专利名称：一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法
一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法技术领域
本发明属于石油污染土壤微生物修复技术领域，具体涉及一种石油污染土壤生 物修复菌剂的筛选方法及修复方法。
背景技术：
石油作为“工业的血液”，其工业发展和应用日益迅猛。然而，它同时带来的 污染尤其是土壤污染问题也备受关注。目前，国际上公认的最有前途的石油污染土壤处 理方法是生物修复。
石油污染土壤的生物修复技术研究始于上个世纪80年代，该技术是借助于大量 微生物利用石油中的烃类物质作为碳源和能源而生长，通过其新陈代谢作用，将土壤中 的石油污染物降解成二氧化碳和水或转化成为其它无害物质。微生物对石油污染物主要 的作用过程有三方面一是烃的直接吸收石油中的某些烃类能直接或间接溶于细胞膜 的亲脂区而进入膜内；二是烷烃和环烷烃的生物降解；三是芳香烃、烯烃、炔烃的生物 降解。
微生物在修复过程中有诸多的影响和制约因素，主要包括微生物的降解能 力、石油污染土壤的理化性质、环境条件等。目前研究内容主要集中在三方面一是选 育高效的石油烃降解菌；二是探究微生物修复的最佳环境条件；三是研发一系列原位和 异位的微生物修复技术。
国内外进行的生物修复未取得十分理想的效果，其原因在于油田污染的土壤不 仅含油量高而且含盐量也很高(比如胜利油田的土壤含盐量9-20g/Kg高达未污染土壤的 8-17倍)，高盐度加大了土壤生物修复的难度，使得常规菌种达不到很好的处理效果。 如参考文献1:姜昌亮，孙铁衍，李培军，等.石油污染土壤长料堆式异位生物修复技术 研究[J].应用生态学报，2001，12(2) 279-282中记载了采用堆肥法对辽河油田4种不 同类型的石油污染土壤进行了处理，当土壤中石油烃总量(TPH)为4.16-7.72g/100g 土 时，经过53天的运行，TPH去除率达到45.2% 56.7%。如参考文献2 Fllis B.Harold P.EnvironmentalTechnology, 1992，12 447-459 中记载了 Fllis 等用具有滤液收集和 水循环系统的预制床对斯德歌尔摩中部油污土壤进行治理，土壤中多环芳烃的浓度从 1024.4mg/kg降至324.1mgAg，降解率为68%。参考文献3 王丹昶，杨怀杰，刘勇， 等.油泥(砂)处理和综合利用技术研究[J].西南民族大学学报(自然科学版)，2003， 29 19-23中记载了王丹昶等选择2219井油泥砂，采用美国微生物公司提供的菌种(油 乐宝)和不投加菌种空白对比实验，进了现场试验，试验结果表明对含油量为73660mg/ kg的油泥砂投加菌种(油乐宝)60天后含油最降解率为23.3%。
有研究表明当土壤中盐浓度为6g/Kg时，大多数植物，特别是栽培植物就不能 正常生长或完全不能生长了，此外，土壤本身属于固相介质，这一特点决定其中盐度分 布的不均勻性，0-5cm的表层土壤往往盐度最高，这不仅由于表层所受的污染最严重， 而且其中的水分蒸发量也最大；受油污、水分蒸发、植物吸收水分的影响，5-25cm的土层盐分也比深层土壤的要高。上述原因导致了局部土壤尤其是有盐析出部位的盐度大大 高出所测定的土壤平均盐度。
发明内容
针对现有技术存在的问题，为解决石油污染土壤中的高盐度对微生物的抑制作 用，普通微生物无法用于高盐度石油污染土壤的生物处理，本发明提供一种石油污染土 壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，经该筛选及修复方法所筛选得到的生物修复菌剂可 应用于含盐量10 20g/Kg石油污染土壤的生物降解；嗜盐菌强化的石油污染土壤生物 修复菌剂筛选及修复方法具有很高的实用价值，可广泛应用在用于石油污染土壤、海岸 沙滩、采油废水等生物修复领域。一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，具体包括以下几个步骤步骤一石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集；取距油田采油废水排放口处的石油污染土壤作为石油降解土著菌菌源；取距油 田采油废水处理厂出水口的采油废水和污水处理厂活性污泥作为嗜盐菌菌源。步骤二 石油降解土著菌的筛选；(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有IOOmL无菌水的锥形瓶 (内含玻璃珠)中，并置于振荡培养箱中室温振荡0.5 2h，振荡频率为200rpm。(2)从无菌水的锥形瓶中取5mL溶液，加入IOOmL梯度筛选培养液A中37°C， 150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液A为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养基和Ig/ L原油。(3)当梯度筛选培养液A浑浊时，从梯度筛选培养液A中取5mL转接至IOOmL 梯度筛选培养液B中37°C，150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液B为质量浓度为 50%牛肉膏蛋白胨培养基和2g/L原油的混合溶液。(4)当梯度筛选培养液B浑浊时，从梯度筛选培养液B中取5mL转接至IOOmL 梯度筛选培养液C中37°C，150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液C为质量浓度为 25%牛肉膏蛋白胨培养基和3g/L原油的混合溶液。(5)当梯度筛选培养液C浑浊时，从梯度筛选培养液C中取5mL转接至IOOmL 无机盐培养基中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐培养基变浑浊时，得到以石油为唯一 碳源的石油降解土著菌，并冷藏。所述的无机盐培养基成分每IOOOmL去离子水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g,无水 CaCl20.02g，FeSO4O-Olg, MnSO4 · H20 0.01g,原油 4g，pH = 7.0, 121°C灭菌 20min。步骤三嗜盐菌的筛选；取活性污泥和采油废水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培养基培养，经梯度 驯化筛选得到可在1-10%盐浓度环境下生长良好的嗜盐菌复合菌系，并利用嗜盐菌复合 菌系制备菌体浓度IO8 IO9个/ml的混合嗜盐菌培养液。步骤四石油降解嗜盐菌的筛选；以石油为唯一碳源，以质量浓度为1.0% 10.0%为盐梯度，由嗜盐菌复合菌系 和石油污染土壤，筛选耐盐范围广的石油降解嗜盐菌。
(1)嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液的筛选(A)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有IOOmL无菌水的锥形瓶 (内含玻璃珠)中，并置于振荡培养箱中200rpm，室温振荡0.5_2h。(B)从无菌水的锥形瓶中取5mL，加入IOOmL富集培养液A中，每瓶加入混合 嗜盐菌培养液5mL，于37°C，150rpm摇瓶培养。所述的富集培养液A为质量浓度75% 牛肉膏蛋白胨培养基、lg/L原油、质量浓度1.0% NaCl的混合溶液。(C)当富集培养液A浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL富集培养液B中， 37°C，150rpm摇瓶培养，所述的富集培养液B为质量浓度50%牛肉膏蛋白胨培养基、 2g/L原油含质量浓度1.0% NaCl的混合溶液。(D)当富集培养液B浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL富集培养液C中摇瓶 培养，所述的富集培养液C为质量浓度25%牛肉膏蛋白胨培养基、3g/L原油含质量浓度 1.0% NaCl的混合溶液。(E)当富集培养液C浑浊时，从中取5mL转接至无机盐富集培养液A中摇瓶培 养，所述的无机盐富集培养液A为无机盐培养基和1.0% NaCl，当无机盐富集培养液A变 浑浊时，得到以石油为唯一碳源的嗜盐度为的石油降解嗜盐菌的培养液。(2)从嗜盐度为的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培 养液B中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液A变浑浊时，得到嗜盐度为X的 石油降解嗜盐菌的培养液。所述的无机盐富集培养液B为无机盐培养基含质量浓度为X 的NaCl溶液。(3)从嗜盐度为X的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培养 液C中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液C变浑浊时，得到嗜盐度为Y的石 油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液B为无机盐培养基含质量浓度为Y的 NaCl 溶液，且 1.0%< X < Y < 10.0%。(4)从嗜盐度为Y的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培养 液D中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液D变浑浊时，得到嗜盐度为Z的石 油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液D为无机盐培养基含质量浓度为Z的 NaCl 溶液，且 1.0%< X < Y < Z < 10.0%。(5)从嗜盐度为Z的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培 养液E中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液E变浑浊时，得到嗜盐度为E 的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液E为无机盐培养基含质量浓度为 10.0% 的 NaCl 溶液。(6)将得到的嗜盐度为1.0%、X、Y、Z和10.0%的石油降解嗜盐菌按照相同体
积比混合，得到石油降解嗜盐菌复合菌剂。步骤五石油污染土壤修复的高效菌剂筛选；(1)步骤三中得到的嗜盐度石油降解嗜盐菌复合菌剂利用相应的盐度平板活化， 并与步骤二中得到的石油降解土著菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基振荡培养至菌体浓度 均大于每毫升IO9个，离心收集菌体制备得到两种发酵菌液。(2)取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混 勻后，将土壤平铺成2cm的薄层。
C3)将土壤分别装入花盆中，测定土壤中的油含量和含盐量，分别接种石油降 解土著菌的发酵菌液和石油降解嗜盐菌复合菌剂的发酵菌液；投菌量为每克土壤中含有 IO6 IO8个菌落，并每10-15天投加一次。
(4)向土壤中每隔10 15天投加一次营养物质，充分混勻，并调节土壤的pH 值和湿度；所述的营养物质为蔗糖和硝酸钾，每次投加的量为每千克土壤中投加1 IOg 蔗糖，每千克土壤中投加2 16g硝酸钾，并每天调节土壤的含水量，使土壤的湿度为 20% 40%，调节土壤的pH = 7 8。
(5)通过重量法测每个花盆中的含油量，利用平板技术法测定菌体的浓度，测定 并调节土壤的pH值，7周时间后，测定每个花盆中土壤中石油的降解率，得到降解率最 高的高效菌剂。
步骤六利用正交修复实验选取高效降解菌剂修复的优化条件
利用正交修复实验分别选取投菌量、湿度、投加蔗糖量和加硝酸钾量投菌量作 为高效菌剂修复的影响因素，其中投菌量为每克土壤中投加IO6 IO8个菌体，湿度为 20% 40%，投加蔗糖量为每千克土壤1 10g，投加硝酸钾量为每千克土壤2 16g。 (1)利用筛选得到的高效菌剂进行正交修复实验，首先用相应的盐度平板活化，再采用牛 肉膏蛋白胨培养基培养至菌体浓度大于每毫升IO9个，离心收集菌体制备得到发酵菌液。
(2)取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混 勻后，将土壤平铺成2cm的薄层，调节土壤的pH = 7 8。
(3)将土壤分别装入花盆中，通过重量法测一下每个花盆中的含油量和含盐量。
(4)控制每个花盆中投菌量为每克土壤中投加IO6 IO8个菌体，湿度为20% 40%,投加蔗糖量为每千克土壤中1 10g，投加硝酸钾量为每千克土壤中2 16g ；并 每10 15天向土壤中投加高效菌剂、蔗糖和硝酸钾来保证土壤中菌体和营养物质的含 量，湿度通过早晚喷水控制。
(5)每隔7天通过重量法测一下每个花盆中的含油量，每隔7天利用平板技术法 测定菌体的浓度，每隔3天测定并调节土壤的pH值，7周时间后，测定每个花盆土壤中 石油的降解率，得到降解率最高的修复条件。
本发明具有以下优点
1、本发明公开的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，所筛选培 养的菌体可以在6% -10%盐浓度环境下良好生长，这为含盐量高的石油污染土壤的修复 提供了菌源保证；
2、本发明公开的石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法其最佳修复条 件为湿度40%;投菌量IO8个/g 土壤；在修复前2周的最佳投加硝酸钾量为16g/kg 土 壤，中后期即修复第3周开始后投加硝酸钾量为相/kg 土壤；在修复前3周投加蔗糖量为 5-10g/kg 土壤，中后期即修复第4周开始后最佳投加蔗糖量为l_5g/kg 土壤。修复7周 后对于含盐量高达10g/Kg、油含量为16%的土壤除油率达64.31%，修复效果较高；
3、本发明公开的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，可在含 盐量较高的石油污染土壤中存活，并能利用石油作为碳源进行代谢，在石油污染土壤修 复、含油废水等环境保护领域具有一定的应用前景。
图1 本发明中石油降解土著菌与石油降解嗜盐菌的降解率随时间变化图；图2 本发明提出的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法中石油 降解土著菌的筛选流程图；图3 本发明提出的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法中石油 降解嗜盐菌的筛选流程图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。本发明提出的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，具体包括以 下几个步骤步骤一石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集；取距油田采油废水排放口处的石油污染土壤作为石油降解土著菌菌源；取距油 田采油废水处理厂出水口的采油废水和污水处理厂活性污泥作为嗜盐菌菌源。步骤二 石油降解土著菌的筛选，如图2所示；(1)从9处采样点采集的土样各取2g，分别加入9个盛有IOOmL无菌水的锥 形瓶(内含玻璃珠)中，将9瓶土壤溶液置于振荡培养箱中室温振荡0.5-2h，振荡频率 200rpm。(2)从每瓶无菌水的锥形瓶中取5mL溶液，分别加入IOOmL梯度筛选培养液A 中37°C，150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液A为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养 基和lg/L原油的混合溶液。(3)当梯度筛选培养液A浑浊时，从梯度筛选培养液A中取5mL转接至IOOmL 梯度筛选培养液B中37°C，150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液B为质量浓度为 50%牛肉膏蛋白胨培养基和2g/L原油的混合溶液。(4)当梯度筛选培养液B浑浊时，从梯度筛选培养液B中取5mL转接至IOOmL 梯度筛选培养液C中37°C，150rpm摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液C为质量浓度为 25 %牛肉膏蛋白胨培养基和3g/L原油的混合溶液。(5)当梯度筛选培养液C浑浊时，从梯度筛选培养液C中取5mL转接至IOOmL 无机盐培养基中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐培养基变浑浊时，得到以石油为唯一 碳源的石油降解土著菌。(6)将得到的9组对应为9处采样点的以石油为唯一碳源的石油降解土著菌，分 别编号为 Bi、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8 和 B9，并于 4°C冷藏。所述的无机盐培养基成分每IOOOmL水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g，无水 CaCl20.02g，FeS040.01g，MnSO4 · H2O O.Olg，原油 4g，pH = 7.0, 121°C灭菌 20min。步骤三嗜盐菌的筛选取活性污泥和采油废水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培养基培养，经梯度 驯化筛选得到可在1-10%盐浓度环境下生长良好的嗜盐菌复合菌系，并利用嗜盐菌复合 菌系制备菌体浓度IO8 IO9个/ml的混合嗜盐菌培养液。
步骤四石油降解嗜盐菌的筛选；以石油为唯一碳源，以质量浓度为1.0%、2.5%, 5.0%, 7.5%, 10.0%为盐梯
度，由嗜盐菌复合菌系和石油污染土壤中筛选石油降解嗜盐菌，如图3所示。(1)嗜盐度为的石油降解嗜盐菌的培养液的筛选(A)将石油降解土著菌从9处采样点采集的土样各取2g，分别加入盛有IOOmL 无菌水的锥形瓶(内含玻璃珠)中，将9瓶土壤溶液置于振荡培养箱中200rpm，室温振 荡 0.5-2h。(B)每瓶土壤溶液各取5mL，分别加入9瓶IOOmL富集培养液A中，并向每瓶 加入混合嗜盐菌培养液5mL，37°C，150rpm摇瓶培养。所述的富集培养液A为质量浓度 75%牛肉膏蛋白胨培养基、lg/L原油、质量浓度NaCl的混合溶液。(C)当富集培养液A浑浊时，每瓶取5mL各转接至IOOmL富集培养液B中 37°C，150rpm摇瓶培养，所述的富集培养液B为质量浓度50 %牛肉膏蛋白胨培养基、 2g/L原油和质量浓度NaCl的混合溶液。(D)当富集培养液B浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL富集培养液C中37°C， 150rpm摇瓶培养，所述的富集培养液C为质量浓度25%牛肉膏蛋白胨培养基、3g/L原油 和质量浓度1.0% NaCl的混合溶液。(E)当富集培养液C浑浊时，从中取5mL转接至无机盐富集培养液A中摇瓶培 养，所述的无机盐富集培养液A为无机盐培养基含质量浓度为1.0% NaCl的溶液，当无 机盐富集培养液A变浑浊时，得到9组以石油为唯一碳源，嗜盐度为1.0%的石油降解嗜 盐菌的培养液。(2)从9种嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液中各取5ml，分别依次转接 至含盐2.5%的无机盐富集培养液B中37°C，150rpm摇瓶培养，，当无机盐富集培养液B 变浑浊时，得到9组以石油为唯一碳源，嗜盐度为2.5%的石油降解嗜盐菌的培养液。所 述的无机盐富集培养液B为无机盐培养基含质量浓度为2.5% NaCl的溶液。(3)从嗜盐度为2.5%的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培 养液C中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液A变浑浊时，得到嗜盐度为5.0% 的石油降解嗜盐菌的培养液。所述的无机盐富集培养液C为无机盐培养基含质量浓度为 5.0%的NaCl溶液。(4)从嗜盐度为5.0%的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集培 养液D中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液D变浑浊时，得到嗜盐度为7.5% 的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液D为无机盐培养基含质量浓度为 7.5%的NaCl溶液。(5)从嗜盐度为7.5%的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至无机盐富集 培养液E中37°C，150rpm摇瓶培养，当无机盐富集培养液E变浑浊时，得到嗜盐度为 10.0%的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液E为无机盐培养基含质量浓 度为10.0%的NaCl溶液。(6)将从9处采样点对应的五种嗜盐度1%、2.5%, 5.0%, 7.5%和10.0%的45 组石油降解嗜盐菌按照同一采样点的石油降解嗜盐菌进行混合，得到对应于9处采样点 的9组石油降解嗜盐菌，编号分别为Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9，且4°C冷藏。步骤五石油污染土壤修复高效菌剂的筛选；(1)将嗜盐度为1.0%、2.5%, 5.0%, 7.5%和10%的石油降解嗜盐菌用相应的 嗜盐度平板活化，并与石油降解土著菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基在30°C，150rpm条 件下振荡培养至菌体浓度均大于每mL109个，离心收集菌体制备得到两种发酵菌液。(2)取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混 勻后，将土壤平铺成2cm的薄层。(3)将土壤分别装入花盆中，测定土壤中的油含量和含盐量。设定其中1个花盆 为对照盆，不接菌，其余花盆中分别接种石油降解土著菌的发酵菌液和嗜盐度为1.0%、 2.5%, 5.0%, 7.5%和10.0%的石油降解嗜盐菌的发酵菌液；投菌量为每克土壤中含有 IO6 IO8个菌落(CFU)，且每10-15天投加一次。向土壤中每隔10-15天投加一次营养 物质，充分混勻。所述的营养物质为蔗糖和硝酸钾，每次投加的量为每千克土壤中投加 1 IOg蔗糖，每千克土壤中投加2 16g硝酸钾；并每天调节土壤的含水量，使土壤的 湿度为20% 40%，调节土壤的pH = 7 8。试验条件如表1所示，试验过程中测定 的参数如表2所示表1 土壤修复试验条件
权利要求
1. 一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其特征在于包括以下几个步骤步骤一石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集；取距油田采油废水排放口处的石油污染土壤作为石油降解土著菌菌源；取距油田采 油废水处理厂出水口的采油废水和污水处理厂活性污泥作为嗜盐菌菌源；步骤二石油降解土著菌的筛选；(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有IOOmL无菌水的锥形瓶，并 置于振荡培养箱中室温振荡0.5 2h，振荡频率为200rpm ；(2)从无菌水的锥形瓶中取5mL溶液，加入IOOmL梯度筛选培养液A中摇瓶培养， 所述的梯度筛选培养液A为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养基和lg/L原油的混合溶液；(3)当梯度筛选培养液A浑浊时，从梯度筛选培养液A中取5mL转接至IOOmL梯度 筛选培养液B中摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液B为质量浓度为50%牛肉膏蛋白胨培 养基和2g/L原油的混合溶液；(4)当梯度筛选培养液B浑浊时，从梯度筛选培养液B中取5mL转接至IOOmL梯度 筛选培养液C中摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液C为质量浓度为25%牛肉膏蛋白胨培 养基和3g/L原油的混合溶液；(5)当梯度筛选培养液C浑浊时，从梯度筛选培养液C中取5mL转接至IOOmL无机 盐培养基中摇瓶培养，当无机盐培养基变浑浊时，得到以石油为唯一碳源的石油降解土 著菌，并冷藏；步骤三嗜盐菌的筛选；取活性污泥和采油废水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培养基培养，经梯度驯化 筛选得到盐度为 20%嗜盐菌复合菌系，并利用嗜盐菌复合菌系制备菌体浓度IO8 IO9个/ml的混合嗜盐菌培养液；步骤四石油降解嗜盐菌的筛选；(1)嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液的筛选(A)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有IOOmL无菌水的锥形瓶中， 并置于振荡培养箱中室温振荡；(B)从无菌水的锥形瓶中取5mL，加入IOOmL富集培养液A中，并向其中加入混合 嗜盐菌培养液5mL中摇瓶培养，所述的富集培养液A为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养 基、lg/L原油和1.0% NaCl的混合溶液；(C)当富集培养液A浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL富集培养液B中摇瓶培养， 所述的富集培养液B为质量浓度50%牛肉膏蛋白胨培养基、2g/L原油和1.0% NaCl的混 合溶液；(D)当富集培养液B浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL富集培养液C中摇瓶培养， 所述的富集培养液C为质量浓度25%牛肉膏蛋白胨培养基、3g/L原油和1.0% NaCl的混 合溶液；(E)当富集培养液C浑浊时，从中取5mL转接至IOOmL无机盐富集培养液A中摇瓶 培养，所述的无机盐富集培养液A为无机盐培养基和质量浓度为1.0% NaCl的混合溶液， 当无机盐富集培养液A变浑浊时，得到以石油为唯一碳源的嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液；(2)从嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至IOOmL无机盐富 集培养液B中摇瓶培养，当无机盐富集培养液B变浑浊时，得到嗜盐度为X的石油降解 嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液B为无机盐培养基含质量浓度为X的NaCl溶 液，且 1.0%< X < 10.0% ；(3)从嗜盐度为X的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至IOOmL无机盐富集培 养液C中摇瓶培养，当无机盐富集培养液C变浑浊时，得到嗜盐度为Y的石油降解嗜盐 菌的培养液；所述的无机盐富集培养液C为无机盐培养基含质量浓度为Y的NaCl溶液， 且 1.0%< X < Y < 10.0% ；(4)从嗜盐度为Y的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至IOOmL无机盐富集培 养液D中摇瓶培养，当无机盐富集培养液D变浑浊时，得到嗜盐度为Z的石油降解嗜盐 菌的培养液；所述的无机盐富集培养液D为无机盐培养基含质量浓度为Z的NaCl溶液， 且 1.0%< X < Y < Z < 10.0% ；(5)从嗜盐度为Z的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至IOOmL无机盐富集培 养液E中摇瓶培养，当无机盐富集培养液E变浑浊时，得到嗜盐度为E的石油降解嗜盐 菌的培养液；所述的无机盐富集培养液E为无机盐培养基含质量浓度为10.0%的NaCl溶 液；(6)将得到的嗜盐度为1.0%、X、Y、Z和10.0%的石油降解嗜盐菌按照相同体积比 进行混合，得到石油降解嗜盐菌复合菌剂；步骤五石油污染土壤修复的高效菌剂筛选；(1)步骤三中得到的石油降解嗜盐菌复合菌剂利用相应的盐度平板活化，并与步骤二 中得到的石油降解土著菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基振荡培养至菌体浓度均大于每毫 升IO9个，离心收集菌体制备得到两种发酵菌液；(2)取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混勻 后，将土壤平铺成薄层；(3)将土壤分别装入花盆中，测定花盆中土壤的含油量和含盐量，调节土壤的pH值 和湿度；向花盆中分别接种石油降解土著菌的发酵菌液和石油降解嗜盐菌复合菌剂的发 酵菌液；投菌量均为每克土壤中含有IO6 IO8个菌落，并每10 15天投加一次；(4)向花盆中每隔10 15天投加一次营养物质，充分混勻，并每天调节土壤的pH 值和湿度；(5)通过重量法测每个花盆中的含油量，利用平板技术法测定菌体的浓度，测定并调 节土壤的pH值，7周时间后，测定每个花盆中土壤中石油的降解率，得到降解率最高的 高效菌剂；步骤六高效菌剂的修复；利用正交修复实验分别选取投菌量、湿度、投加蔗糖量和硝酸钾量作为高效菌剂的 修复条件，其中投菌量为每克土壤中投加IO6 IO8个菌体，湿度为20% 40%，投加蔗 糖量为每千克土壤1 10g，投加硝酸钾量为每千克干土 2 16g;最后得到石油污染土 壤生物修复菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其特征在于所述的无机盐培养基成分每IOOOmL去离子水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g,无水 CaCl20.02g，FeSO4O-Olg, MnSO4 · H20 0.01g,原油 4g，pH = 7.0, 121°C灭菌 20min。
3.根据权利要求1所述的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其特征 在于所述的步骤六中所述的修复具体过程为(1)利用筛选得到的高效菌剂进行正交修复实验，首先用相应的盐度平板活化，再采 用牛肉膏蛋白胨培养基培养至菌体浓度大于每毫升IO9个，离心收集菌体制备得到发酵菌 液；(2)取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混勻 后，将土壤平铺成2cm的薄层，调节土壤的pH = 7 8;(3)将土壤分别装入花盆中，通过重量法测定每个花盆中的含油量和含盐量；(4)控制每个花盆中投菌量为每千克土壤中投加IO6 IO8个菌体，湿度为20% 40%,投加蔗糖量为每千克土壤中1 10g，投加硝酸钾量为每千克土壤中2 16g ；并 每10 15天向土壤中投加高效菌剂、蔗糖和硝酸钾来保证土壤中菌体和营养物质的含 量，湿度通过早晚喷水控制；(5)每隔7天通过重量法测定每个花盆中的含油量，每隔7天利用平板技术法测一下 菌体的浓度，每隔3天测定并调节土壤的pH值，7周时间后，测定每个花盆土壤中石油 的降解率，得到降解率最高的修复条件。
4.根据权利要求1或3所述的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其 特征在于所述的石油污染土壤生物修复菌剂的修复条件为应用石油降解嗜盐菌复合 菌剂降解时湿度为40%，投菌量为IO8个/g 土壤；在修复前2周的硝酸钾投加量为16g/ kg土壤，第3周开始后硝酸钾投加量为8g/kg 土壤；在修复前3周蔗糖投加量为5 IOg/ kg 土壤，第4周开始后蔗糖投加量为1 5g/kg 土壤。
5.根据权利要求1所述的一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其特征 在于所述的步骤四中X = 2.5%，Y = 5.0%, Z = 7.5%。
全文摘要
本发明提供一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，具体包括石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集、石油降解土著菌的筛选、嗜盐菌的筛选、石油降解嗜盐菌的筛选、石油污染土壤修复的高效菌剂筛选和利用正交修复实验选取高效降解菌剂修复的优化条件六个步骤。经该筛选及修复方法所筛选得到的生物修复菌剂可应用于含盐量10～20g/Kg石油污染土壤的生物修复；本发明公开的石油污染土壤生物修复菌剂筛选及修复方法具有很高的实用价值，可广泛应用在用于石油污染土壤、海岸沙滩、采油废水等生物修复领域。
文档编号C12N1/20GK102021132SQ20101055249
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年12月3日
发明者杨玉楠, 韩冬 申请人:北京航空航天大学