株，以便产生具有镰孢属穗霉菌抗性的高产杂交种。发明概述本发明提供用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的组合物和方法。在一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在这些方法中，获取DNA并检测至少一种标记等位基因的存在。标记等位基因可包括与任何下列标记等位基因连锁并关联的任何标记等位基因位于PHM8211-16的“T”、位于 PHM8711-14 的 “C”、位于 PHM14506-7 的 “T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 “A”、位于 PHM10721-16 的 “A”、位于 PHM15661-21 的 “G”、位于 PHM9362-8 的 “G”、位于 PHMl 147-16 的 “G”、位于 PHMl 1850-3 的 “T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的 “A”、位于 PHM1147-19 的 “T”、位于 PHM5280-41 的 “G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4的“T”。然后选择具有与任何上文列出的标记等位基因连锁并关联的标记等位基因的玉米植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物。在其他实施方案中，标记等位基因可与任何下列标记等位基因连锁位于 PHM8211-16 的 “T”、位于 PHM8711-14 的 “C”、位于 PHM14506-7 的 “T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 “A”、位于 PHM10721-16 的 “A”、位于 PHM15661-21 的 “G”、位于 PHM9362-8 的 “G”、位于 PHMl 147-16 的 “G”、位于 PHMl 1850-3 的 “T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的 “A”、位于 PHMl 147-19 的 “T”、位于 PHM5280-41 的 “G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4 的 “T”，距离为 30cM、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、1、0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2、或0. lcM，或它可以是任何下列的标记等位基因 位于 PHM8211-16 的“T”、位于 PHM8711-14 的“C”、位于 PHM14506-7 的“T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 “A”、位于 PHM10721-16 的 “A”、位于 PHM15661-21 的 “G”、位于 PHM9362-8 的 “G”、位于 PHMl 147-16 的 “G”、位于 PHMl 1850-3 的 “T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的 “A”、位于 PHMl 147-19 的 “T”、位于 PHM5280-41 的 “G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4 的 “T”。在一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物基因组中的标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述检测使用标记基因座的序列、标记基因座的部分序列、或标记基因座的互补序列、或其部分序列作为标记探针。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续的DNA杂交SEQ ID NO :41或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID NO :41具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 47 或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列，并且标记基因座包含至少一个与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因。用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物种质中至少一个与增强的抗性相关联的标记等位基因来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。标记基因座可选自任何下列的标记基因座PHM和SSR标记PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、 PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 标记 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、 PHM1754-20-U、 PHM395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 PHM1072卜9-U、 PHM10721-16-U和PHM15661-21-U ；以及与这些标记连锁的任何其他标记。标记基因座也可存在于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。标记基因座包含至少一个与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因。用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的玉米植物种质的单倍型来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。单倍型在一个或多个标记基因座包含等位基因，其中一个或多个标记基因座存在于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。单倍型可包含至少一个下列等位基因位于PHM8211-16的“T”、位于PHM8711-14 的 “C”、位于 PHM14506-7 的 “T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 “A”、位于 PHM10721-16 的 “A” 和位于 PHM15661-21 的 “G”。单倍型也可由下列构成i.位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T” ；ii.位于 PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A” ；以及iii.位于 PHM10054-14 的“A”、位于 PHM8211-16 的“T”和位于 PHM10721-9 的“A”。
用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株的方法。 在一个方面，获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因与增强的抗性相关联。标记基因座可存在于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。然后可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可选择具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在一个方面，获取具有如下等位基因的第一玉米植物位于ΡΗΜ6 ^9-3的“C”、位于 ΡΗΜ8211-16 的“Τ” 和位于 ΡΗΜ14506-7 的“Τ”;位于 ΡΗΜ10054-14 的“Α” 和位于 ΡΗΜ10721-9的“A”;或位于 PHM10054-14 的“A”、位于 PHM8211-16 的“T” 和位于 PHM10721-9 的“A”。可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的所述等位基因。可选择具有所述等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物基因组中的标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述检测使用标记基因座的序列、标记基因座的部分序列、或标记基因座的互补序列、或其部分序列作为标记探针。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续的DNA杂交SEQ ID NO :48或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID NO 48具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 55 或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :55具有95%同一性的核苷酸序列，并且标记基因座包含至少一个与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因。用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物种质中至少一个与增强的抗性相关联的标记等位基因来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。标记基因座可选自任何下列的标记基因座PHM和SSR标记PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；和 SNP 标记 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U,以及与这些标记连锁的任何其他标记。标记基因座可存在于6号染色体上的区间，所述区间包含并侧接PHM4423和PHM16422。标记基因座包含至少一个与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因。用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物种质中的单倍型来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。单倍型在一个或多个标记基因座包含等位基因， 其中一个或多个标记基因座存在于6号染色体上的区间，所述区间包含并侧接PHM4423和 PHM16422。单倍型与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联，并且可包含至少一个下列等位基因 位于 PHM9362-8 的 “G”、位于 PHM1147-16 的“G”、位于 PHMl 1850-3 的“T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的 “A”、位于 PHMl 147-19 的 “T”、位于 PHM5280-41 的 “G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4 的 “T”。单倍型也可由下列构成i.位于 PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A”;或ii.位于PHM9362-8的“G”和位于PHM13773-6的“A”。用该方法鉴定的玉米植物
也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在一个方面，获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因与增强的抗性相关联。标记基因座可存在于染色体区间，所述染色体区间包含并侧接 PHM4423和PHM16422。可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可选择具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在一个方面，获取具有如下等位基因的第一玉米植物位于PHM4423-4的“T”、位于 PHMl 1850-3 的“T” 和位于 PHM13773-6 的“A” 或位于 PHM9362-8 的“G” 和位于 PHM13773-6 的“A”。可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的所述等位基因。可选择具有所述等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物种质中两个单独的标记基因座 (在本文中称为标记基因座1和标记基因座幻的等位基因来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。标记基因座1位于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506 ；并且标记基因座2位于6号染色体上的区间，所述区间包含并侧接PHM4423和 PHM16422。每个标记基因座包含至少一个与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因。 用该方法鉴定的玉米植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植物种质中的单倍型1和单倍型2来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。单倍型1和单倍型2在一个或多个标记基因座都包含等位基因。就单倍型1而言，标记基因座位于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接 i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506 ；并且就单倍型2而言，标记基因座位于6号染色体上的区间，所述区间包含并侧接 PHM4423和PHM16422。两个单倍型都与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。单倍型1可包含i.位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T，，，ii.位于 PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A” ；或iii.位于 PHM10054-14 的“A”、位于 PHM8211-16 的"T”和位于 PHM10721-9 的“A”;并且单倍型2可包含i.位于 PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A”;或ii.位于PHM9362-8的“G”和位于PHM13773-6的“A”。用该方法鉴定的玉米植物
也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在一个方面，获取具有第一标记基因座的至少一个等位基因和第二标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物。第一标记基因座位于1号染色体上的区间，所述区间包含并侧接 i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506，并且第二标记基因座位于6号染色体上的区间，所述区间包含并侧接PHM4423和 PHM16422。第一标记基因座的至少一个等位基因和第二标记基因座的至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的第一玉米植物的等位基因。可选择具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。在一个方面，获取在1号染色体QTL具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的单倍型并且在6号染色体QTL具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的单倍型的第一玉米植物。可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且可评估杂交所得子代植物的所述等位基因。可选择具有所述等位基因的子代植物作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。用该方法选择的子代植物也是受关注的。附图以及序列表的说明根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表构成本专利申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Research 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical Journal 219 (No. 2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。图IA至C示出了 1号染色体上已测序BAC的物理图谱排列(得自因特网上公开可用的 Maize Genome Browser ；http://www. maizesequence. org)，这些 BAC 装配至丨J 由 PHM6929 (SEQ ID NO 41) ^P PHM1934(SEQ ID NO :47)限定并且包括它们的区域。图中指示了本文所述PHM和SSR标记的位置；指示了 PHM参考序列的SEQ ID N0。图2A和2B示出了 6号染色体上已测序的BAC的物理图谱排列(得自因特网上公开可用的 Maize Genome Browser ；http://www. maizesequence. org),这些 BAC 装配成由 PHM4423 (SEQ ID NO :48)和PHM16422 (SEQ ID NO :55)限定并且包括它们的区域。图中指示了本文所述PHM和SSR标记的位置；指示了 PHM参考序列的SEQ ID N0。图3示出了高抗性品系PHG61和敏感品系1047之间的比较。图4示出了用作镰孢属穗霉菌感染评分指南的FUSERS标度。图5A和5B示出了在包含镰孢属穗霉菌QTLl的基因组区间中进行单个植株的单倍型分型时，设计用于hvader Plus 反应的寡核苷酸和探针的SEQ ID N0。图6A和6B示出了在包含镰孢属穗霉菌QTL6的基因组区间中进行单个植株的单倍型分型时，设计用于hvader Plus 反应的寡核苷酸和探针的SEQ ID N0。图7A、7B和7C示出了分别在包含镰孢属穗霉菌QTL5、QTL7和QTL8的基因组区间中进行单个植株的单倍型分型时，设计用于Evader Plus 反应的寡核苷酸和探针的SEQ ID N0。图8示出了 PHCA5转化数据。图9示出了 PH5IH转化数据。
图10示出了 PH70R转化数据。
图11示出了 PH87H转化数据。
图12示出了 PHFCJ转化数据。
图13示出了 PH890转化数据。
图14示出了 PHBlV转化数据。
图15示出了在杂交中使用转化品系作为亲本与使用非转化品系作为亲本的表型结果。
图16示出了 1号染色体上的标记基因座和非刚性茎杆亚群中键之间的关联。
SEQIDNO1和SEQ ID NO 2是AFLP标记177的引物。
SEQIDNO3和SEQ ID NO 4是AFLP标记T292的引物。
SEQIDNO5和SEQ ID NO 6是AFLP标记D166的引物。
SEQIDNO7和SEQ ID NO :8是AFLP标记Cl 16的引物。
SEQIDNO9 和 SEQ ID NO :10 是 SSR 标记 bnlgl953 的引物。
SEQIDNO11和 SEQ ID NO :12 是 SSR 标记 LGI112958 的引物。
SEQIDNO13和 SEQ ID NO 14 是 SSR 标记 PHI445613 的引物。
SEQIDNO15和 SEQ ID NO 16 是 SSR 标记 PHI364545 的引物。
SEQIDNO17和 SEQ ID NO :18 是 SSR 标记 bnlgl732 的引物。
SEQIDNO19和SEQ ID NO 20是SSR标记umcl762的引物。
SEQIDNO21和 SEQ ID NO 22 是 SSR 标记 bnlgl007 的引物。
SEQIDNO23和 SEQ ID NO 24 是 SSR bnlgl083 的引物。
SEQIDNO25和 SEQ ID NO 26 是 SSR 标记 PHI256546 的引物。
SEQIDNO27和 SEQ ID NO 28 是 SSR bnlgll74 的引物。
SEQIDNO29和 SEQ ID NO 30 是 SSR umcl805 的引物。
SEQIDNO31和 SEQ ID NO 32 是 SSR umcl462 的引物。
SEQIDNO33是PHM8211正向外引物的序列。
SEQIDNO34是PHM8211正向内引物的序列。
SEQIDNO35是PHM8211反向内引物的序列。
SEQIDNO36是PHM8211反向外引物的序列。
SEQIDNO37是PHM1934正向外引物的序列。
SEQIDNO38是PHM1934正向内引物的序列。
SEQIDNO39是PHM1934反向内引物的序列。
SEQIDNO40是PHM1934反向外引物的序列。
SEQIDNO41是PHM6929的参考序列。
SEQIDNO42是PHM8711的参考序列。
SEQIDNO43是PHM8211的参考序列。
SEQIDNO44是PHM14506的参考序列。
SEQIDNO45是PHM17M的参考序列。
SEQIDNO46是PHM3951的参考序列。
SEQIDNO47是PHM1934的参考序列。
SEQIDNO48是PHM4423的参考序列。
SEQIDNO49是PHM9362的参考序列。
SEQIDNO50是PHMl 147的参考序列。
SEQIDNO51是PHMl 1850的参考序列。
SEQIDNO52是PHM9301的参考序列。
SEQIDNO53是PHM5280的参考序列。
SEQIDNO54是PHM13773的参考序列。
SEQIDNO55是PHM16422的参考序列。
SEQIDNO56是PHM9009的参考序列。
SEQIDNO57是PHM3171的参考序列。
SEQIDNO58是PHM3860的参考序列。
SEQIDNO59是PHM7942的参考序列。
SEQIDNO60是PHM678的参考序列。
SEQIDNO61是PHM8358的参考序列。
SEQIDNO62是PHM16415的参考序列。
SEQIDNO63是PHM737的参考序列。
SEQIDNO64是PHM9092的参考序列。
SEQIDNO65是PHM6929-3-U正向引物的序列。
SEQIDNO66是PHM69^-3-U反向引物的序列。
SEQIDNO67是PHM69^-3-U探针1的序列。
SEQIDNO68是PHM69^-3-U探针2的序列。
SEQIDNO69是PHM8711-14-U正向引物的序列。
SEQIDNO70是PHM8711-14-U反向引物的序列。
SEQIDNO71是PHM8711-14-U探针1的序列。
SEQIDNO72是PHM8711-14-U探针2的序列。
SEQIDNO73是PHM8211-16-1正向引物的序列。
SEQIDNO74是PHM8211-16-1反向引物的序列。
SEQIDNO75是PHM8211-16-1探针1的序列。
SEQIDNO76是PHM8211-16-I探针2的序列。
SEQIDNO77是PHM14506-7-U正向引物的序列。
SEQIDNO78是PHM14506-7-U反向引物的序列。
SEQIDNO79是PHM14506-7-U探针1的序列。
SEQIDNO80是PHM14506-7-U探针2的序列。
SEQIDNO81是PHM17M-20-U正向引物的序列。
SEQIDNO82是PHM1754-20-U反向引物的序列。
SEQIDNO83是PHM1754-20-U探针1的序列。
SEQIDNO84是PHM1754-20-U探针2的序列。
SEQIDNO85是PHM3951-25-U正向引物的序列。
SEQIDNO86是PHM3951-25-U反向引物的序列。
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PHM13773-11-U探针1的序列。 PHM13773-11-U探针2的序列。 PHM16422-11-U正向引物的序列。 PHM16422-11-U反向引物的序列。 PHM16422-11-U探针1的序列。 PHM16422-11-U探针2的序列。 PHM9009-13-U正向引物的序列。 PHM9009-13-U反向引物的序列。 PHM9009-13-U探针1的序列。 PHM9009-13-U探针2的序列。 PHM3171-5-U正向引物的序列。 PHM3171-5-U反向引物的序列。 PHM3171-5-U探针1的序列。 PHM3171-5-U探针2的序列。 PHM3860-43-U正向引物的序列。 PHM3860-43-U反向引物的序列。 PHM3860-43-U探针1的序列。 PHM3860-43-U探针2的序列。 PHM7942-12-U正向引物的序列。 PHM7942-12-U反向引物的序列。 PHM7942-12-U探针1的序列。 PHM7942-12-U探针2的序列。 PHM678-22-U正向引物的序列。 PHM678-22-U反向引物的序列。 PHM678-22-U探针1的序列。 PHM678-22-U探针2的序列。 PHM8358-17-U正向引物的序列。 PHM8358-17-U反向引物的序列。 PHM8358-17-U探针1的序列。 PHM8358-17-U探针2的序列。 PHM16415-8-U正向引物的序列。 PHM16415-8-U反向引物的序列。 PHM16415-8-U探针1的序列。 PHM16415-8-U探针2的序列。 PHM737-215-U正向引物的序列。 PHM737-215-U反向引物的序列。 PHM737-215-U探针1的序列。 PHM737-215-U探针2的序列。 PHM9092-11-U正向引物的序列。
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发明详沭
本发明提供了玉米中的等位基因组合物以及鉴定和
菌抗性的玉米植物的方法。提供以下定义以利于理解本发明。术语“等位基因”指在特定基因座处存在的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。“等位基因频率”指等位基因存在于个体、品系、或一组品系中的基因座上的频率 (比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1. 0,0. 5、或0. 0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其他指定组)的计数。
“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应 (PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成连续的DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群(如果BAC进行测序)，或者经由它的BAC指纹与其他BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的Maize Genome Browser找到所述装配。当等位基因与性状关联时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“关联”。“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆载体。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，已经将许多BAC或细菌人工染色体装配成重叠群(重叠的连续的基因片段，或“连续的DNA”)，它们每个包含玉米基因组DNA的较大插入序列。“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次) 或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植物。例如，参见 Ragot,M. ^A (1995)Marker-assisted backcrossing -.a practical example,Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷，第 45-56 页，禾口 Openshaw^Α (1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,Analysis of Molecular Marker Data，第41-43页。初始杂交产生Fl代；于是术语“BC1 ”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。一 cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的的概率。如本文所用，术语“染色体区间”指位于植物单个染色体上的基因组DNA的连续的线性区域。位于单染色体区间上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传因子在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个遗传因子以小于或等于20%或10%的频率进行重组。“染色体”也可称为“连锁群”。在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10% (即在基因图谱上的分离距离不超过IOcM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90%的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10 %或更低，优选约9 %或更低，更优选约8 %或更低，更优选约7 %或更低，更优选约6 %或更低，更优选约5 %或更低，更优选约4 %或更低，更优选约3 %或更低，更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约或更低的重组频率，例如约0. 75%或更低，更优选约0. 5%或更低，更优选约0. 25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于 10% (例如约 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。术语“互补序列”指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列通过碱基配对原则连锁。术语“连续的DNA”指重叠的连续的基因片段。当涉及两个遗传因子间的关系时，例如有助于抗性的遗传因子和邻近的标记，“相弓丨”相连锁指示下述状态其中在抗性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在相引相中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代(例如细胞、种子或植物)的配子融合。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。本文称为“二倍体”的植物具有两组染色体(基因组)。“病害抗性”是植物的一种特征，其中该植物避免了由植物-病原体相互作用造成的病害症状，所述植物-病原体相互作用例如玉米和镰孢属轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和/或胶孢镰孢菌之间的相互作用。即，防止了病原体导致植物病害和相关的病害症状，或者，病原体导致的病害症状被最小化或减弱了。本领域的技术人员将会知道，本文所公开的组合物和方法可与本领域中可用的其他组合物和方法一起被用于保护植物免受病原体攻击。本文称为“双单倍体”的植物通过倍增单倍体染色体组进行生长。认为双单倍体植物是纯合植物。“优良品系”或“优良品种”是由育种以及优异农学特性正选择产生的任何品系。“增强的抗性”是指对特定病原体、广谱病原体、或病原体引起的感染具有增强的抗性水平。对真菌病原体轮枝镰孢菌(Fv)、层出镰孢菌(Fp)和胶孢镰孢菌(Fs)的抗性水平增加，例如造成了“增强”的或提高的真菌抗性。本发明的实施方案将增强或提高植物病原真菌抗性，使得植物对一种或多种真菌病原体的抗性增加，继而增加了对真菌病原体引起的病害的抗性。术语“增强”是指提高、增加、扩大、倍增、提升、上升等。在本文中，本发明的植物描述为由于在本发明基因座存在特异性等位基因而具有对镰孢属轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和胶孢镰孢菌和/或由这些病原体引起的穗霉菌的“增强的抗性”。“外来玉米品种”或“外来玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米品系或品种的种质的玉米的品种或种质。在杂交发生在两个玉米植物或品种的种质之间的情况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和胶孢镰孢菌是玉米中引起镰孢属穗霉菌(或穗腐病) 的真菌病原体。真菌病原体本文还总称为镰孢属。“有利等位基因”是在特定基因座上赋予或有助于农学上所期望的表型，例如增强的镰孢属穗霉菌抗性的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。如本文所用，“真菌抗性”是指与野生型植物的对应性质相比，对真菌病原体增强的抗性或耐受性。效果可以从对真菌病原体的影响的耐受性的略微增加(例如部分抑制)， 直至使得植物不受真菌病原体存在的影响这样的完全抗性。“镰孢属穗霉菌”有时称为镰孢属穗腐病，是由藤仓赤霉菌复合种，即轮枝镰孢菌、 层出镰孢菌和/或胶孢镰孢菌引起的病害。“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。对于每个基因图谱，基因座之间的距离通过它们之间的重组频率量度，并且基因座之间的重组可使用多种分子遗传标记(也称分子标记)检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。 一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。例如，在内源基因图谱上(本文也将Pioneer Hi-Bred称为“PHB”)的IOcM大概等同于在IBM2 2005 neighbors框图谱(在玉米⑶B上可用的高分辨率图谱)上的25_30cM。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的其他基因座。“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性 DNA(RAPD)。“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。“基因组”指总DNA或整套基因，由染色体或染色体组携带。术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。“种质”指个体(例如一个植株)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或
1来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或者植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。称为“单倍体”的植物具有一组染色体(基因组)。“单倍型”是单个染色体上的多个基因座的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指在特定基因座的多态性，如单标记基因座，或者在沿染色体片段的多个基因座上的多态性。术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。“杂种优势群”包含一组基因型，它们当与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer 等人(1998) Corn breeding,第 463-564 页。在 G. F. Sprague 和 J.W.Dudley (编辑)的Corn and corn improvement中)。将自交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人(1990), Theor. Appl. Gen. 80 :833-840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“Iowa Stiff Stalk Synthetic”(BSSS)和“Lancaster” 或“Lancaster Sure Crop” (有时称为NSS或非刚性茎杆)。术语“杂合子”指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。术语“纯合子”指其中相同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。“杂交”或“核酸杂交”指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。“IBM 基因图谱”是指任何下列图谱IBM、IBM2、IBM2neighbors、IBM2 FPC0507、 IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005 neighbors、或 IBM2 2005 neighbors 框。IBM 基因图谱基于B73XMol7种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组自交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了基因和BAC作图基因座的加入以及由于包含来自其他基因图谱的信息带来的图谱精细度的提高。术语“自交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。术语“插入缺失(indel) ”指插入或缺失，其中可将一个品系相对于第二品系称为插入，或者可将第二品系相对于第一品系称为具有缺失。术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并对期望的等位基因进行正选择以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。例如，本文所述的1号染色体基因座和/或6号染色体基因座可渗入到对引起穗霉菌的镰孢属和/或穗霉菌本身无抗性或仅有部分抗性的轮回亲本。于是具有渗入基因或基因座的轮回亲本品系具有对引起穗霉菌的镰孢属和 /或穗霉菌本身的增强的抗性。当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的自交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的自交体亚群，它们与相同祖先来源的其他相似自交体亚群遗传上不同。如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其他基因座(例如镰孢属穗霉菌抗性基因座)关联的程度。分子标记和表型之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可以用期望的限度或范围表达。例如在一些实施方案中，当标记分离距离为小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cM)时，任何标记与任何其他标记连锁(遗传上和物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如介于 10和20cM之间，介于10和30cM之间，或者介于10和40cM之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”如标记基因座和第二基因座显示10 %或更低，优选约9 %或更低，更优选约8 %或更低，更优选约7 %或更低，更优选约6 %或更低，更优选约5 %或更低，更优选约4 %或更低，更优选约3 %或更低， 更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约
或更低的重组频率，例如约0. 75%或更低，更优选约0. 5%或更低，更优选约0. 25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于 10% (例如约 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。因为一 cM是显示出的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与接近的任何其他标记紧密连锁(遗传上和物理上)，例如等于或小于IOcM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼此定位于9、8、7、6、5、4、3、 2、1、0. 75,0. 5 或 0. 25cM 或更小。术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50%的情况下共分离，例如约51%至约100%的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50% (并且根据定义，在相同染色体上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或者标记和表型之间。标记基因座可与性状，例如镰孢属穗霉菌抗性相“关联”(连锁)。测量分子标记与表型性状的连锁程度，例如分子标记与表型共分离的统计学概率。连锁不平衡最常见地用量度r2测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A, Theor. App 1. Genet. 38 =226-231 (1968)所述的公式计算。当r2 = 1时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2值大于1/3指示足够强的 LD 将被用于作图(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 (2002)) 因此，当成对标记基因座间的r2值大于或等于0. 33、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、或1. 0时， 等位基因处于连锁不平衡。如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。“基因座”是基因或标记位于染色体上的位点。“优势对数(LOD)值”或“L0D 评分” (Risch, Science 255 :803-804(1992))用于区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。“玉米”指玉米属(Zea mays L. ssp. mays)植物，也称为“玉蜀黍”。术语“玉米植物”包括整个玉米植物、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、可从其中再生玉米植物的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织和玉米植物中的完整玉米植物细胞或玉米植物部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、 玉米芽、玉米根、玉米根尖等。“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异、或多态性。对于分子标记，这意味着由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP、SNP)而存在DNA水平上的差异。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件、或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。很多玉米分子标记是本领域已知的，并且被公布于或得自多个来源，例如Maize⑶B因特网资源和University of Arizona Si^ W Arizona Genomics Institute罾ill。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。“标记辅助选择”(或MAQ是一种基于标记基因型进行表型选择的方法。“标记辅助反选择”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植物的方法，所述植物将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中去除。“标记单倍型”是指在标记基因座的等位基因的组合。“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位点，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于追踪存在的第二连锁基因座，例如编码或有助于表达表型性状的连锁基因座。 例如标记基因座能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，例如QTL或单基因，它们与标记基因座在遗传上或在物理上连锁。“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子， 例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多连续的核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面标记探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另外一种选择，在某些方面标记探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是关于无插入的植物的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如SNP技术用于本文提供的实例。当等位基因与性状关联时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不发生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“负”相关。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5'-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G 或T，“H”指A或C或T，“ I ”指肌苷，“N”指任何核苷酸。术语“表型”、或“表型性状”或“性状”是指生物的一个或多个性状。表型可用肉眼或者本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。命名为“PHM”后跟编号(例如PHM6929)的标记代表当用于巢式PCR时扩增特定 DNA片段的两组引物(外部和内部)。外部的一组引物用于第一轮PCR，之后内部序列用于对第一轮PCR的产物进行第二轮PCR。这提高了反应的特异性。PHM标记(由两组引物组成) 的退火温度是55°C。SNP被标识并命名为“PHM”后跟标记编号、短划线和SNP标识符编号。 高通量标记可使用任何高通量平台，包括但不限于化￥3(16『 . (Third Wave Technologies) 平台、hvader Plus 、或Illumina测序技术针对有用SNP多态性而开发。本文所述的高通量SNP标记被命名为PHM后跟PHM标记的编号、短划线、SNP识别符编号、另一个短划线、 以及指明使用的技术的字母。基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如在碱基对或分离的和重叠的连续的基因片段中的测量)并且不基于基因重组。“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指如下任何一种整个植株、植物组分或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或它们的子代。植物细胞是从植物中获取的细胞或来源于从植物中所获取细胞经培养出的细胞。当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状的指示或性状形式将发生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“正”相关。“多态性”是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必须具有至少的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。“概率值”或“P值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，表型和特定标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p = 0.05，或5%的概率)是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50% (p = 0. 5)的任何概率。例如，显著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于0. 15、小于 0. 1、小于0. 05、小于0. 01、或小于0. 001。术语“子代”指杂交产生的后代。“子代植物”从两个植株间的杂交生成。术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL 能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。1号染色体和6号染色体上的QTL在本文中分别称为“QTL1”和“QTL6”。“参考序列”是用作序列比对基准的限定序列。参考序列通过基因分型在该基因座的多个品系、在序列比对程序(例如kquencher)中比对核苷酸序列、然后获取比对的共有序列而获得。参考序列的实例是PHM6^9参考序列。对多个品系中的PHM6^9标记进行基因分型，并且进行序列比对以获得比对的共有序列，所述共有序列本文称为“参考序列”。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座上的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。“顶交测试”是通过将每一亲本与相同测试者(通常是纯合品系)杂交而进行的子代测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交品系或自交系。短语“在严格条件下”指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸混合物中进行，但是基本上无其他序列。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。较长序列具体地讲在较高温度下杂交。特定序列在限定离子强度、pH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50%与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm 50% 的探针被平衡占用)的温度。严格条件将是如下那些条件在PH 7.0至8.3下盐浓度低于约1. OM钠离子，通常约0. 01至1. OM钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10 至50个核苷酸)温度为至少约30°C，而对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60°C。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性的严格杂交条件通常是50%的甲酰胺，5x SSC，和SDS，在42°C孵育，或者切SSC，1 % SDS，在65°C孵育，并用0. h SSC以及0. SDS在65°C洗涤。就PCR而言，约36°C的温度是典型的低严格扩增，而退火温度取决于引物长度可介于约32°C和48°C之间。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。标记的“不利等位基因”是与不利植物表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中移除的植物的有益效果。术语“产量”指具有商业价值的特定植物产品每单位面积的产量。例如玉米产量一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。产量同时受到遗传和环境因素的影响。“农学”、“农学性状”和“农学特性”是指在整个生长季节的过程中有助于产量的给定植物品种的性状(和相关的遗传因子)。单个农学特性包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、 抗倒伏性、脱粒率等等。因此产量是所有农学性状的最终结果。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定， 这些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc. (Madison, WI)) 的MEGALIGN 程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法 (Higgins和Sharp, CABI0S. 5 :151-153(1989))采用默认参数(空位罚分=10，空位长度罚分=10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为 KTUPLE = 1、空位罚分=3、窗口(WINDOW) = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。对于核酸，这些参数为KTUPLE = 2，空位罚分=5，窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。在序列比对后，使用Clustal V程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性” 和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计笪弁。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述Sambrook， J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis， Τ. Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor, 1989 (下文称为 “Sambrook” )。在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“一个植物”也包括多个植物；取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝；现在来看实施方案镰孢属穗霉菌抗件镰孢属穗霉菌(也称为镰孢属穗腐病)是藤仓赤霉菌复合种，即轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和/或胶孢镰孢菌引起的玉米破坏性病害。与镰孢属穗霉菌抗性相关联的分子标记和分子标记的等位基因的鉴定允许抗性的正选择仅基于子代的遗传组成。本文提供了通过基因组成评估(如使用分子标记及其等位基因评估)来鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法。基因作图在很长一段时间里，人们已经认识到与特定表型例如镰孢属穗霉菌抗性相关联的特定基因座可在生物的基因组中作图。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过检测标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇， 植物育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择(该过程称为标记辅助选择或 MAS)从而迅速选择期望表型。本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状例如镰孢属穗霉菌抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型(或等位基因) 之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。用于检测受关注的性状基因座的两种此类方法是1)基于种群的关联分析和2) 传统的连锁分析。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获取品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。传统连锁分析采用同样的原理；然而，LD是用少量创始者构建种群而产生的。选择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander 和 Botstein，Genetics 121 :185-199 (1989)，其中测试沿基因图谱(IcM 的区间)的许多位点中的每一个位点处控制受关注性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。本发明提供展示统计意义上的显著的与镰孢属穗霉菌抗性共分离的玉米标记基因座，所述共分离如传统连锁分析所确定。这些基因座或附加连锁基因座的检测可用于标记辅助玉米育种程序，以产生具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植物。标记组合物本文鉴定了与镰孢属穗霉菌抗性相关联的标记。方法涉及检测玉米植物的种质中与增强的抗性相关联的一个或多个标记等位基因的存在。玉米植物可以是杂交体或自交体。就1号染色体上鉴定的QTL而言，标记基因座可选自图IA至1C、表2A、或表3 中提供的任何标记基因座，包括PHM和SSR标记PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、 PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 禾Π ΡΗΜ15661 ；以及 SNP 标记 ΡΗΜ8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、 PHM1754-20-U、 ΡΗΜ395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 ΡΗΜ1072卜9-U、
26PHM10721-16-U和PHM15661-21-U ；以及与这些标记连锁的任何其他标记(连锁标记可从 Maize⑶B来源测定)。就6号染色体上鉴定的QTL而言，标记基因座可选自图2A和2B或表2B中提供的任何标记基因座，包括 PHM 和 SSR 标记 PHM4423、bnlgl732、PHM9362、PHI445613、PHMl 147、 PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 标记 PHM9362-8-U、 PHM1147-16-U、 PHMl1850-3-U、 PHMl1850-6-U、 PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、 PHM16422-ll-U、PHM1147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 和 PHM4423-4-U ；以及与这些标记连锁的任何其他标记(连锁标记可以从Maize⑶B来源测定)。QTL的物理图谱位置遗传因子或位于单个染色体上的基因组DNA的连续的线性片段上的基因是物理上连锁的。在连锁作图分析中，发现PHM8211和PHM1934绘制于1号染色体上的镰孢属穗霉菌抗性基因座。然而，PHM6^9-3在许多品系中也与增强的抗性共分离，并且PHM6^9-3位于PHM8211-PHM1934区间的外部。因此，1号染色体QTL区间可扩大到包括任何位于包含并侧接PHM6^9和PHM1934的区间之间的标记(图IA至1C)。能与介于以下序列之间并包括它们的连续的DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的标记基因座SEQ ID NO :41 (PHM6929的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 41具有95%同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO :47 (PHM1934的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列。图IA至IC示出了已测序的 BAC的物理图谱排列，所述BAC组成介于PHM6^9和PHM1934之间并且包括它们的连续的 DNA片段。缺口(以虚线表示)不是连续的DNA片段本身的缺口，而是未测序的BAC装配至物理图谱的区域。在连锁作图分析中，发现bnlgl732和umcl762绘制于6号染色体上的镰孢属穗霉菌抗性基因座。然而，PHM4423-4和PHM13773-6在许多品系中也与增强的抗性共分离，并且 PHM4423-4 和 PHM13773-6 位于 bnlgl732_umcl762 区间的外部。此外，PHM16422 和 PHM13773 是紧密连锁的。因此，6号染色体QTL区间可扩大到包括任何位于包含并侧接PHM4423和 PHM16422的区间中的标记。能与介于以下序列之间并包括它们的连续的DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的标记基因座SEQ ID N0:48(PHM4423的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :48具有95%同一性的核苷酸序列和 SEQ ID NO 55 (PHM 16422的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 55具有 95%同一性的核苷酸序列。图2A和2B示出了已测序的BAC的物理图谱排列，所述BAC组成介于PHM4423和PHM16422之间并且包括它们的连续的DNA片段。缺口(以虚线表示) 不是连续的DNA片段本身的缺口，而是未测序的BAC装配至物理图谱的区域。连锁关系连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示， 或者以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。一 cM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为(意味着性状99%的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。
标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，一 cM等于经过单代杂交的标记基因座将与在另一个基因座分离的
的概率。标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10%或更低，优选地约9%或更低，更优选地约8%或更低， 更优选地约7 %或更低，更优选地约6 %或更低，更优选地约5 %或更低，更优选地约4 %或更低，更优选地约3%或更低，更优选地约2%或更低的基因座间交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)显示约或更低的重组频率，例如约0. 75%或更低，更优选地约0. 5%或更低，或更优选地约0. 25%或更低的重组频率。 因此，所述基因座分开距离为约 10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、 0.5cM或0.25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%, 0. 5%,0. 25%、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。尽管特定标记等位基因可显示与镰孢属穗霉菌抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定是负责表达镰孢属穗霉菌抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予增强的镰孢属穗霉菌抗性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。对于1号染色体上的QTL，图IA至1C、表2A、或表3中列出的标记可用于推测玉米植物中镰孢属穗霉菌抗性性状的状态。这包括在PHM和SSR标记PHM6929、bnlgl007、 PHM8711、bnlgl083、PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 标记 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、 PHM8711-17-U, PHMl754-20-U、 PHM395卜25_U、 PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、 PHM10721-9-U、PHM10721-16-U 和 PHM15661-21-U 50cM 内的任何标记。对于6号染色体上的QTL，图2A和2B或表2B中列出的标记可用于推测玉米植物中镰孢属穗霉菌抗性性状的状态。这包括在PHM和SSR标记PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 标记 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U50cM内的任何标记。染饩体区间提供与镰孢属穗霉菌抗性关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制受关注性状的基因连锁的标记。 换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记) 可用作镰孢属穗霉菌抗性标记。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含一个以上的
28QTL0相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与一个以上的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。如下所述区间示出了与镰孢属穗霉菌抗性共分离的标记簇。该簇标记发生在染色体上相对小的结构域内，并且指示那些染色体区域中的一个或多个QTL的存在。区间扩展到涵盖与镰孢属穗霉菌抗性共分离的标记。区间被它们末端的标记限定，其中区间涵盖在区间内作图的标记以及限定末端的标记。通过限定区间端点的末端标记描述的区间将包括末端标记和位于该染色体结构域内的任何标记，无论这些标记目前是否已知。对于1号染色体上的QTL，区间可被如下标记限定并且包括它们a)PHM6^9和 PHM1934 ；或b) PHM6929和PHM14506。对于6号染色体上的QTL，区间可被PHM4423和 PHM16422限定并且包括它们。位于这些区间内的任何标记可用作镰孢属穗霉菌抗性的标记。染色体区间也可通过与QTL标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r2是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果在例如位于PHM6^9和PHM1934区间内的1号染色体标记基因座，与另一个紧邻的1号染色体标记基因座之间的LD的r2值大于 l/3(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 Q002))，这两个基因座彼此连锁不平衡。标记等位基因和单倍型组合本发明的标记也可为一个或多个标记基因座上的等位基因的组合。如下所述的等位基因可单独或组合用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物。本文鉴定了在1号染色体QTL上的有利的SNP等位基因(即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的)，包括位于PHM8211-16的“T”、位于PHM8711-14的“C”、位于PHM14506-7 的 “T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 "A，，、位于 PHM10721-16 的 ‘‘A” 和位于 PHM15661-21 的"G，，。本文鉴定了在6号染色体QTL上的有利的SNP等位基因(即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的)，包括位于PHM9362-8的“G”、位于PHMl 147-16的“G”、位于PHMl 1850-3 的 “T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的“A”、位于 PHM1147-19 的“T”、位于 PHM5280-41 的“G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4 的 “T，，。虽然与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的单倍型可包含如上所述的任何等位基因，但下列单倍型不仅与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关而且可用于标记辅助选择，以对具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物进行正选择a)位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T” ；b)位于 PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A” ；c)位于 PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A” ；d)位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM10721-9 的 “A，，。e)位于 PHM9362-8 的 “G” 和位于 PHM13773-6 的 “A”。
技术人员将期望可能存在附加的多态性位点，所述位点位于本文鉴定的1号染色体和6号染色体标记内部的以及周围的标记基因座上，其中一个或多个多态性位点与单倍型的一个或多个多态性位点上的等位基因连锁不平衡(LD)。在不同多态性位点上的两个特定等位基因据称处于LD，如果在其中一个位点上存在等位基因，则易于推测在相同染色体上的其他位点上存在等位基因(Stevens, Mol. Diag. 4 :309-17 (1999))。技术人员将理解等位基因频率(进而单倍型频率)可因种质库不同而不同。种质库由于成熟期差异、杂种优势群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其他多态性可能在一些种质库中无法提供信息。标记辅助诜择分子标记可用于多种植物育种应用(如参见Maub等人(1996) Hortscience 31 729-741 ；Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter. 1 :3_8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAQ增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植物种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植物发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(G印ts. (2002). Crop Sci ；42 :1780-1790) 0这称为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致产量减少或其他负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人(1998) Genetics 120 :579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人(1989). Biotechnology 7 :257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有 95%的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的IcM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的IcM单次减数分裂图距内有95%的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，上文)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见，如IBM2 Neighbors图谱，该图谱可在Maize⑶B网站上在线获取。MAS具体实施的关键部分为(i)限定种群，在该种群中将确定标记-性状关联，该种群可以是分离种群、或随机或结构化种群；(ii)监控相对于性状的多态性标记的分离或关联，并且使用统计方法确定连锁或关联；(iii)基于统计分析的结果限定一组所期望的标记，以及(iv)将该信息用于和/或外推出当前组育种种质，使基于标记的选择决定得以作出。本公开中描述的标记，以及其他标记类型例如SSR和FLP，可用于标记辅助选择方案。SSR可定义为长度为6bp或更小的相对较短串联重复DNA序列(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17 :6463-6471 ；Wang φ 人(1994)Theoretical and Applied Genetics, 88 :1-6) 0多态性由于重复单元数量变化而发生，可能由DNA复制过程中的滑动引起(Levinson 和 Gutman (1987)Mol Biol Evol 4:203-221)。重复长度的变化可通过在保守的非重复侧接区域设计PCR引物来检测(Weber和May (1989) Am J Hum Genet. 44 388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化(Rafalski 等人(1996)Generating and using DNA markers in plants。选自Non-mammaIian genomic analysis -.a practical guide,Academic press, 第 75-1 页)。可生成各种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过扩增产物的凝胶电泳获取。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于 Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依据合同规定向公众提供玉米的SSR服务。也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。 此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中 (Bhattramakki 等人 Q002)，Plant Mol Biol 48，539-547 ；Rafalski (2002b)，同上文)。SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型当中，SNP是最多的， 因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力(Miattramakki等人2002 Plant Molecular Biology 48 :539447)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得SNP对在MAS中的应用具有高度吸引力。若干种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解、 微测序和编码球。此类方法在下列文献中有所综述Gut (2001) Hum Mutat 17，第475-492 页；ShU2001)Clin Chem 47，第 164-172 页；KwokQ000)Pharmacogenomics 1，第 95-100 页；Bhattramakki 禾口 Rafalski (2001)Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants,选自R. J. Henry 编辑，Plant Genotyping :The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford0 许多可商购获得的技术利用这些和其他方法来巡查SNP，包括Masscode. TM. (Qiagen)、Invader . (Third Wave Technologies)禾口 Invader Plus > SnapShot . (Applied Biosystems) > Taqman .(AppliedBiosystems)禾口 Beadarrays · (Illumina)0许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching 等人 Q002)，BMC Genet. 3 :19 ；Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b)，Plant Science 162:329-333).单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特定基因型。例如，单个的SNP可以是具有镰孢属穗霉菌抗性的特定品系或品种的等位基因 “T”，但是等位基因“T”也可发生在用于轮回亲本的玉米育种种群中。在这种情况下，单倍型例如在连锁SNP标记上的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因。参见例如W020030M229。使用本领域普通技术人员已知的那些自动化高通量标记检测平台使得这一方法高效和有效。由于存在插入/缺失多态性，很多PHM标记可易于用作FLP标记来对1号和6号染色体上的基因座进行正选择。PHM标记的引物也可用于将这些标记转化为在相同区域内的SNP或其他结构上类似或功能上等同的标记(331 、04 、插入缺失等)。一种非常高效的 SNP 转化方法在 Rafalski (2002a) Current opinion in plant biology 5(2) :94-100 和 Rafalski (2002b) Plant Science 162 :3四_333中有所描述。使用PCR时，引物用于扩增来自个体(优选地自交体)的DNA片段，所述个体代表受关注种群的多样性。将PCR产物在一个或两个方向直接测序。比对所得的序列并且鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，还包括插入缺失、CAPS、SSR和VNTR(可变数目串联重复)。具体地讲，针对本文所述的精细图谱信息，人们可易于使用本文提供的信息来获取在通过本公开列出的引物扩增的区域内的附加多态性SNP (和其他标记)。可将在所述图谱区域内的标记杂交到BAC或其他基因组文库，或与基因组序列电子比对，以便在与所述标记的基本近似的位置处查找新序列。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA(RAPD)和其他基于核酸的标记。在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记。尽管它们不直接检测DNA差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1 :3_8)。序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和 /或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在玉米物种中，或者甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其他物种，如大米、小麦、大麦或高粱。一般来讲，MAS使用的多态性标记是经鉴定具有与表型例如镰孢属穗霉菌抗性共分离的显著概率的那些。推测此类标记在图谱上接近产生植物镰孢属穗霉菌抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示、或标记。测试植物是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植物将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。本文提供了鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，该方法通过鉴定具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的等位基因的植株进行，所述等位基因位于本文所述的任何一个1号染色体标记基因座，包括PHM和 SSR 标记 PHM6929、bnlgl007、PHM8711、bnlgl083、PHM8211、PHM14506、PHM1754、PHM3951、 PHM1934、PHM10054、PHM10721 和 PHM15661 ；以及 SNP 标记 PHM8211-16-1、PHM8711-14-U、
32PHM14506-7-U、PHM1934-37-U、PHM8711-17-U、PHM1754-20-U、PHM3951-25-U、PHM6929-3-U、 PHM10054-14-U、PHM10721-9-U、PHM10721-16-U 和 PHM15661-21-U，和 / 或位于本文所述的任何一个6号染色体标记基因座，包括PHM和SSR标记PHM4423、bnlgl732、PHM9362、 PHI445613、PHM1147、PHM11850、PHM9301、umcl762、PHM5280、PHM13773 和 PHM16422 ；以及 SNP 标记 PHM9362-8-U、PHM1147-16-U、PHM11850-3-U、PHM11850-6-U、PHM13773-6-U、 PHM13773-11-U、PHM16422-11_U、PHMl 147-19-U、PHM5280-41-U、PHM9301-37-U 禾P PHM4423-4-U。本文提供的区间用于MAS中，以选择表现出增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。在1 号染色体区间内绘制的任何标记可用于此目的，所述区间由如下标记限定并且包括它们i. PHM6929 和 PHM1934，或ii. PHM6929 和 PHM14506。同样地，在6号染色体区间内绘制的任何标记可用于此目的，所述区间由PHM4423 和PHM16422限定并且包括它们。单倍型也可用于MAS中，以将增强的镰孢属穗霉菌抗性引入敏感玉米品系或品种。单倍型可包含至少一种下列标记等位基因位于PHM8211-16的“T”、位于PHM8711-14 的 “C”、位于 PHM14506-7 的 “T”、位于 PHM1934-37 的 “C”、位于 PHM8711-17 的 “C”、位于 PHM1754-20 的 “C”、位于 PHM3951-25 的 “T”、位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM10721-9 的 “A”、位于 PHM10721-16 的 “A”、位于 PHM15661-21 的 “G”、位于 PHM9362-8 的 “G”、位于 PHMl 147-16 的 “G”、位于 PHMl 1850-3 的 “T”、位于 PHMl 1850-6 的 “C”、位于 PHM13773-6 的 “A”、位于 PHM13773-11 的 “C”、位于 PHM16422-11 的 “A”、位于 PHMl 147-19 的 “T”、位于 PHM5280-41 的 “G”、位于 PHM9301-37 的 “T” 和位于 PHM4423-4 的 “T”。此外，下列单倍型可用于标记辅助选择，以对具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物进行正选择a)位于 PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T” ；b)位于 PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A” ；c)位于 PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A” ；d)位于 PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM10721-9 的 “A，，；e)位于 PHM9362-8 的 “A” 和位于 PHM13773-6 的 “A”。
实施例提供以下实施例以示出受权利要求书保护的本发明，但本发明不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。实施例1镰孢属穗霉菌抗性的大效应QTL作图作图群体由360株F7:8重组自交系(RIL)组成的作图群体来源于非刚性茎杆组中的高抗性品系PHG61和敏感刚性茎杆自交体1047之间的杂交。(图3示出了来自抗性品系PHG61的穗和来自敏感品系1047的穗之间的比较)。在非选择性环境中进行家族的连续自交。通常将在每行中的首个五株植株自交，并且收割来自最接近该行中心的两株植株的穗。一些产生秃穗的品系被自然淘汰。基因分型从F7:8幼苗的冻干叶片样品提取DNA，并且在533个AFLP标记的每一个处收集基因型数据，该标记覆盖总共1380. 6cM，并且标记之间的平均距离为2. 6cM。表型分析在天然感染条件下对RIL种群中的品系评估了可见穗霉菌，所述评估于1998年和 1999 年在美国的两个测试点进行Winterville(WT)，Pitt County, North Carolina 和 Walnut Grove (CA)，San Joaquin County, California。真菌生长和星放射状(果皮上的白色条痕，与籽粒的长轴平行延伸)被视为穗霉菌的征兆和症状。根据图4中示出的1至 9标度对穗堆进行可见穗霉菌评分。QTL 作图使用1999 年发布的 PLABQTL 软件包(Utz 和 Melchinger (1996) J. Quant. Trait Loci 2(1))1. 1版对未转化数据进行QTL分析。复合区间作图(cov SEL命令)用于检测推定的QTL。如果QTL在两个位置均检出并且如果在至少一个位置是显著的，则说明QTL为真实的。QTL分析鉴定出1号、5号、6号、7号和8号染色体上镰孢属穗霉菌抗性的主效QTL。 1号染色体上的QTL本文称为QTLl，并且位于AFLP标记177和T292之间。6号染色体上的 QTL本文称为QTL6，并且位于AFLP标记D166和C116之间。SEQ ID NO 1至8是描绘QTLl 和QTL6的AFLP标记的引物序列。实施例2QTLl和QTL6的验证和精细作图为了测试鉴定的QTL的效应和效用，构建了在以下三个敏感遗传背景中的近等基因系(NIL) 1047 (如上所述)、PH24E和PH1BC。PHG61具有8至9 (基于1至9标度)的镰孢属穗霉菌历史分数；而1047、PH24E和PHlBC具有3至4、4. 0和5. 0的历史分数。将来自实施例1的携带QTLl或QTL6的RIL与初始敏感亲本1047回交两次，接着连续自交3代，从而制成BC3S3品系。NIL也通过将抗性亲本PHG61与两个其他敏感自交体(PH24E和PH1BC)杂交生成。 对于每个杂交，将Fl种群的个体与相应的轮回亲本回交，生成BC2种群，然后BC2家族连续自交进行3代。标记辅助选择(MAS)用于构建NIL，以对每代中相应的QTL区域进行正选择。一组 76个SSR用于MAS。其中四个SSR用于QTLl或QTL6(来源于PHG61)的正选择，而剩余的 72个用于PHG61的负选择。具体地讲，bnlgl953用于选择QTL1，而LGI112958、PHI445613 和PHI364545用于选择QTL6。最新IBM2图谱上这些标记的位置，与它们相应的引物序列一起，可见于表1中。表1 用于对PHG61的QTLl和QTL6区域进行ιΗ选择的SSR标记
染色体 IBM2 2008
引物
bnlgl953 LGIl 12958 PHI445613 PHI364545
6 6 6
170 n/a 375.8 428.4
SEQ ID NO:9 和 10 SEQ ID NO: 11 和 12 SEQ ID NO:13 和 14 SEQ ID NO: 15 和 16然后鉴定了纯合BC3S3(对于在1047背景中构建的NIL)和BC2S3 (对于在PHME 和PHlBC背景中构建的NIL)重组体。使用图4中的标度在美国的以下四个测试点对在天然感染条件下的纯合重组体进行可见穗霉菌评分Camden，Camden County, North Carolina ； Cairo, Grady County, Georgia ；Woodland, San Joaquin County, California ；禾口 Waimea, Kauai, Hawaii。在与轮回亲本1047、PH24E和PHlBC进行比较时，包含QTLl的NIL使镰孢属穗霉菌的评分增加1至2分(基于图4中1至9的标度)，而包含QTL6的NIL使镰孢属穗霉菌的评分增加2至4分。玉米的整合基因和物理图谱用于鉴定所有位于QTLl和QTL6两个区域的BAC重叠群。来自这些重叠群的低拷贝BAC末端序列和PHM标记用于开发与hvader 或Invader Plus 技术一起使用的CAP标记和/或SNP标记。在这两个区域的许多标记位置处对纯合重组体进行评估。对于QTL1，重组数据将QTLl置于这样的区域内，该区域由标记PHM8211 (SEQ ID NO 33至36)和PHM1934(SEQ ID NO :37至40)限定并且包括它们，而QTL6则置于6号染色体这样的区域内，该区域由标记bnlgl732(SEQ ID NO 17和18)和umcl762 (SEQ ID NO 19和20)限定并且包括它们。实施例3优良自交体转化株尽管PHG61覆盖镰孢属穗霉菌抗性等位基因，但PHG61的农学特性较差。因此，许多优良自交体通过来自PHG61的QTLl和/或QTL6的基因渗入而“转化”为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性。然后育种人员可利用这些转化株将QTL从PHG61移动至它们的育种种质。 转化株由优良自交体 PHCA5、PH51H、PH70R、PH87H、PHFCJ、PH890 和 PHBlV 通过将 PHG61 (供体亲本)与每个相应的自交体(轮回亲本)杂交而产生。然后将子代与轮回亲本回交五次， 然后自交三代。在每个BC种群中，SSR标记用于QTL区域的正选择。使用bnlgl007(SEQ ID NO :21 和 22)、bnlgl083(SEQ ID NO :23 和 24)和 PHI256546 (SEQ ID NO :25 和洸)进行 QTLl 的正选择，并且使用 bnlgll74(SEQ ID NO :27 和 28)和 umcl805(SEQ ID NO 29 和 30)进行QTL6的正选择。然而，在BC5种群和BC5F2种群中，使用umcl462(SEQ ID NO: 31和32)和PHI445613(SEQ ID NO :13和14)进行QTL6的正选择。然后使用SNP标记代替SSR选择BC5F3个体。对于QTL1，正选择的等位基因为位于PHM8211-16的“T”、位于 PHM8711-14 的“C”、位于 PHM14506-7 的“T” 和位于 PHM1934-37 的“C”。对于 QTL6，正选择的等位基因为位于PHM9362-8的“G”、位于PHM1147-16的“G”、位于PHM11850-6的“C”、 位于PHM13773-11的“C”和位于PHM16422-11的“A”。参见图5A和5B (对于QTL1)以及图 6A和6B (对于QTL6)，获取这些SNP每一个的标记信息。来自选择的BC5F3个体和对应的非转化自交体的种子采用裂区设计进行种植，其中基因型(QTL)嵌套在自交体内。在3个位置(Cremona, Italy ；Cairo, GA ；和Woodland，CA)的每个中都有3个重复；然而Cairo，GA和Cremona，Italy位置无病害压力，并且不可评分。在WoodlancbCA，整个田间的病害压力良好，但是若干自交体是秃穗的或具有散布的籽粒。理想的是，表型可通过评估穗堆的分数来量度，所述穗堆具有6个或更多个籽粒灌浆分数为3或更高的穗。然而，由于籽粒散布的问题，评分在非常差的穗堆上进行，并且很多项目根本不能评分。PHBlV具有良好的穗堆，并且评分是充分的。使用图4中提供的标度进行表型评分，并且对于 QTLl 在标记 PHM8711-17、PHM8211-16、PHM1754-20 和 PHM3951-25 进行基因分型，并且对于 QTL6 在标记 PHM9362-8、PHMl 147-16、PHMl 147-19、PHMl 1850-6、 PHM5280-41和PHM9301-37进行基因分型。参见图5A、5B、6A和6B，获取SNP标记的信息； 具体地讲，图中列出了每个引物和探针序列的SEQ ID标识符。评估许多其他标记以确定其他鉴定的QTL(参见实施例1)是否与表型结果矛盾。对于QTL5，这些标记是PHM9009-13、 PHM3171-5 和 PHM3860-43 ；对于 QTL7，这些标记是PHM7942-12、PHM678_22 和 PHM8358-17 ； 对于 QTL8，这些标记是PHM16415-8、PHM737-215 和 PHM9092-11。参见图 7A 至 7C，获取 Invader Plus 平台使用的引物和探针序列。图8至14示出了优良自交体转化株的结果。 在每个表中，“c0rr_vearm0ld”是具有籽粒灌浆充分的6个或更多个穗的穗堆的校正分数。 “stddev”表示标准偏差。用深灰色突出的单元格表示PHG61等位基因，并且用浅灰色突出的单元格表示标记基因座在该等位基因处分离，或表示用于检测SNP的技术不能确定存在哪个等位基因。只示出了那些获取表型数据的SI_ID(种子库_标识号；指示种子来源)。 “EQV”意指不能称为多态性；“NF”意指数据未找到。PHCA5、PH51H、PH70R和它们相应的转化株具有严重的籽粒散布问题，使其评分极
其困难。PHCA5具有4. 0的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它不可评分。PHG61 和 PHCA5 在 PHM8711-17、PHM1754-20、PHMl 147-16、PHM3171-5、PHM678-22 和 PHM9092-11 不具有多态性。11510073和11710277在QTLl表现出分离，并且可能具有来源于PHG61 的QTL6。11510073和11710277分别具有4. 0和5. 5的分数。分数都为4的11510074和 11710275具有来源于PHG61的QTLl但不具有QTL6。分数为4. 0的11510082没有来源于 PHG61的QTLl，并且可能具有QTL6。图8示出了 PHCA5转化数据。PH51H具有3. 6的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有4. 7的分数。 PHG61 和 PH51H 在 PHM5280-41、PHM3171-5、PHM3860-43、PHM678-22 和 PHM737-215 不具有多态性。由于QTL7的干扰，11066837、11066811、11066836和11066839表现出具有矛盾的表型数据。分数为5. 0的11066837可能对于QTLl是分离的，可能具有QTL6，并且表现出具有QTL7。分数为5. 5的11066809可能对于QTLl是分离的，并且可能具有来源于PHG61的 QTL6。分数为6. 0的11066839对于QTLl表现出分离，不具有QTL6，并且表现出具有QTL7。 分数为6. 3的11066838对于QTLl和QTL7 二者是分离的，并且可能具有来源于PHG61的 QTL6。分数为6. 7的11066841和分数为7. 5的11066811不具有QTL1，并且对于QTL6和 QTL7表现出分离。由于存在QTLl、QTL6和/或QTL7，转化株的分数与PH51H相比显著增加。图9示出了 PH51H转化数据。PH70R具有3. 6的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有3. 0的分数。PHG61 和 PH70R 在 PHM8711-17、PHM1754-20、PHM3951-25、PHMl 1850-6、PHM5280-41、 PHM9301-37、PHM3171-5、PHM3860-43、PHM678-22、PHM16415-8、PHM737-215 和 PHM9092-11不具有多态性。分数为3. 0的11067135不具有QTLl，并且可能具有来源于PHG61的QTL6。 11067046具有3. 0的分数，并且表现出具有来源于PHG61的QTLl。分数为4. 0的11067168 在 QTLl 和 QTL6 均表现出分离。11067139、11067095 和 11062329 分别具有 3. 5,4. 7 和 5. 0 的分数，并且所有都表现出具有来源于PHG61的QTL1，并且对于QTL6是分离的。11067060、 11067174和11067126分别具有5. 0,5. 0和5. 5的分数，并且它们表现出具有来源于PHG61 的QTLl，并且可能具有QTL6。
图10示出了 PH70R转化数据。PH87H、PHFCJ、PH890和它们相应的转化株具有籽粒散布问题，虽然较不严重。PH87H具有5. 0的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有5. 5的分数。 PHG61 和 PH87H 在 PHM8711-17、PHM1147-16、PHM678-22 和 PHM9092-11 不具有多态性。分数为3. 7的110663 具有来源于PHG61的QTLl和QTL5，并且对于QTL6和QTL8表现出分离。分数为4. 0的110663 在QTLl和QTL8表现出分离，并且可能具有来源于PHG61的 QTL6。分数为4. 0的11066314具有来源于PHG61的QTLl和QTL5，并且可能具有QTL6和 QTL8。分数为4. 3的11066230没有来源于PHG61的QTLl或QTL6，但是可能具有QTL5。分数都为6. 0的11066235和11066277不具有来源于PHG61的QTL6，但是可能具有QTLl和 QTL8。分数为6. 0的11066377在QTLl和QTL5表现出分离，并且可能具有来源于PHG61的 QTL6。分数为6. 0的11062279具有来源于PHG61的QTLl和QTL5，并且可能具有QTL6。分数为6. 0的11066321具有来源于PHG61的QTL1，并且在QTL5、QTL6和QTL8表现出分离。
图11示出了 PH87H转化数据。PHFCJ具有4. 0的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有5. 3的分数。PHG61 禾Π PHFCJ 在 ΡΗΜ8211-16、ΡΗΜ9362-8、PHMl 147-16、ΡΗΜ9301-37、ΡΗΜ8358-17、 ΡΗΜ16415-8和ΡΗΜ737-215不具有多态性。分数为3. 7的11066486在QTLl表现出分离，并且具有来源于PHG61的QTL6。分数为4. 0的11066514具有来源于PHG61的QTL6，并且可能具有QTLl。分数为4. 0的110665522在QTLl和QTL6表现出分离。
图12示出了 PHFCJ 转化数据。ΡΗ890具有4. 5的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有3. 5的分数。 PHG61 和 ΡΗ890 在ΡΗΜ8711-17、ΡΗΜ1754_20、ΡΗΜ1147-16 和 ΡΗΜ9092-11 不具有多态性。分数为4. 4的11066544没有来源于PHG61的QTL6，并且可能具有QTLl。分数为4. 0的11062297 不具有来源于PHG61的QTL1，并且在QTL6表现出分离。11066659和11066639分别具有3. 0 和4. 0的分数，并且它们不具有来源于PHG61的QTL1，但是具有QTL6。11062294具有5. 0 的分数，并且具有来源于PHG61的QTL6和QTLl。11066672具有3. 7的分数，并且在QTLl 表现出分离。11066707、11066601、11066680 和 11066565 分别具有 2. 5,4. 0,4. 0 和 5. 0 的分数，它们具有来源于PHG61的QTL1，并且在QTL6表现出分离。分数为4. 5的11066600具有来源于PHG61的QTLl和QTL6。
图13示出了 ΡΗ890转化数据。PHBlV具有4. 0的镰孢属穗霉菌历史分数；然而，在此实验中，它具有4. 2的分数。PHG61 禾Π PHBlV 在 ΡΗΜ11850-6、ΡΗΜ5280-41、ΡΗΜ9301-37、ΡΗΜ3171-5、ΡΗΜ3860-43、 ΡΗΜ8358-17、ΡΗΜ16415-8 和 ΡΗΜ737-215 不具有多态性。11066911 和 11066896 分别具有 4. 0和4. 4的分数，并且它们两者都不具有来源于PHG61的QTLl或QTL6。分数为6. 0的 11066988 没有来源于 QTLl 的 QTLl，并且可能具有 QTL6。11066895、11066923、11067017 和 11067023分别具有4. 0,5. 3,6. 6和6. 8的分数，并且具有来源于PHG61的QTLl，但是不具有QTL6。11066930具有5.0的分数，并且具有来源于PHG61的QTL1。11066981具有7. 0 的分数，其在QTLl表现出分离，并且可能具有来源于PHG61的QTL6。11067002具有8. 0的分数，其具有来源于PHG61的QTL1，并且可能在QTL6分离。
图14示出了 PHBlV转化数据。实施例4杂交体中的功效将PHFCJ、PH70R、PH890和PH51H的转化株与自交系杂交产生杂交体，然后与类似的杂交进行比较，在该类似的杂交中非转化PHFCJ、PH70R、PH890和PH51H自交系用作亲本。关于那些具有“良好”抗性单倍型(类似于PHG61)的品系和那些不具有“良好”抗性单倍型的品系之间的镰孢属穗霉菌分数的比较，参见
图15A和15B。评估QTLl的标记包括 PHM6929-3, PHM8211-16 和 PHM14506-7。评估 QTL6 的标记包括ΡΗΜ4423_4、ΡΗΜ9362-8、 ΡΗΜ1147-19 和 PHMl1850-6 当非转化PHFCJ品系与PHlJC杂交时，所得杂交体具有2. 8的平均镰孢属穗霉菌分数。对于由PHFCJ转化品系和PHlJC之间杂交产生的植株，ΡΗΜ9362-8和PHMl 147-19给出了出乎意料的等位基因结果，并且ΡΗΜ8211-16未提供信息。然而，12022402和12022385 分别具有3. 2和3. 5的分数并且具有QTL6，而12022384具有3. 3的分数并且表现出具有 QTLl。当非转化PH70R品系与PH3RC杂交时，所得杂交体具有5. 5的平均镰孢属穗霉菌分数。在PH70R转化品系和PH3RC之间的杂交中，由于具有一个或两个QTL，因此除了一个杂交之外所有杂交的平均分数都等于或大于5. 5。大概由于存在QTL1，12022393和 12022394分别具有5. 5和6. 2的分数。分数为7. 2的12022395具有QTL6，并且可能具有 QTLl。12022396、12022397和12022398分别具有5. 0,7. 2和5. 5的分数，并且所有三个都具有QTLl和QTL6。当非转化ΡΗ890品系与PH4CN杂交时，所得杂交体具有3. 8的平均镰孢属穗霉菌分数。在ΡΗ890转化品系和PH4CN之间的杂交中，杂交的平均分数等于或大于3. 8。12022391 只具有 QTL6,并且具有 3. 8 的分数。12022387、12022388、12022389 和 12022390 具有 QTLl 和QTL6，因此分数分别为5. 8、4. 7、5. 5和4. 8。当非转化ΡΗ51Η品系与PHEKJ杂交时，所得杂交体具有2. 0的平均镰孢属穗霉菌分数。在ΡΗ51Η转化品系和PHEKJ之间的杂交中，杂交的平均分数大于2.0。一个杂交具有 3. 3的分数，并且可能具有QTL6。另外两个杂交分别具有6. 0和5. 0的分数，并且表现出具有QTLl，并且可能具有QTL6。当非转化ΡΗ51Η品系与PHFlJ杂交时，所得杂交体具有7. 3的平均镰孢属穗霉菌分数，该分数指示已经具有高水平的抗性。在ΡΗ51Η转化品系和PHFlJ之间的杂交中，一个杂交具有7. 0的平均分数，并且可能携带QTLl。另一个杂交具有7. 3的平均分数，并且可能具有QTLl和QTL6。第三个杂交也具有7. 3的平均分数，并且具有QTLl，可能具有QTL6。当非转化ΡΗ51Η品系与PH1W2杂交时，所得杂交体具有5. 3的平均镰孢属穗霉菌分数。在ΡΗ51Η转化品系和PH1W2之间的杂交中，每个杂交具有大于5. 3的平均分数，并且具有QTLl，可能具有QTL6。实施例5用于镰孢属穗霉菌抗性植株的标记辅助选择的高通量标记的鉴定
紧密连锁的标记具有与在QTLl和/或QTL6的抗性等位基因连锁不平衡的等位基因，所述紧密连锁的标记可有效地用于对具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的子代植物进行正选择。本文所述的标记，以及其他在遗传上或物理上作图至相同染色体片段的标记，可用于对具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物进行正选择。表2A和2B示出了本文所述的标记和它们在内源基因图谱(PHB)和IBM2图谱(灰色区域指示QTL所在位置)的位置。图 IA至IC和2A至2B分别示出了 QTLl区域和QTL6区域的物理图谱；每个PHM参考序列的 SEQ ID NO都在图中示出。表2A 以物理图谱顺序排列的QTLl区域
标记PHBΙΒΜ2bnlgl95370.45170PI1M692976.12183.8bnlgl()()776.93139.7PHM871179.68198.4bnlgl08380.54201.3PIIM1005480.33n/aPIIM821 178.3n/aPI-IM 1287281.72n/aPHM 1072180.77198.4PIIM 1566184.31n/aPHM1450681.88201.5PHM175483.76198.4PHM395184.39226.4PHM193484.39198.4ΡΗΙ25654690.98226.4 表2B 以物理图谱顺序排列的QTL6区域
权利要求
1.选择具有增强的镰孢属(Fusarium)穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取可用于分析的DNA;b.在所述玉米植物中检测与第二标记等位基因连锁并关联的第一标记等位基因，所述第二标记等位基因选自1.位于PHM8211-16 的 “T”，ii.位于PHM8711-14 的 “C”，iii.位于PHM14506-7 的 “T，，，iv.位于PHM1934-37 的 “C”，v.位于PHM8711-17 的 “C”，vi.位于PHM1754-20 的 “C”，vii.位于PHM3951-25 的"T，，，viii.位于PHM69^-3 的 “C”，ix.位于PHM10054-14 的"A，，， χ.位于 PHM10721-9 的 “A，，，xi.位于PHM10721-16 的"A，，，xii.位于PHM15661-21 的 “G，，，xiii.位于PHM9362-8 的"G，，，xiv.位于PHMl 147-16 的 “G，，， XV.位于 PHMl 1850-3 的 “T，，，xvi.位于PHMl 1850-6 的 “C”，xvii.位于PHM13773-6 的 “A”，xviii.位于PHM13773-11 的 “C”，xix.位于PHM16422-11 的 “A”， XX.位于 PHMl 147-19 的 “T，，，xxi.位于PHM5280-41 的 “G”，xxii.位于PHM9301-37 的 “T”，和xxiii.位于PHM4423-4 的 “Τ” ；以及c.选择具有所述第一标记等位基因的所述玉米植物。
2.权利要求1的方法，其中所述第一标记等位基因以20cM的距离与所述第二标记等位基因连锁。
3.权利要求1的方法，其中所述第一标记等位基因以IcM的距离与所述第二标记等位基因连锁。
4.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取可用于分析的DNA;b.在所述玉米植物中检测至少一个标记等位基因，所述标记等位基因选自i.位于PHM8211-16 的 “T”，ii.位于PHM8711-14 的 “C”，iii.位于PHM14506-7 的 “T，，，iv.位于PHM1934-37 的 “C”，v.位于PHM8711-17 的 “C”，vi.位于PHM1754-20 的 “C”，vii.位于PHM3951-25 的"T，，，viii.位于PHM69^-3 的 “C”，ix.位于PHM10054-14 的"A，，，χ.位于 PHM10721-9 的 “A，，，xi.位于PHM10721-16 的"A，，，xii.位于PHM15661-21 的 “G，，，xiii.位于PHM9362-8 的"G，，，xiv.位于PHMl 147-16 的 “G，，，XV.位于 PHMl 1850-3 的 “T，，，xvi.位于PHMl 1850-6 的 “C”，xvii.位于PHM13773-6 的 “A”，xviii.位于PHM13773-11 的 “C”，xix.位于PHM16422-11 的 “A”，XX.位于 PHMl 147-19 的 “T，，，xxi.位于PHM5280-41 的 “G”，xxii.位于PHM9301-37 的 “T”，和xxiii.位于PHM4423-4 的 “Τ” ；以及c.选择具有所述至少一个标记等位基因的玉米植物。
5.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中检测标记基因座，其中a.将包含所有或一部分所述标记基因座、或其互补序列的标记探针在严格条件下与连续的DNA杂交，所述连续的DNA介于以下序列之间并包括以下序列SEQ ID NO :41或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID NO :41具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO 47 或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 47具有95%同一性的核苷酸序列；以及b.所述标记基因座包含与所述增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
6.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的等位基因，其中a.所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM6^9和 PHM1934 ；并且b.所述等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。
7.权利要求6的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接 PHM6^9 和 PHM14506。
8.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测在一个或多个标记基因座包含等位基因的单倍型，其中a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接 PHM6929 和 PHM1934 ；并且b.所述单倍型与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。
9.权利要求8的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM6^9和PHM14506。
10.权利要求8或9的方法，其中所述单倍型包含a.位于PHM69^-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T” ；b.位于PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A” ；或c.位于PHM10054-14 的 “A”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM10721-9 的 “A，，。
11.选择显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述标记基因座位于包含并侧接PHM6^9和PHM1934的染色体区间内，并且所述等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联；b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；c.评估子代植物的所述第一玉米植物的所述等位基因；以及d.选择具有所述第一玉米植物的所述等位基因的子代植物。
12.权利要求11的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM6^9和PHM14506。
13.选择显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取第一玉米植物，所述第一玉米植物的基因组内包含i.位于PHM6929-3 的 “C”、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM14506-7 的 “T”ii.位于PHM10054-14 的 “A” 和位于 PHM10721-9 的 “A，，；或iii.位于PHM10054-14 的 “A，，、位于 PHM8211-16 的 “T” 和位于 PHM10721-9 的 “A”；b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；c.评估子代植物的所述等位基因；以及d.选择具有所述等位基因的子代植物。
14.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中检测标记基因座，其中a.将包含所有或一部分所述标记基因座、或其互补序列的标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续的DNA杂交SEQ ID NO :48或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :48具有95%同一性的核苷酸序列、以及SEQ ID NO :55或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 55具有95%同一性的核苷酸序列；以及b.所述标记基因座包含与所述增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
15.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中a.所述标记基因座位于包含并侧接PHM4423和PHM16422的染色体区间内；并且b.所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
16.鉴定显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测在一个或多个标记基因座包含等位基因的单倍型，其中a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接 PHM4423 和 PHM16422 ；并且b.所述单倍型与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。
17.权利要求16的方法，其中所述单倍型包含a.位于PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A”；或b.位于PHM9362-8 的 “A” 和位于 PHM13773-6 的 “A”。
18.选择显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取具有标记基因座至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM4423和PHM16422，并且所述等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联；b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；c.评估子代植物中的所述第一玉米植物的所述等位基因；以及d.选择具有所述第一玉米植物的所述等位基因的子代植物。
19.选择显示增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植物的方法，所述方法包括a.获取第一玉米植物，所述第一玉米植物的基因组内包含i.位于PHM4423-4 的 “T”、位于 PHMl 1850-3 的 “T” 和位于 PHM13773-6 的 “A”；或ii.位于PHM9362-8 的 “A” 和位于 PHM13773-6 的 “A” ；b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；c.评估子代植物中的所述等位基因；以及d.选择具有所述等位基因的子代植物。
20.通过权利要求5、6至9、10和14至17的方法中的任意方法鉴定的玉米植物。
21.通过权利要求1至4、11至13和18至19的方法中的任意方法选择的植物。
全文摘要
本发明涉及鉴定和选择具有增强的镰孢属(Fusarium)穗霉菌抗性的玉米植物的方法和组合物。通过本发明的所述方法生成的玉米植物也是本发明的特征。
文档编号A01H5/10GK102395687SQ201080016703
公开日2012年3月28日 申请日期2010年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者A·托马斯, D·普拉达, K·辛科克斯, S·拉克 申请人:纳幕尔杜邦公司