专利名称：能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫层析方法，特别是涉及一种不用对于现有免疫层析装置进行
较大改变的情况下，能够同时进行多种分析物检测的方法，该方法可应用于自身免疫诊断 等方面。
背景技术：
免疫层析法(Imm皿ochromatography)是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技 术的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的 硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定 有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该 区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 现有的免疫层析法，一般在固相上包被有两条线，一条作为测试线，一条作为质控 线(如图l)，但这种处理方法的结果只能针对一种被分析物进行分析，如果需要同时检测 多种物质，则需要准备多种测试条，并采用多份样品进行测试。 而目前，能够同时检测多种分析物的方法，如自身免疫诊断产品应用的方法，其中 包括免疫印迹法(Westernblot)，其构造为在一条膜条上同时平行包被有多种抗原。进行测 试时，需要使用摇床，镊子，温浴槽等辅助工具。在这种情况下，如果使用常规的层析方法进 行测试，在前后两个条带含有交叉反应抗原位点的情况下，样品流经前个条带后再经过接 下去的条带，很有可能会影响结果，从而影响判读，或由于前一条测试带反应过于强烈，使 剩余胶体金量不够进行余下的反应，从而影响结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能同时对多种分析物进行检测的免疫层析 方法，该方法可利用一种原理和一种试剂进行多种测试，节约了改换模具的成本及样品的 使用量，操作更为简便。 为解决上述技术问题，本发明的一种能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方 法，步骤包括 (1)按常规方法制备显色剂；
(2)抗原或抗体显色剂标记制备 将显色剂与多种样品分析物相对应的抗原或抗体按比例混合，使显色剂与抗原或 抗体形成稳定的体系，纯化浓縮，形成抗原或抗体显色剂标记，该标记最终包被于玻璃纤维 上后，制备成显色剂标记；
(3)测试条制备 测试条由背衬(塑料板或硬化板)、吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜及步骤(2) 制备的显色剂标记组成，吸水纸、硝酸纤维素膜、固体胶体金片及玻璃纤维膜依次粘贴于背 衬之上，且相互之间有l-2mm的接触；其中，在硝酸纤维素膜上包被待测分析物相应的抗体或抗原，且该抗体或抗原在垂直方向上不重叠；
(4)样品分析物检测 按照常规免疫层析法进行检测，取30iU 1ml样品分析物点样于测试条的加样 区，在2 30min内观察并记录结果。 所述显色剂包括胶体金、乳胶或荧光等，采用胶体金作为显色剂时，该胶体金颗粒 粒径在1 150nm，可以按常规的柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒。 在所述步骤(2)中该标记最终包被于玻璃纤维上后，可以再经过冷冻干燥处理制 备成固体显色剂片，冷冻干燥的温度为0 -S(TC，干燥时间为2-72小时。
所述步骤(2)中的显色剂与样品分析物相对应的抗原或抗体混合的比例范围是 lml显色剂比0. 1-500 ii g抗原或抗体。 所述步骤(3)中的硝酸纤维素膜的尺寸是长2 10cm，宽4mm 2cm，该膜上有 2 10个抗原或抗体，相邻两个抗原/抗体显色剂标记梯度位置间的间隔范围是2mm 8cm。 所述步骤(2)中抗原或抗体胶体金标记以每ml铺8-40cm2均匀平铺于玻璃纤维 上。 所述步骤(3)中的背衬是塑料板或硬化板。 所述步骤(3)中硝酸纤维素膜上包被待测分析物相应的抗体或抗原的浓度为
0. 001mg/ml 10mg/ml。 本发明与现有方法的比较 如果采用原先的方法在膜上包被平行多条完整条带进行多种测试的，当使用含有
二抗的胶体金进行对多种抗原的测试时，经过第一条条带时，如果此时反应较为强烈，在第
一条带上就会占有胶体金中绝大部分的二抗，当反应进行到第二条条带时，如果反应还是
很强烈，但是由于胶体金在第一条条带中被占据了太多，在随后的反应中，即使反应同样强
烈，却由于胶体金的量不够而显不出颜色来，从而带来判读失误，造成测试的失败； 而采用本方法，条带和条带之间在垂直方向并不重叠，如果纵向划分条带的话，胶
体金等显色剂并不会在纵向上受到阻碍，所以一条测试条上的所有反应不会产生相互的干
扰。这样改进的好处在于可以利用现有的层析法检测装置，来进行自身免疫疾病的诊断。这
样既节约了检测的时间，又节约了装置的成本，并且不需要重新进行设计或打造模具等工作。 本发明中，样品从测试条底部由于毛细作用向上爬，经过各包被条时进行相应的 反应。由于各包被条在垂直方向不重叠，所以所有的反应并不会相互之间有影响。从而可 以达到用一份样品进行多种测试的目的，并且使所有的反应都能在同样条件下进行，从而 并不会产生由于条带和条带之间的干扰所产生的错误结果。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明
图1是现有的免疫层析法的检测试剂结构示意图； 图2是本发明方法操作过程的演示图，其中红色部分是胶体金或其他显色剂的反 应途径；
图3是实施例1中HCV的阳性样品免疫层析图，其中，a是HCV高浓度阳性样品，b 是HCV临界浓度阳性样品； 图4是实施例1中HIV高浓度阳性样品和HCV临界浓度阳性样品混合物的免疫层 析图，a是采用以前方法，b是采用本发明方法；
图5是实施例2的结果示意图；
图6是实施例3的结果示意图。
具体实施例方式
实施例1同时检测艾滋病病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV) (1)按常规的柠檬酸三钠还原法制备胶体金，颗粒粒径40nm ; (2)将胶体金与lmg/ml蛋白A(购自Sigma公司)按照体积比为128 : 1混合均
匀，稳定后1000转/分离心10min，浓縮，每10cm2玻璃纤维上均匀平铺1ml胶体金，经_20°C
冷冻干燥12h，制成固体胶体金片； (3)测试条制备 将吸水纸、硝酸纤维素膜、步骤(2)所制备的固体胶体金片及玻璃纤维膜依次粘 贴于塑料板背衬之上； 其中，硝酸纤维素膜长2. 5cm、宽4mm，在硝酸纤维素膜上平行包被HIV和HCV的抗 原(但这2个抗原在垂直方向上不重叠，包被浓度都为lmg/ml ，包被了 0. 4mg) ，HIV抗原比 HCV抗原更临近加样区，2个抗原梯度间隔0. 5cm ; (4)按照常规免疫层析法进行检测，取50iU样品分析物点样于测试条的加样区， 在5min内观察，参照图2，其结果见图3和图4。 其中，图3-a中HCV阳性对照的浓度是5mg/ml ，图3_b中HCV阳性对照临界浓度是 0. 005mg/ml。 图4中，HIV高浓度阳性样品与HCV临界浓度阳性样品的混合比是1 : 1，混合后 HIV高浓度阳性样品的浓度为10mg/ml，混合后HCV临界浓度阳性样品的浓度为0. 005mg/ ml。 从图3、图4中结果可示，如果按照原来的方法操作(在硝酸纤维素膜上包被平行 2个HIV和HCV抗原进行测试，垂直方向有交叉)，HCV弱阳性由于之前HIV反应过于强烈 而反映不出，但是按照本发明方法操作，就可以真实地反映出试验的结果。
实施例2同时检测HIV1、 HIV2、 HCV (1)将FITC(异硫氰酸荧光素)溶解于DMSO( 二甲亚砜)，浓度为lmg/ml ; [OO44] (2)将FITC溶液与0. 2mg/ml蛋白A (购自Sigma公司)按照体积比为1 : 1混合 均匀，缓慢混合8个小时，即完成蛋白A与荧光素的结合； [OO45] (3)测试条制备 将吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜依次粘贴于塑料板背衬之上；
其中，硝酸纤维素膜长2cm、宽5mm，在硝酸纤维素膜上平行包被HIV1、 HIV2、 HCV 抗原和蛋白A(蛋白A作为质控线)(所有的包被线在垂直方向上不重叠，包被浓度都为 0. 001mg/ml，包被了 0. 0005mg)，从加样区到吸水纸方向依次为HIV1、 HIV2、 、蛋白A，间 隔为4mm ;
(4)按照常规免疫层析法进行检测，加100 荧光素蛋白A结合物于样品区，取 30iU样品(HIV1、2与HCV阳性样品混合物，1 : 1 : l混合，终浓度皆为5mg/ml)分析物 点样于荧光素结合物之后，在5min内用520nm波长的紫外光观察，参照图2，其结果见图5。
实施例3同时检测ToRCH五项 (1)准备乳胶蓝色微粒，平均粒径为100nm，微粒；浓度为lmg/ml (2)将胶体金与10mg/ml蛋白A(购自Sigma公司)按照体积比为1000 : 1混合
均匀，室温缓慢混匀，反应4小时后，于4t:储存； (3)测试条制备 将吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜依次粘贴于塑料板背衬之上；
其中，硝酸纤维素膜长10cm、宽2cm，在硝酸纤维素膜上依次平行包被Toxo(弓 形虫)，HSV1 (单纯疱疹病毒1型)和HSV2(单纯疱疹病毒2型)，CMV(巨细胞病毒)， Rubella(风疹)5种抗原(但这5个抗原在垂直方向上不重叠，包被浓度都为10mg/ml，包 被了 2mg)，从加样区到吸水纸方向依次为TOXO， HSV1， HSV2， CMV， Rubella,各抗原梯度间隔 1. 5cm j (4)按照常规免疫层析法进行检测，取lml乳胶微粒结合物于加样区，取lml样品
分析物点样于乳胶微粒结合物后，在5min内观察，参照图2，其结果见图6。 图6(A)-(E)是各自的结果，图6(F)为混合样品的结果，由图6可见，混合物测试
与各自测试的结果相同，即本发明方法反映出测试的真实结果。
权利要求
一种能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，步骤包括(1)按常规方法制备显色剂；(2)抗原或抗体显色剂标记制备将显色剂与多种样品分析物相对应的抗原或抗体按比例混合，使显色剂与抗原或抗体形成稳定的体系，纯化浓缩，形成抗原或抗体显色剂标记，该标记最终包被于玻璃纤维上后，制备成显色剂标记；(3)测试条制备测试条由背衬、吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜及步骤(2)制备的显色剂标记组成，吸水纸、硝酸纤维素膜、显色剂标记及玻璃纤维膜依次粘贴于背衬之上，且相互之间有1-2mm的接触；其中，在硝酸纤维素膜上包被待测分析物相应的抗体或抗原，且该抗体或抗原在垂直方向上不重叠；(4)样品分析物检测按照常规免疫层析法进行检测，取30μl～1ml样品分析物点样于测试条的加样区，在2～30min内观察并记录结果。
2. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述显色剂包括胶体金、乳胶或荧光。
3. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于在所述步骤(2)中该标记最终包被于玻璃纤维上后，再经过冷冻干燥处理制备成固体显色 剂片，冷冻干燥的温度为0 -S(TC，干燥时间为2-72小时。
4. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述步骤(2)中的显色剂与样品分析物相对应的抗原或抗体混合的比例范围是lml显色剂 比0. 1-500 ii g抗原或抗体。
5. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述步骤(3)中的硝酸纤维素膜的尺寸是长2 10cm，宽4mm 2cm，该膜上有2 10个 抗原或抗体，相邻两个抗原或抗体梯度位置间的间隔范围是2mm 8cm。
6. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述步骤(2)中抗原或抗体显色剂标记以每ml铺8-40cn^均匀平铺于玻璃纤维上。
7. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述步骤(3)中的背衬是塑料板或硬化板。
8. 如权利要求1所述的能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，其特征在于 所述步骤(3)中硝酸纤维素膜上包被待测分析物相应的抗体或抗原的浓度为0.001mg/ ml 10mg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种能同时对多种分析物进行检测的免疫层析方法，步骤包括1)按常规方法制备显色剂；2)制备抗原或抗体显色剂标记；3)制备测试条，且在测试条上包被多种分析物相对应的抗体或抗原，且该抗体或抗原在垂直方向上不重叠；4)按照常规免疫层析法进行检测，观察并记录结果。本发明由于条带和条带之间在垂直方向并不重叠，所以一条测试条上的所有反应不会产生相互的干扰，节约检测时间及改换模具的成本和样品的使用量，操作更为简便。
文档编号G01N33/558GK101738470SQ200810043909
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者姚恺龄, 陈国治 申请人:益思美诠生物科技(上海)有限公司