专利名称：抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵，特别是指一种能够抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法。
背景技术：
在三七大量种植的今天，由于大量使用化肥、农药，使得土壤-微生物-三七根形成的土壤生态系统受到严重破坏，有益菌受到抑制，而致病的真菌，如锈腐病菌、恶疫霉、腐皮镰孢菌、立枯丝核菌和腐霉菌等，得到扩散生长，致使三七频繁发生重茬病，如根腐、枯萎、黄苗、花叶、黑斑等，使得新开垦的森林土在种植3-5年(一茬)三七后，不能再重复利用，一般需要经过十年甚至十几年以上的自然修复才能再种植三七。因此，能种植三七的土地越来越少。对三七重茬病的传统防治方法有化学防治和种植措施防治。近年来，由于传统的种植措施防治方法不能从根本上控制病害的发生，防治效果甚微；而长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，过量使用农药也会破坏土壤的微生态环境，加重农药对环境的污染，造成有害有毒物质在作 物体内残留过高的恶果。采用微生物菌剂防治方法研究越来越受到人们的重视。从修复土壤生态系统入手，增加土壤中的有益菌，从而抑制那些容易感染植株病害的细菌和真菌。采用细菌-真菌联合、多菌种联合的技术方法，达到修复土壤生态系统，防止根腐病、枯萎病等重茬病发生，同时促进根生长，松土壮苗。益根生菌剂还具有降解农药、化肥残留污染的作用。菌剂经发酵工程完成后有效活菌数(cfu)在20亿以上，即 2-3X109cfu/go采用细菌-真菌联合预防三七重茬病益根生菌菌剂及其高密度、高活性的生产工艺还未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种高密度、高活性的预防三七重茬病益生菌菌剂制备方法。本发明的技术设计构思是抗重茬益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂生产的一级种子液接种于以玉米粉-马铃薯-豆柏为主成分的培养基中进行二级、三级发酵，所述的发酵过程是在温度为30°C、pH值为7. 2-7. 6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌 CGMCC1. 1630 (Bacillus subtil is)，地衣芽孢杆菌 CGMCC1. 518 (Bacilluslicheniformis),多粘芽抱杆菌 CGMCC1. 516 (Paenibacillus poIymyxa),幾链球菌 CGMCC1. 101(Streptococcus feaculis),热带假丝酵母 CGMCC2. 1773(Candidatropicalis),淡紫拟青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces Iilacinus),细黄链霉菌CGMCC4. 399 (Streptomyces microf Iavus)等7株细菌-真菌。将发酵终产物吸附、固定化于用草炭生物炭上，制成的固体粉末菌剂。本发明中所用菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。无毒、无害，对土壤环境友好。用这些菌去修复遭到破坏的土壤生态系统，与原土壤的有益菌共同形成新的生态平衡。所述的扩大培养发酵过程包括下列工艺步骤(I)、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管(约IOmL)、小三角瓶(100-150mL)到大三角瓶(1000-1500mL)逐级扩大培养制成一级种子液(每株菌各1000-1500mL)级种子液的制备过程枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌，粪链球菌和细黄链霉菌的培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);热带假丝酵母和淡紫拟青霉采用马铃薯-蔗糖培养基(去皮马铃薯200g水煮20-30min，双层纱布过滤去渣留液，蔗糖20g，用水补足IOOOmL,自然pH值)。培养条件温度为28_30°C，时间为24-48h.(2)、将(I)步骤中制备的一级种子液进行等质量混合，转接于二级扩大培养液(30-35L)，(培养基组成玉米粉30g，去皮马铃薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸钾1. 0g，磷酸氢二钾0. 5g,硫酸镁0. 5g,氯化钠0. 5g,硫酸亚铁0. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用过饱和氢氧化钙调节PH值7. 2-7. 6)。以5% -10%的接种量接入发酵培养基，进行混合好氧发酵，温度300C，搅拌转速150-200r/min，通气压力保持0. 05Mpa,发酵培养20_24h，制备成二级种子液； (3)、将⑵步骤中制备的二级种子液转接于三级扩大培养液(300-350L)，培养基同(2):以5%-10%的接种量导入发酵培养基进行好氧发酵，温度30°C，搅拌转速200-250r/min，通气压力保持0. 05Mpa，发酵培养20_24h，制备成发酵终产物；发酵终点用分光光度法测定以660nm波长吸光值最大(发酵液稀释100倍，用灭菌发酵培养基作空白对照)或用血球计数板显微计数法(稀释100倍)以菌群数最多为发酵终点。为能给所扩大培养的菌群提供一定保护环境，必须选择具有一定的营养成分，还具有网状结构，具有较大的比表面积，能在单位体积内吸附、固定化较多的菌体。优选选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭生物炭。草炭生物炭，采用新工艺，在无氧或少氧条件下经400-45(TC，4-8h炭化过程而制成的生物炭。这种载体具有较高的有机质含量，无菌、无水，容易吸附菌体，容易与土壤混合，保护菌群适应土壤生态环境。为减少菌群的耗氧，延长保质期，防止污染。优选的实施方案是将吸附、固定化于草炭上制成的益生菌菌剂密封包装。其中更为优选的技术方案是密封包装是将益生菌菌剂密封于内衬聚乙烯膜的包装袋内。本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于1、在二、三级扩大培养时采用玉米粉-马铃薯-豆柏为主成分的培养基对混合后的菌种实现扩大培养，大大降低了成本，缩短了发酵周期，提高了设备利用效率。2、经检测，将发酵终产物(复合菌)固定化于草炭生物炭上，每克固体菌制剂的有效菌菌落数(cfu)可高达20亿以上(即2-3X109cfu/g)，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道。草炭生物炭不仅能为所培养菌提供一些营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定较多的菌体。因此，一定量的有效菌菌剂一旦均匀加入三七根围土壤中就可以很快形成优势菌群，发挥抗重茬、益根生的作用。
3、因土壤生态系统复杂，单一的菌或少量的菌是难以完成生态修复的。必须由细菌-真菌联合、多种菌联合，产生多种酶才能最终降解农药、化肥残留，达到松土状苗、促根生长、抗重茬病、修复生态系统的目的。
具体实施例以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。实施例1益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂的生产二级、三级菌液接种于以玉米粉-马铃薯-豆柏为主成分的培养基中进行混合扩大培养发酵，所述的发酵过程是在温度为30°C、pH值为7. 2-7. 6的条件下进行的好氧混合发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌，粪链球菌，热带假丝酵母，淡紫拟青霉，细黄链霉菌等7株细菌-真菌。将发酵终产物吸附、固定化于草炭生物炭上的固体菌剂。本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是(I)、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管(SmL)、小三角瓶IOOmL)到大三角瓶(1500mL)逐级扩大培养制成一级种子液(每株菌各1500mL);一级种子液的制备过程枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌，粪链球菌和细黄链霉菌的培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);热带假丝酵母和淡紫拟青霉采用马铃薯_蔗糖培养基(去皮马铃薯200g水煮20-30min，双层纱布过滤去渣留液，蔗糖20g，用水补足IOOOmL,自然pH值)。培养条件温度为30°C，时间为28h.(2)、将(I)步骤中制备的一级种子液进行等质量混合，转接于二级扩大培养液(30L)，培养基组成玉米粉30g，去皮马铃薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸钾1. Og,磷酸氢二钾O. 5g,硫酸镁O. 5g,氯化钠O. 5g,硫酸亚铁O. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用过饱和氢氧化I丐调节pH值7. 2-7. 6。以10%的接种量接入发酵培养基，进行混合好氧发酵，温度30°C，搅拌转速200r/min，通气压力保持O. 05Mpa,发酵培养24h，制备成二级种子液；(3)、将(2)步骤中制备的二级种子液转接于三级扩大培养液(300L):培养基同
(2)。以5% -10%的接种量导入发酵培养基进行好氧发酵，温度30°C，搅拌转速250r/min，通气压力保持O. 05Mpa,发酵培养24h，制备成发酵终产物；发酵终点用分光光度法测定以660nm波长吸光值最大(发酵液稀释100倍，用灭菌发酵培养基作空白对照)或用血球计数板显微计数法(稀释100倍)以菌群数最多为发酵终点。载体选用占发酵终产物总质量5倍的草炭生物炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于草炭生物炭上。将吸附、固定化于草炭生物炭上制成的益生菌菌剂密封于内衬聚乙烯膜的包装袋内。实施例2
将益根生菌剂的生产菌种的细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基，真菌接种于马铃薯-蔗糖培养基，在温度为30°C、pH值为7. 6的条件下制备一级
种子培养液。二级、三级扩大培养采用以玉米粉-马铃薯-豆柏为主要成分的培养基。生产菌种选用同实施例1。本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是(I)、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管(7mL)、小三角瓶(IOOmL)到大三角瓶(1500mL)逐级扩大培养制成一级种子液(每株菌各1500mL);一级种子液的制备过程枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌，粪链球菌和细黄链霉菌的培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7. 2-7. 6，水 IOOOmL)；热带假丝酵母和淡紫拟青霉采用马铃薯-蔗糖培养基(去皮马铃薯200g水煮20-30min，双层纱布过滤去渣留液，蔗糖20g，用水补足IOOOmL,自然pH值)。培养条件温度为30-37°C，时间为24-48h.(2)、将(I)步骤中制备的一级种子液进行等质量混合，转接于二级扩大培养液(35L)，(培养基组成玉米粉30g，去皮马铃薯20g，豆柏2g，砂糖2g，硝酸钾1. Og,磷酸氢二钾O. 5g,硫酸镁O. 5g,氯化钠O. 5g,硫酸亚铁O. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用过饱和氢氧化I丐调节pH值7. 2-7. 6)。以5% -10%的接种量接入发酵培养基，进行混合好氧发酵，温度30°C，搅拌转速150-200r/min，通气压力保持O. 05Mpa，发酵培养24h，制备成二级种子液；(3)、将(2)步骤中制备的二级种子液转接于三级扩大培养液(350L)，培养基同
(2):以10%的接种量导入发 酵培养基进行好氧发酵，温度30°C，搅拌转速200r/min，通气压力保持O. 05Mpa,发酵培养22h，制备成发酵终产物；发酵终点用分光光度法测定以660nm波长吸光值最大(发酵液稀释100倍，用灭菌发酵培养基作空白对照)或用血球计数板显微计数法(稀释100倍)以菌群数最多为发酵终点。将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于4倍草炭生物炭上。密封包装于内衬聚乙烯膜的包装袋内。常温保存。实验效果1.盆栽实验已种植3年三七的土样，过2mm筛，称取1500克，加入益生菌菌剂7. 5克(质量比O. 5% )与土样混合均匀，均匀分至3盆，每盆各栽三七3棵，作为实验组；另取同样1500克土样，加入7. 5克草炭生物炭，混合均匀后分置3盆，同样每盆种植3棵三七，作为对照组。在相同的常规温室管理条件下(保持一定湿度、温度、光照)，两组条件一样。经过6个月的观察，实验组三七生长良好，未出现花叶枯萎、烂根等重茬病病状。而对照组生长缓慢，有3棵出现花叶枯萎病症，有6棵出现烂根现象。2.云南文山州三七种植基地实验选择4垧(长条状10*14m2)已种3年，刚刚起出三七的地块，常规施底肥，翻耕、耙平后，设2垧为实验组，加入益生菌菌剂100kg，2垧为对照组，不另加别的肥料。实验组和对照组一字排开，相间排列，常规种植三七，每垧栽种1000棵三七苗，其它管理条件完全相同(温度、光照、湿度)。实验期18个月。结果实验组仅有10棵出现重茬病病症，而对照组90%的秧苗(1800棵)出现烂根等重茬病病症，余下的200棵也生长不良。
权利要求
1.抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将抗重茬病益生菌菌剂的生产菌种接种先分别培养，然后用以玉米粉-马铃薯-豆柏为主要成分的培养基中进行混合扩大发酵培养，其特征在于所述的发酵过程是在30°C、pH值为7. 2-7. 6的条件下进行的混合好氧发酵过程。生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1. 1630 (Bacillus subtilis),地衣芽抱杆菌 CGMCC1. 518 (Bacillus licheniformis),多粘芽抱杆菌 CGMCC1. 516(Paenibacillus poIymyxa),幾链球菌 CGMCC1. 101(Streptococcus feaculis),热带假丝酵母 CGMCC2. 1773(Candida tropicalis),淡紫拟青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces Iilacinus),细黄链霉菌 CGMCC4. 399(Streptomyces microflavus)等7株细菌-真菌；将发酵终产物吸附、固定化于用草炭在无氧或少氧、 400 V下炭化的草炭生物炭上而制备成的固体粉末菌剂。
2.根据权利要求1所述的预防三七重茬病益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的二级、三级扩大培养的培养基以玉米粉-马铃薯-豆柏为主要成分的培养基。培养基组成玉米粉30g，去皮马铃薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸钾1. Og,磷酸氢二钾0. 5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0. 5g，硫酸亚铁0. 001g，蒸馏水IOOOmL,用过饱和氢氧化钙调pH值7. 2-7. 6。
3.根据权利要求1所述的抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法，其特征在于所述的发酵过程包括下列工艺步骤(1)、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管(约 IOmL)、小三角瓶(100-150mL)到大三角瓶(1000-1500mL)逐级扩大培养制成一级种子液 (每株菌各 1000-1500mL)；(2)、将(I)步骤中制备的一级种子液进行等质量混合，转接于二级扩大培养液 (30-35L)。以5% -10%的接种量接入发酵培养基，进行混合好氧发酵，温度30°C，搅拌转速 150-200r/min，通气压力保持0. 05Mpa，发酵培养20_24h，制备成二级种子液；(3)、将(2)步骤中制备的二级种子液转接于三级扩大培养液(300-350L)，培养基同(2)。以5% -10%的接种量导入发酵培养基进行好氧发酵，温度30°C，搅拌转速200-2501·/ min，通气压力保持0. 05Mpa，发酵培养20_24h，制备成发酵终产物；发酵终点用分光光度法测定以660nm波长吸光值最大(发酵液稀释100倍，用灭菌发酵培养基作空白对照)或用血球计数板显微计数法(稀释100倍)以菌群数最多为发酵终点。
4.根据权利要求3所述的抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法，其特征在于所述的(I)步骤一级种子的制备过程中，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌， 粪链球菌和细黄链霉菌的培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基(配方牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化钠5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);热带假丝酵母和淡紫拟青霉采用马铃薯-蔗糖培养基(配方去皮马铃薯200g水煮20-30min，双层纱布过滤去渣留液，蔗糖20g，用水补足 IOOOmL,自然pH值)。培养条件温度为28_30°C，时间为24_48h。
5.根据权利要求3所述的预防三七重茬病益生菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的(I)、(2)、(3)、(4)步骤中的培养基的灭菌条件是压力0.1Mpa、温度121°C、时间30min。
6.根据权利要求1所述的抗重茬修复三七连作土壤生态菌剂的制备方法，其特征在于所述的吸附菌液的载体选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭生物炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于载体上，制备成固体粉末菌剂。
7.根据权利要求1或6所述的发酵菌剂的制备方法，其特征在于将吸附、固定化于草炭生物 炭上制成的发酵固体菌剂密封于内衬聚乙烯膜的包装袋内。
全文摘要
预防三七重茬病益生菌菌剂的制备方法，属于微生物发酵领域。包括发酵步骤，是将益生菌菌剂的生产菌种先分别个别培养制备成一级种子液，再接种于以玉米粉-马铃薯-豆粕为主要成分的培养基中进行好氧混合发酵扩大培养。生产菌种选用枯草芽孢杆菌等7株细菌-真菌。将发酵终产物吸附、固定化于草炭生物炭上，制备成固体菌剂。本发明解决了现有三七种植技术普遍存在的重茬病，种植2-3年后三七种植地块能够连种连收。本发明的制备方法，具有生产成本低、发酵周期短、菌群密度高的突出特点。该菌剂，可以预防三七种植过程中的死苗、黄苗、枯萎、干叶、根腐等土壤生态病状。同时，还能促进根生长、松土壮苗，解除农药、化肥残留，具有显著土壤生态修复作用。
文档编号C12R1/10GK103045582SQ20131002057
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者张清敏, 唐景春, 张彦峰, 王发云, 王麟猛, 赵颖, 张莹捷 申请人:南开大学, 文山市盛大中药材专业合作社, 昆明天泰昌生物科技有限公司