专利名称：从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交总rna的方法
技术领域：
本发明属于一种从动物脂肪组织中提取总RNA的方法，特别是一种涉及到提取动 物脂肪组织中总RNA样品用于基因芯片研究的方法。
背景技术：
脂肪组织不仅是机体的能量储存库，还是体内最大的内分泌器官。动物脂肪组织 在生后初期有细胞数量的增生，但仍以细胞体积的增大为主，特别是在后期或成年期极易 在体内贮积。脂肪代谢包括脂肪动员(脂肪降解)、体内运转和脂肪贮存(脂肪合成)。动 物体脂的沉积量是脂肪合成代谢和分解代谢的一种平衡状态。当合成代谢增强，或分解代 谢降低时，会打破原有的平衡而导致脂肪沉积量的增加。当脂肪分解多于合成时，则体内脂 肪减少。深入了解脂肪代谢的调控机制，将有助于控制动物脂肪的沉积量和提高胴体品质。 为了寻找调控指脂肪沉积的关键新基因，将采用基因芯片、生物信息学分析、等现代分子生 物学技术筛选一批与肌内脂肪沉积相关的差异表达新基因，而其首要任务则为高质量、高 纯度RNA的提取。目前RNA的提取技术已非常成熟，也有大量利用各种方法和商业化试剂成功提取 高质量RNA的文献报道，尽管这些方法和试剂具有诸多优点，如方法简单、提取的RNA质量 高等，但当遇到组织RNA的丰度极低，且RNA产品中常伴有基因组DNA污染等问题时，按照 常规步骤操作往往不能取得理想的结果；由于组织的特异性，脂肪组组织富含脂类物质，单 位体积细胞数较少，成熟脂肪细胞内含有各种细胞器、细胞核以及与其他类型细胞不同的 一个大的中央脂滴。且单位细胞RNA含量也相对较少，每毫克组织样品所含总RNA的量小 于0. 05 μ g，因而所提RNA的得率较低，这增加了从脂肪组织提取RNA的难度。而且用于基 因芯片的脂肪组织中的RNA—般都是用试剂盒提取的，价格比较昂贵，试剂盒的购买都是 来自国外，购买起来也十分不方便。因此，摆脱试剂盒的束缚，寻求一种常规、经济和快捷的 方法提取动物脂肪组织中的总RNA以用于基因芯片研究，并且在实际操作中应根据试验的 需要选择或改进相应的方法，以期达到预期的目的，显得尤为迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种方便、快捷的从动物脂肪组织中提取用于基 因芯片杂交的总RNA的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂 交的总RNA的方法，包括以下步骤1)、组织研磨和Trizol裂解选择以下任意一种方式取0. 4 0. 6g液氮速冻脂肪，于液氮条件下研磨成组织粉末，然后将组织粉末用 5ml Trizol进行充分裂解，得裂解组织；取Ig的脂肪，于液氮条件下进行研磨；然后加入9 Ilml的Trizol进行裂解，得裂解组织；2)、氯仿抽提在裂解组织中加入1. 8 2. 2ml氯仿进行RNA提取，剧烈震荡后于 4°C高速离心15min ；3)、氯仿再次抽提取步骤2)所得的上清，加入氯仿，氯仿与上清的体积比为 1 2 4;剧烈震荡后于4°C高速离心15min;4)、异丙醇沉淀取步骤3)所得的水相(位于上层)，加入与水相等体积的异丙 醇，均勻混合(轻柔上下颠倒5-6次)后，然后于冰上放置5分钟，再4°C高速离心IOmin ；5)、总RNA洗涤在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75%的乙醇，将沉淀吹打 悬浮，于4°C高速离心8min ；质量浓度75%的乙醇是步骤1)中Trizol体积的55 65% ；6)、总RNA溶解将步骤5)所得的沉淀于室温超净台内进行干燥，得总RNA沉淀； 再用RNase-free水溶解总RNA沉淀。作为本发明的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法的改进 步骤2) 5)中的高速离心的速度为15300Xg。作为本发明的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法的改进 步骤1) 步骤6)在无RNA酶污染状态下进行。且上述所有步骤连续无间隔的进行；若因 突发事件无法继续试验，可暂将Trizol裂解后的组织液(即步骤1)所得的裂解组织)直 接保存于-80°C保存。在本发明中，步骤3)为必须的一个关键步骤。在本发明中，动物是是畜类，优选猪。本发明方法的检测结果表明所得总RNA样品完全满足RT-PCR、构建cDNA文库， 制基因芯片等相关实验的要求，为进一步从分子水平研究猪脂肪沉积及其代谢特性提供方 法上的参考依据。本发明具有如下有益效果1.通过此方法提取的总RNA，质量高，Ig脂肪组织中约可提出120 μ g总RNA，浓度 达1 μ g/μ 1，可以完全满足并可直接用于后续研究基因芯片杂交用。2.本方法操作简单，所用试剂经济实惠，方法简单易行。3、本方法相对于昂贵的试剂盒提取总RNA用于基因芯片实验，成本低。
结合附图对本发明的具体实施方案作进一步详细说明图1是本发明的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解结果；图 2 是 Agilent 2100bioanalyzer 检测 RNA 的完整性结果。
具体实施例方式实施例1、一种从猪皮下脂肪中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，依次进行 以下步骤，下述步骤1) 步骤6)均在无RNA酶污染的状态下进行1)、组织研磨和Trizol裂解将猪皮下脂肪组织切取IOOmg左右放入研钵，在液氮环境中研成粉末，装入1. 5ml 的印pendorf管，再加入Iml的Trizol剧烈摇晃约5min ；使其充分裂解，得裂解组织；
2)、氯仿抽提在步骤1)所得的裂解组织中加入200 μ 1氯仿进行RNA提取，剧烈振荡3分钟待 其充分混合后，于室温放置5min，再于4°C，15300rmp离心15min ；离心后可见明显分层，吸 取上层清澈液体(即上清，约600 μ 1)；3)、氯仿再次抽提在步骤2)所得的上清中加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡片刻(约3分钟)后，于室温 放置5min，于4°C，15300rmp离心15min，离心后可见明显分层，吸取上层清澈液体(作为水 相，约 500 μ 1)；4)、异丙醇沉淀在步骤3)所得的水相中加入等体积的异丙醇轻轻混勻(轻柔上下颠倒5-6次)， 然后于冰上放置5分钟，再于4°C，15300rmp离心IOmin ；5)、总 RNA 洗涤弃步骤4)所得的上清，在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75%乙醇(经DEPC 处理，无RNA酶)0. 6ml，振荡混勻后，4°C，15300rmp离心8min ；6)、总 RNA 溶解弃步骤5)所得的上清，将步骤5)所得的沉淀用滤纸吸干残余液体，置超净台面自 然风干(约20min左右)；加入20 30 μ 1 RNase-free水溶解。实施例2、提取的总RNA浓度测定和以期用于基因芯片杂交的质量检测(以实施例 1所得的溶液作为样品)l)nanodrop-1000spectrophotometry 测定样品在 260、280 及 230nm 的光密度及 RNA浓度，并计算RNA的纯度。2)电泳检测① RNA 变性取 RNase-free 1. 5ml 离心管，加入 1. 5 μ L RNA, 5. 5 μ L RNA变性缓冲液，65°C变性20min，稍离心，加入1. 5μ L 6 X loading buffer (RNA专用)。②琼脂糖凝胶电泳配制2%的琼脂糖凝胶，100V恒压，IOmin电泳。③RNA电泳 图拍照及分析。3) RNA完整性分析Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA的完整性，并对RNA质量 进行评分。总RNA质量检测结果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry进行检测，所获 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之间，OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.60-1. 90之间。RNA浓度在eOO-lOOOng/yL之间。所获得的浓度及产量完全满足基因芯 片杂交的要求。因此，可推算得知实施例1所得的总RNA为12 20 μ g。通过电泳结果检测，发现RNA基本没有降解，电泳条带清晰无拖尾现象，且纯度 高、完整性好。进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性好，总RNA质量评分均在8. 0以上， 完全可满足并可直接用于基因芯片杂交的要求。上述样品耗费不超过10元，大大节约了成 本。对比例1、将同实施例1的IOOmg左右的猪皮下脂肪组织按照目前常规的Trizol/ 氯仿一次性12000 Xg离心提取法提取RNA，结果如下总RNA质量检测结果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry进行检测，所获得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之间，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.00-1. 30之间。所提取的RNA量小于2 μ g。所得产物不适宜直接用于芯片杂交。
通过电泳结果检测，发现RNA基本没有降解，电泳条带较为清晰无拖尾现象，纯度
一般，完整性一般。 进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性一般，总RNA质量评分均在7. 0-8. 0 之间，不可直接用于基因芯片杂交的要求。对比例2、将同实施例1的IOOmg左右的猪皮下脂肪组织按照Qiagen公司生产的 RNeasyLipid Tissue Mini Kit试剂盒进行提取RNA (3580元/kit)，每个样品制备至少需 要70元，结果如下总RNA质量检测结果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry进行检测，所获 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之间，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1. 70-2. 00之间。约500mg的脂肪组织样品提取的RNA量约在12-25 μ g左右。所得产物可 直接用于芯片杂交。通过电泳结果检测，发现RNA完全没有降解，电泳条带清晰无拖尾现象，纯度高、 完整性好。进一步RNA完整性检测结果显示，RNA完整性好，总RNA质量评分均在8. 5-9. 5之 间，并完全满足且可直接用于基因芯片杂交的要求。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，其特征是包括以下步骤1)、组织研磨和Trizol裂解选择以下任意一种方式取0.4～0.6g液氮速冻脂肪，于液氮条件下研磨成组织粉末，然后将组织粉末用5ml Trizol进行充分裂解，得裂解组织；取1g的脂肪，于液氮条件下进行研磨；然后加入9～11ml的Trizol进行裂解，得裂解组织；2)、氯仿抽提在裂解组织中加入1.8～2.2ml氯仿进行RNA提取，震荡后于4℃高速离心15min；3)、氯仿再次抽提取步骤2)所得的上清，加入氯仿，氯仿与上清的体积比为1∶2～4；震荡后于4℃高速离心15min；4)、异丙醇沉淀取步骤3)所得的水相，加入与水相等体积的异丙醇，均匀混合后，然后于冰上放置5分钟，再4℃高速离心10min；5)、总RNA洗涤在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％的乙醇，将沉淀吹打悬浮，于4℃高速离心8min；所述质量浓度75％的乙醇是步骤1)中Trizol体积的55～65％；6)、总RNA溶解将步骤5)所得的沉淀于室温超净台内进行干燥，得总RNA沉淀；再用RNase free水溶解总RNA沉淀。
2.根据权利要求1所述的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法， 其特征是所述步骤2) 5)中的高速离心的速度为15300X g。
3.根据权利要求2所述的从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法， 其特征是所述步骤1) 步骤6)在无RNA酶污染状态下进行。
全文摘要
本发明公开了一种从动物脂肪组织中提取用于基因芯片杂交的总RNA的方法，包括以下步骤1)组织研磨和Trizol裂解；2)氯仿抽提在裂解组织中加入氯仿进行RNA提取；3)氯仿再次抽提取步骤2)所得的上清，加入氯仿抽提；4)异丙醇沉淀取步骤3)所得的水相，加入与水相等体积的异丙醇，均匀混合；5)总RNA洗涤在步骤4)所得的沉淀中加入质量浓度75％的乙醇，将沉淀吹打悬浮；6)总RNA溶解将步骤5)所得的沉淀于室温超净台内进行干燥，得总RNA沉淀；再用RNase-free水溶解总RNA沉淀。采用该方法提取用于基因芯片杂交的总RNA具有方便、快捷的特点。
文档编号C12N15/10GK101984054SQ20101055178
公开日2011年3月9日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者伍婷, 汪以真, 袁章琴 申请人:浙江大学