分析物的检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：(a)使样品与肽核酸(PNA)探针接触；(b)对样品进行电化学阻抗谱(EIS)测定；(c)根据EIS测定结果确定分析物的存在、不存在、量和/或身份；其中所述分析物包含核酸；且其中在采取样品时样品中的分析物的量与对样品进行EIS测定时样品中分析物的量基本相同。
【专利说明】分析物的检测
[0001] 本发明涉及用于检测分析物的方法，所述方法利用增强的电化学阻抗谱（EIS)技 术来获取核酸分析物的数据从而进行检测。所述方法具有优点，因为其能在无需将核酸分 析物扩增的情况下进行。这使程序得到简化，并可具有比已知检测方法高的速度，并因此能 改善时间：结果比（TTR)和促进在近患者环境中的此类检测的开发。本方法在对伤口的分 析、特别是使伤口感染的病原体的分析方面尤其有利。
[0002] 用于检测分析物的方法是生化分析领域公知的。在传统方法中，分析物被标记，通 常用可被（例如，通过荧光检测）检测到的荧光标记物来标记，以便鉴定所述分析物。
[0003] 过去几年在DNA检测领域中，使用了纳米颗粒作为标记物。这些标记物将可能用 于任何允许进行标记并涉及结合的体系，因而可以用与活细胞体系以及蛋白和核酸。已发 现纳米颗粒能克服更传统的荧光标记物的多种局限性，包括成本、易用性、灵敏度和选择 性（Fritzsche W，Taton T A, Nanotechnologyl4(2003)R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection，'）。纳米颗粒已被用于 许多不同的DNA检测方法中，包括光学检测、电学检测、电化学检测和重量分析检测 (Fritzsche ff, Taton T A, Nanotechnologyl4(2003)R63-R73 ^Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection"）。金纳米颗粒已经成功用 在DNA杂交的检测中，所述检测基于胶体金标签的电化学剥取检测（Wang J，Xu D，Kawde A,Poslky R, Analytical Chemistry (2001), 73, 5576-5581 ^Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization"）。半导 体纳米晶体（也称作量子点）和金纳米颗粒的使用也已成功地作为荧光标记物用于DNA杂 交研究（West J,Halas N, Annual Review of Biomedical Engineering, 2003,5:285-292^ ngineered Nanomaterials for Biophotonics Applications:Improving Sensing, Imaging and Therapeutics，'）。
[0004] 尽管通过在DNA检测方法中使用纳米颗粒替代此前的荧光标记物而发现了所述 优点，但是仍然需要改善所述检测方法的灵敏度和选择性，特别是检测方法的速度。虽然各 个检测方法均具有一定程度的灵敏度和选择性，但它们各自具有不同的局限性并产生了不 同的不准确度，且均都没有所需的那样快速，尤其是对于需要短时间（例如，约10分钟）取 得结果的近患者环境测试而言尤其如此。
[0005] 此外，对于这些方法，已将纳米颗粒标记与电泳结合以检测DNA (参见W0 2009/112537)。电泳被用来加速DNA在电极表面与互补探针的结合。该方法由于可比已知 检测方法具有更高的速度和灵敏度而具有优势。
[0006] 除此以外，对于价廉简便的检测方法、特别是对于近患者环境的DNA的检测方法 的需求也正在增加。为了降低成本、简化方法和提高检测速度，已知可以完全省去标记。虽 然不使用标记物的检测方法可能具有这些优点，但却难以实现标记物所提供的检测的灵活 性和灵敏性。
[0007] 在过去，曾考虑用电化学阻抗谱（EIS)技术来在使用或不使用标记物的情况下获 得分析物的数据。以下参考文献提供了背景细节：
[0008] EIS 对于生物传感的应用的综述-Daniels，J. S.，Pourmanda，N.，"Label-Free Impedance Biosensors:Opportunities and Challenges"，Electroanalysis，19,2007, 123 9-1257。
[0009] EIS 对于生物传感的应用的综述-Katz，E.，Willner，I.，"Probing Biomolecular Interactions at Conductive and Semiconductive Surfaces by Impedance Spectroscopy: Routes to Impedimetric Immunosensors，DNA-Sensors，and Enzyme Biosensors"，Electroanalysisl5, 2003, 913-947。
[0010] 不同尺寸的纳米级电极在KC1溶液中的阻抗谱的表征-Laureyn, W. , Van Gerw en，Ρ·，Suls，J.，Jacobs，Ρ·，Maes，G.，Electroanalysis，13, 2001，204-211。
[0011] 用于检测酶活性的 AC 阻抗和谱-Laureyn，W.，Van Gerwen，Ρ·，Suls，J.，Jacob s，P.，Maes，G.，Electroanalysis，13, 2001，204-211。
[0012] 整合系统中的 AC 阻抗和 IDE --Zou，Z.，Kai，J.，Rust，M. J.，Han，J.，Ahn，C. H. , "Functionalized nano interdigitated electrodes arrays on polymer with integrated microfluidics for direct bio-affinity sensing using impedimetric measurement. " Sens. Acts. A，136, 2007, 518 - 526。
[0013] " In si tu hybridization of PNA/DNA studied label-free by electrochemical impedance spectroscopy"，J Liu, S. Tian, P. Nielsen, W. Knoll, Chem. Commun.，2005, 2969-2971。
[0014] 就此能够看出，AC阻抗测定（也称作电化学阻抗谱，或EIS)通常涉及在两个电极 之间应用正弦小振幅（?10mV)交流电压扰动以及测定在其间所产生的作为AC频率的函 数的电流，由此可以计算作为频率的函数的阻抗。此类阻抗谱的变化已据显示可对在电极 的特定表面膜中的探针-靶标结合提供灵敏的无标记物的测定方法，特别是在使用叉指形 电极（IDE)(例如叉指形微型电极（IME)或叉指形纳米电极（INE))时尤其如此。然而，这 些测定通常依赖于分析物与电极的结合的平衡、或分析物与附接至电极的探针的结合的平 衡，因为这决定着结合在层中的靶标的量。EIS相应因此遵循平衡热力学。该程序需要平 衡较长的时间，通过为数小时，且有时候需要在升高的温度下进行，以确保测定前完全的探 针-靶标结合。这就排除了快速的时间：结果比（TTR)。
[0015] 除此以外，已从理论上考虑了 IDE的阻抗响应，并且分析通常利用适当的等效电 路进行，所述等效电路在宽频率范围适配于所述响应以得到用于等效电路元件（电阻器、 电容器、沃伯格元件等）的参数，从该参数能够提取出指示电化学响应变化的特征性物理 参数（例如，扩散系数、浓度、层厚）。此外，通常采用在各频率下的连续测定。这些因素共 同增加了上文所讨论的相对较大的时间：结果比，这是因为它们均有助于延长的分析和测 定时间。
[0016] 因此，已知的EIS方法、尤其是无标记物的方法通常较慢，且对于在本发明所需的 近患者环境设定中使用不会提供令人满意的时间：结果比。US2010/0133118公开了利用 EIS在核酸检测中使用核酸探针。优选PNA探针，但也可以使用DNA探针。未采用样品的扩 增，而是通过对样品中分析物的浓缩来增强信号。该技术有助于检测灵敏度，但浓缩步骤通 常较长且涉及更为复杂的化学，这就意味着其具有与扩增步骤相同的缺陷。特别地，其不适 用于在时间：结果比极为重要的近患者环境中测试。
[0017] W02009/122159公开了用于检测包括但不限于核酸的生物传感器。其采用PNA探 针，通常用于检测mRNA和cDNA。然而，其在使用EIS进行分析之前也采用了扩增步骤。因 此，其也存在与这里所描述的其它已知方法相同的缺陷。
[0018] 在至今所描述的所有现有技术方法中，需要在检测前增加样品中核酸的量（通过 浓缩或扩增），即使在采用了更为灵敏的EIS和无标记物检测时也是如此。然而，如本文已 提及的那样，扩增技术等需要相当的时间和额外的化学和物理资源（反应材料、方法步骤、 设备等）。因此，核酸检测在速度和灵敏度很重要时呈现出独特的问题。
[0019] 本发明的目的在于克服与上述现有技术相关的问题。具体地，本发明的目的在于 提供一种以良好的灵敏度和选择性检测核酸分析物的方法，该方法还具有改善的速度以及 时间：结果比，并且价廉且易于实施。
[0020] 因此，本发明提供了用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
[0021] (a)使所述样品与肽核酸（PNA)探针接触；
[0022] (b)对所述样品进行电化学阻抗谱（EIS)测定；
[0023] (c)由EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份；
[0024] 其中所述分析物包含核酸，且其中在采取样品时所述样品中的分析物的量或浓度 与对所述样品进行EIS测定时所述样品中的分析物的量和/或浓度基本相同。
[0025] 在一些实施方式中，"在采取样品时所述样品中的分析物的量或浓度与对所述样 品进行EIS测定时所述样品中的分析物的量和/或浓度基本相同"可能仅意味着没有进行 核酸扩增步骤。因此，本发明提供了用于检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
[0026] (a)使所述样品与肽核酸（PNA)探针接触；
[0027] (b)对所述样品进行电化学阻抗谱（EIS)测定；
[0028] (c)由EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份；
[0029] 其中所述分析物包含核酸，且其中在对样品进行EIS测定前没有进行核酸扩增步 骤。
[0030] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于检测样品中的包含核酸的分析物的方 法，所述方法包括：
[0031] (a)对所述样品进行样品制备步骤以使所述核酸片段化；
[0032] (b)使所述样品与肽核酸（PNA)探针接触；
[0033] (c)对所述样品进行电化学阻抗谱（EIS)测定；
[0034] (d)由所述EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份。
[0035] 通常，样品制备步骤包括对样品加热、超声或使用限制酶处理以使核酸片段化。通 常采用加热或超声处理以避免限制酶所涉及的时间、费用和额外的试剂。在优选实施方式 中，通过加热或者其他方式使核酸片段化来制备样品，从而所得核酸序列的平均长度（或 最小长度）为：l〇〇〇bp以下（bp =碱基对）、900bp以下、800bp以下、700bp以下、600bp以 下、500bp以下、20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以 上、90bp以上、100bp以上、llObp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上、 20bp ?1000bp、30bp ?900bp、40bp ?800bp、50bp ?700bp、60bp ?600bp、70bp ?600bp、 80bp ?600bp、90bp ?600bp、100bp ?600bp、100bp ?500bp、100bp ?400bp、100bp ? 300bp、110bp?200bp以及约120bp。在该实施方式中，通常，采取样品时样品中的分析物 的量或浓度与对样品进行EIS测定时样品中的分析物的量或浓度基本相同。这通常意味着 没有进行核酸扩增步骤。
[0036] 在本发明的该方面，在样品制备步骤中进行的加工处理不受特别限制，只要其使 核酸片段化即可。通常，这使核酸序列的平均长度（或最小长度）处在上文所讨论的优选 范围内。通常但并非绝对地，所述加工处理是使核酸片段化的加热步骤。这在样品包含大 的核酸如基因组DNA(gDNA)或核糖体RNA(rRNA)时特别优选。通常，对此类大核酸的加热 导致发生片段化形成l〇〇〇bp以下的序列。常规PCR通常涉及加热以使核酸变性（将双链 转化为单链核酸以允许复制），但其在于避免片段化从而防止DNA样品的降解。这在文章 "Effect of heat denaturation of target DNA on the PCR amplification", Gene.，1993 ，123(2)，241-244页"中得以证实，其中Gustafson等声明：
[0037] "我们已显示出，在PCR反应开始时通常对模板DNA所采用的较长的变性时间（在 pH7. 0至8. 0为1至7分钟）导致模板的显著降解。这可能导致大于500bp的PCR产物的 产率显著降低多达99%。…产物产率的这种降低可能是由于模板或靶DNA因预扩增变性 (PAD)而更多降解所致。我们因此推荐在扩增较大的DNA时，不论模板溶液的起始pH为何 值，均不应将模板DNA在PCR反应前暴露于PAD"。
[0038] 因此，当应对如基因组DNA等大核酸时，已避免了可能导致片段化的处理（例如加 热处理），这是因为其存在严重缺点。然而，本发明人令人惊讶地发现，在本发明的方法中片 段化是合乎需要的：本发明人发现，片段化不会有害地干扰分析结果，而是可以提高EIS信 号，并因此有助于完全避免对分析物扩增（如通过PCR)的需要。
[0039] 加热时长和采用的温度将取决于所研究的样品的性质，还取决于周围介质的化学 性质（pH、缓冲物、盐、催化剂的存在等）。这不受特别限制，只要实现适当的片段化即可。 通常采用10秒至1小时的时间，优选30秒至30分钟、1分钟至20分钟、2分钟至15分钟 和3分钟至10分钟。通常，优选约5分钟。温度通常为60°C至100°C、70°C至99°C、80°C至 99°C、90°C至 99°C，且通常为约 95°C。
[0040] 由图20可以看出，基因组DNA在2xSSC中于95°C变性5分钟的同时导致了 DNA片 段化的增加和阻抗计信号的增加。已经对具有长杂交时间的玻璃微阵列评估了 DNA片段化 的作用，而迄今尚未研究过DNA片段化对用于阻抗计检测的基因组DNA结合的作用。如上 文所强调，已知DNA在如95°C的高温温育会导致长链DNA的片段化并降低PCR效率。据显 示，DNA热片段化会产生小于800bp的链。在不受理论束缚的情况下，对于在DNA在95°C 温育5分钟后观察到最大的EIS信号的最可能的解释是，更短的片段能够更好地接触到并 结合探针序列，而探针序列驻留在电极表面附近。对于基于EIS的核酸杂交传感而言，在片 段尺寸和信号增加之间存在着权衡。更长的片段将因其对溶液中的氧化还原探针的更强静 电效应以及通过更好地阻断隧道效应电流穿过传感层而诱导更大的信号增加；然而，长片 段的杂交效率将由于电极表面的空间位阻效应和可能的二级结构的形成而降低。在本文给 出的实施例中，关于靶标片段化时间的数据显示出存在着这种在探针长度、片段长度和EIS 信号之间的关系。片段化数据表明，长度为约120bp的靶标链长可增加 EIS信号，并因此可 以在不进行扩增的情况下促进检测核酸的能力。与此相反，与基于EIS的核酸检测相关的 许多文献报道了用短的（20bp)人工寡核苷酸获得的结果。
[0041] 在本发明的背景下，在一些实施方式中，通常在不增加样品中的分析物的量或浓 度的情况下对样品进行EIS，例如，通过避免扩增或避免将多个样品以使得分析物浓缩的方 式组合，或者避免通过除去液体介质而使样品浓缩。因此，在采取样品时样品中的分析物的 量和/或浓度与在对样品执行EIS步骤时的样品中的分析物的量和/或浓度基本相同。在 该情形中，所述量或浓度不需要绝对相同，而事实上绝对相同并非总是可能的，这是因为标 准的样品制备技术可能有时会较小程度的改变所述量或浓度。因此，基本相同是指相同的 程度可以允许采用标准样品制备技术进行核酸检测。此类标准样品制备技术可能涉及裂解 细胞和清洁样品等。还可以进行某些纯化，只要这不会导致浓缩或扩增（例如，如果从样品 除去了可能干扰检测的物质）即可。在一些实施方式中，可以在几乎不进行或不进行样品 制备的情况下将样品以粗品形式导入至PNA探针。
[0042] 因此，在一些实施方式，本发明在EIS测定之前没有使用扩增步骤也没有浓缩步 骤。因此，在这些实施方式中，与现有技术不同，并未采用PCR步骤或RTPCR步骤。
[0043] 分析物不受特别限制，只要其为核酸即可。可以对任何核酸进行分析，但在典型 的实施方式中，核酸分析物包含大的核酸，如核糖体RNA和/或基因组DNA (rRNA和gDNA)。 特别优选的是，分析物是可提供强EIS信号的类型。因此，在一些实施方式中，分析物核酸 包含1000个碱基（lkb)以上，更优选为10kb以上、100kb以上、1Mb以上和5Mb以上。如 上文所提及，通常基因组DNA可以被片段化或切割为更小的部分以有助于处理：因此，在一 些实施方式中，gDNA分析物的尺寸可以为1Mb以上、2Mb以上、3Mb以上、4Mb以上或5Mb以 上。与基因组DNA相比，核糖体RNA的尺寸可以更小，这是因为其以大量拷贝存在，这能给 出更好的EIS信号。通常，rRNA分析物可以为l.Okb以上、1. lkb以上、1.2kb以上、1.3kb 以上、1.4kb以上和1.5kb以上。作为另一种选择，rRNA分析物可以为1.6kb以上、1.7kb 以上、1. 8kb以上、1. 9kb以上、2. Okb以上或2. 5kb以上。作为再一种选择，rRNA分析物可 以为3. Okb以上、3. 5kb以上、4. Okb以上或4. 5kb以上。如上文所提及，进而优选的是，该 样品经过处理从而使核酸序列的平均长度为20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、 60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、110bp以上、120bp以上、130bp以 上、140bp以上或150bp以上。通常，加工后核酸序列的平均长度将为1000bp以下、900bp 以下、800bp以下、700bp以下、600bp以下或500bp以下，因此优选长度为30bp?1000bp、 40bp ?900bp、50bp ?800bp、55bp ?600bp、60bp ?500bp、70bp ?400bp、80bp ?300bp、 90bp ?200bp、90bp ?180bp、90bp ?150bp、100bp ?140bp、110bp ?130bp 和约 120bp。
[0044] PNA探针不受特别限制，只要其适用于检测所关注的分析物即可。因具有可提高 EIS的检测灵敏度的能力，PNA探针是理想的（见图9和图10)。选择可与靶分析物结合的 合适的PNA探针。
[0045] 通常但并非绝对地，PNA探针还包含间隔物，因此该探针包含间隔物部分和PNA部 分。间隔物部分意在优先附接于电极表面，以便使探针的PNA部分抬起离开电极的表面。这 可提高PNA探针的杂交效率。
[0046] 间隔物的性质不受特别限制，只要其不会有害地干扰PNA的杂交效率即可。然而， 在一些实施方式中，间隔物可能含有包含一个或多个以下基团的有机分子：能附接至表面 的末端基团--优选末端氨基（其可以为伯、仲或叔氨基）、末端羟基或末端巯基；烷基；烯 基；炔基；醚基；和/或羰基。间隔物基团的主链中的碳原子（直接处在电极和PNA部分之 间的原子）的数目不受特别限制，只要提供充足的空间以提高杂交效率即可。在典型实施 方式中，主链中可以有3个以上的原子、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9 个以上、10个以上、11个以上或12个以上。更通常而言，在主链中可以有5至30个原子、 或6至25个原子、或7至24个原子或者8至23个原子。更通常地，主链中的原子数可以 为9至23个、10至23个、3至18个、5至15个、5至13个和5至10个原子。
[0047] 优选的间隔物的实例包括具有下式的化合物：
[0048]
【权利要求】
1. 一种检测样品中分析物的方法，所述方法包括： (a) 使所述样品与肽核酸（PNA)探针接触； (b) 对所述样品进行电化学阻抗谱（EIS)测定； (c) 通过EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份； 其中所述分析物包含核酸； 且其中在采取所述样品时所述样品中的分析物的量与对所述样品进行所述EIS测定 时所述样品中的分析物的量基本相同。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，在步骤（b)之前对所述样品没有进行扩增步骤和/ 或没有进行浓缩步骤。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述分析物包含核糖体RNA和/或基因组DNA。
4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述分析物核酸包含1000个以上的碱 基（lkb)。
5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤（b)之前没有进行PCR步骤。
6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤（b)之前没有进行RTPCR步骤。
7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤（b)包括： (i) 对所述分析物施加交流电压； (ii) 确定在所述分析物上的EIS测定的改变的速率； (iii) 根据改变速率数据确定所述分析物的存在、不存在、身份和/或量。
8. 如权利要求7所述的方法，其中，所述EIS测定是对电子转移阻抗Ret的测定。
9. 如权利要求7或8所述的方法，其中，所述EIS测定是由在Nyquist图中求得半圆特 征的宽度而计算出的测定。
10. 如权利要求1?6中任一项所述的方法，其中，步骤（b)包括： (i) 对所述分析物施加交流电压，其中所述交流电压包含多个叠加的频率，所述多个叠 加的频率足以通过电化学阻抗谱（EIS)来判别出所述分析物的存在；和 (ii) 根据EIS数据确定所述分析物的存在、不存在、身份和/或量。
11. 如权利要求10所述的方法，其中，所述EIS数据包括由复阻抗（x+iy)获得的数据 参数，所述参数选自以下参数中的一个或多个： ?实数分量（X) ?虚数分量（y) ?模数或绝对值[r = |z| = (x2+y2)1/2] ?角[θ = tan-1 (y/x)] ?主分量1 ?主分量2。
12. 如权利要求10或11所述的方法，其中，所述多个频率在步骤（a)之前通过统计分 析和/或通过经验方法确定。
13. 如权利要求10?12中任一项所述的方法，其中，叠加的频率的最小数量是2?20。
14. 如权利要求13所述的方法，其中，叠加的频率的数量是至少3?10。
15. 如权利要求10?14中任一项所述的方法，其中，叠加的频率的数量是至少7。
16. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤（b)包括对所述EIS数据进行傅 里叶变换的步骤。
17. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，向系统中添加电解质以辅助EIS测 定。
18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述电解质是过渡金属络合物。
19. 如权利要求18所述的方法，其中，所述过渡金属络合物包括[Fe(CN)6]3V4_体系。
20. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在系统中采用液体介质以辅助EIS测 定。
21. 如权利要求20所述的方法，其中，所述液体介质是酸性或碱性的。
22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于分析两种或多于两种分 析物，并且还包括以下步骤：对每种分析物以一种或多于一种标记物进行标记，以形成能通 过其标记物而相互区分的经标记的分析物。
23. 如权利要求22所述的方法，其中，所述一种或多于一种标记物适合于光学和/或电 学检测。
24. 如权利要求23所述的方法，其中，所述标记物选自纳米颗粒、单分子、化学发光酶 和荧光团。
25. 如权利要求24所述的方法，其中，所述标记物是包含一组分子和/或原子的纳米颗 粒。
26. 如权利要求25所述的方法，其中，所述纳米颗粒选自金属、金属纳米壳、金属二元 化合物和量子点。
27. 如权利要求23?26中任一项所述的方法，其中，所述光学检测方法选自光学发射 检测、光学吸收检测、光学散射检测、光谱位移检测、表面等离子体共振成像和来自所吸附 染料的表面增强拉曼散射。
28. 如权利要求23?27中任一项所述的方法，其中，所述光学检测是光学发射检测并 且包括以下步骤：用能激发所述标记物的光照射所述经标记的分析物，和检测来自所述标 记物的光发射的频率和强度。
29. 如权利要求28所述的方法，其中，所述光是激光。
30. 如权利要求28或29所述的方法，其中，所述光选自红外光、可见光和紫外光。
31. 如权利要求30所述的方法，其中，所述光是白光。
32. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PNA探针包含间隔物部分和PNA 部分。
33. 如权利要求32所述的方法，其中，所述间隔物部分包含选自以下基团的两个或多 于两个基团：用于将所述间隔物附接至表面的末端基团；烷基；醚基；和羰基，并且/或者 其中所述间隔物部分在其主链中包含3个或多于3个原子。
34. 如权利要求32或33所述的方法，其中，所述间隔物部分包含下式：
其中，1'是能附接至表面的末端基团洱1、1?2、1?3、1? 4、1?5和1?6各自独立为有机基团；《是 整数0或1 ;x是整数0?15 ;y是整数0?15 ;z是整数0或1 ;n是整数0?10 ;m是整数 0?15 ;并且其中[n. m+w+x+y+z]是至少3。
35. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤（a)之前对所 述样品进行样品制备步骤的步骤，其中，所述样品制备步骤包括使所述核酸片段化，优选的 是其中所述样品制备步骤包括加热所述样品和/或对所述样品进行超声处理。
36. 如权利要求35所述的方法，其中，所述样品制备步骤对所述样品中的核酸进行片 段化，从而使核酸序列的平均长度为：小于l〇〇〇bp(bp =碱基对）、小于800bp、小于500bp、 20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、 lOObp 以上、llObp 以上、120bp 以上、130bp 以上、140bp 以上或 150bp 以上、20bp ?800bp、 30bp ?600bp、40bp ?500bp、50bp ?400bp、60bp ?350bp、70bp ?300bp、80bp ?250bp、 90bp ?200bp、100bp ?180bp 或者约 120bp。
37. -种用于检测包含核酸的样品中的分析物的方法，所述方法包括： (a) 对所述样品进行样品制备步骤以使所述核酸片段化； (b) 使所述样品与肽核酸（PNA)探针接触； (c) 对所述样品进行电化学阻抗谱（EIS)测定； (d) 根据所述EIS测定结果确定所述分析物的存在、不存在、量和/或身份。
38. 如权利要求37所述的方法，其中，所述核酸的长度为lOOObp以上，例如，大的核酸、 gDNA 或 rRNA。
39. 如权利要求37或38所述的方法，其中，所述样品制备步骤包括加热所述样品和/ 或对所述样品进行超声处理。
40. 如权利要求37?39中任一项所述的方法，其中，所述样品制备步骤将所述核酸 片段化，从而使所得核酸序列的平均长度为：小于lOOObp (bp =碱基对）、小于800bp、小于 500bp、20bp 以上、30bp 以上、40bp 以上、50bp 以上、60bp 以上、70bp 以上、80bp 以上、90bp 以上、lOObp以上、llObp以上、120bp以上、130bp以上、140bp以上或150bp以上、20bp? 800bp、30bp ?600bp、40bp ?500bp、50bp ?400bp、60bp ?350bp、70bp ?300bp、80bp ? 250bp、90bp ?200bp、100bp ?180bp 或者约 120bp。
41. 一种检测受试对象的伤口中的病原体的方法，所述方法包括通过执行如前述权利 要求中任一项所限定的方法来检测所述病原体的特征性核酸。
42. 如权利要求41所述的方法，其中，所述样品是自所述受试对象的伤口采取的样品。
43. 如权利要求41或42所述的方法，其中，所述受试对象是人类。
44. 如权利要求41?43中任一项所述的方法，其中，所述病原体是对治疗具有抗性的 病原体。
45.如权利要求41?44中任一项所述的方法，其中，所述病原体选自大肠杆菌和 MRSA。
【文档编号】G01N27/327GK104145026SQ201280066877
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月22日
【发明者】H·舒尔茨, D·科里根, 蒂尔·巴赫曼 申请人:Iti 苏格兰有限公司