专利名称：免疫原性复合物、其制备方法及其在药物组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过用小支持肽偶联来提高免疫原、抗原或半抗原的免疫原性的方法。更具体地，本发明涉及制备免疫原性复合物的方法，以及能够通过这种方法获得的复合物，以及所述复合物作为药物以增加免疫原的免疫原性的用途。例如，本发明包含与来自呼吸道合胞体病毒(RSV)G蛋白的肽偶联的支持肽，及其作为疫苗用于治疗RSV相关呼吸感染的用途。
免疫系统是一种相互作用的体液和细胞组分的网络，其允许宿主区分自身分子和非自身分子，以去除后者以及病原体。为此目的，免疫系统已经发展了能协同作用的两种机制，也就是自然免疫和获得性免疫。
自然免疫包括物理屏障(皮肤、粘膜等)、在对攻击应答中活化或产生的细胞(单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、NK细胞等)和可溶性因子(补体、细胞因子、急性期蛋白等)。自然免疫应答是快速的，但是它既不是特异性的，又不被记忆。
获得性免疫的细胞介质是T和B淋巴细胞。特别是，通过它们的相互作用，后者产生免疫球蛋白。与自然免疫应答相比，获得性免疫的免疫应答是特异性的、可适应的并且能被记忆。事实上，抗原初次侵入幼稚(nive)生物体导致免疫应答，称为初次应答，在此期间，称为记忆细胞的长寿淋巴细胞(T和B)扩增。通过这些细胞，在相同抗原的二次渗透期间，称为二次反应的免疫应答将更快和更强。要发生初次应答，抗原首先必须被捕获并由抗原呈递细胞准备，以呈递给T淋巴细胞。
疫苗的目的是通过预防或限制病原体入侵来保护宿主。现在市场销售的所有疫苗都通过引起待产生的抗体来实现这种作用。
当单独接种抗原不能引发免疫应答时，或者如果产生了免疫应答但是太弱时，它与具有能与T淋巴细胞相互作用的T表位的所谓载体蛋白的物理结合物能够引发期望的应答。最普遍已知的疫苗载体蛋白是白喉和破伤风类毒素。
在这些载体蛋白中，也可以引用链球菌G蛋白的所谓“BB”蛋白片段，其能与白蛋白结合并且是对应SEQ ID NO 1序列的第24-242位残基的片段。这种蛋白能引发与之结合的接种抗原更早和更强的初次抗体应答(Libon et al.，Vaccine，17(5)406-41，1999)。在本文中，也可以参考国际专利申请WO 96/14416。
本发明的目的是提供载体蛋白的替代物，其将如以下说明书中所述，弥补与这种载体蛋白相关的所有缺点。更具体的说，本发明能够限制与存在相对较大载体蛋白相关的副作用而同时允许实现高产量。
为了明确，通过与现有的载体蛋白，即BB载体蛋白，相比较，来证明本发明的优点。
非常出乎预料地，并且与本领域技术人员所接受的主流知识相反，发明人已经证明了使用载体蛋白的替代物。更具体的说，本发明人已经表征了提高免疫原的免疫原性的方法，这是基于鉴定非常小并因此非免疫原性的肽，此后其被称作支持肽，这有助于其合成和/或它们参与其中的免疫原-支持肽复合物的合成。
为此目的，本发明涉及制备免疫原性复合物的方法，其中免疫原、抗原或半抗原与支持肽偶联从而形成所述的免疫原性复合物，其中所述支持肽由少于10个氨基酸的肽组成，其至少包含SEQ ID NO 2序列的3氨基酸残基肽片段(Met-Glu-Phe)。
术语“免疫原”包括能引起免疫应答的任何物质。作为非限制性实例，免疫原优选是蛋白质、糖蛋白、脂肽或在其结构中包含至少5个氨基酸，优选至少10、15、20、25、30或50个氨基酸，的任何免疫原性化合物，所述化合物在施用于哺乳动物后能引起免疫应答，尤其是能诱导产生抗所述肽的特异性抗体。
在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“蛋白质”可以互换。
对于以上说明，应该清楚理解的是，表述“支持肽”不等同于“载体蛋白”。实际上，载体蛋白的特征在于它的大尺寸(对于BB蛋白为218个氨基酸)，最重要的是其存在能与T淋巴细胞表面上T抗原受体结合的T表位。由于支持肽小得多(小于10个氨基酸)的事实和支持肽不表现T表位的事实，根据本发明的支持肽与载体蛋白不同。
根据第一优势方面，根据本发明的方法使得有可能生产提高免疫原的免疫原性的免疫复合物，对此该生产更容易或者其产量更高。实际上，包含根据本发明支持肽的复合物远小于包含现有技术载体蛋白的复合物，通过肽/化学合成或本领域技术人员已知的任何其它技术，所述支持肽复合物更容易制备。
根据第二优势方面，根据本发明的免疫原性复合物使得有可能去除，至少也是限制，与载体蛋白特别性质相关的不利作用。本领域技术人员所接受的是相对大的载体蛋白，比如BB，有更高可能性是不期望免疫应答的原因。例如，对于破伤风类毒素，已经显示宿主对这种载体蛋白预先敏化能在用偶联物接种疫苗期间防止发生抗与破伤风类毒素结合的抗原的抗体应答(Kaliyaperumal et al.，Eur.J.Immunol.，25(12)3375-80，1995)。这种现象被称为表位抑制。
因而，从本说明书中很清楚的是，本发明提供了使用载体蛋白的有利的替代物。实际上，由于它的小尺寸，支持蛋白没有、或者有非常少的机会作为副作用或不期望作用的起源。
根据本发明的一个优选实施方案，少于10个氨基酸的支持肽至少包含由SEQ ID NO 2编码的肽并且由至多8个氨基酸组成，优选至多5个氨基酸，更优选4个氨基酸。
根据另一个优选实施方案，根据本发明的少于10个氨基酸的支持肽由SEQ ID NO 2序列的肽组成。
通过本领域技术人员已知的保持免疫原完整性以及免疫原性的偶联技术，可以实施所述支持肽和免疫原之间的结合。更具体的是，根据本发明的方法的特征在于所述结合由共价偶联组成。术语“共价偶联”包括化学偶联或者通过所谓的重组DNA技术的蛋白质融合，其中通过用所述核酸转化的宿主细胞(真核或原核)在编码融合蛋白(免疫原性复合物)的核酸翻译之后获得所述融合蛋白。
当所述免疫原是肽时，所述支持肽可以偶联在所述免疫原的N末端或C末端。优选的是，所述支持肽被偶联在所述免疫原的N末端。
支持肽和寻求提高免疫原性的化合物之间的复合物能通过重组DNA技术产生，尤其是通过将编码免疫原的DNA插入或融合到编码支持物的DNA分子中。
根据另一个实施方案，通过根据本领域技术人员已知的化学途径实施支持肽和免疫原之间的共价偶联。
作为一个目的，本发明也提供一种方法，其中通过遗传重组(重组蛋白)来获得所述免疫原性复合物，其中遗传重组使用得自与编码免疫原的DNA融合(或插入)的、编码支持肽的DNA分子的核酸，如果必要用启动子。
在此方法中，可以使用包含这种融合核酸的载体，特别是起源于质粒、噬菌体、病毒和/或粘粒的DNA载体并且融合核酸编码所述复合物的所述载体，其能整合到宿主细胞的基因组中，从而在其中表达。
因此在其一个实施方案中，根据本发明的方法包括通过遗传工程在宿主细胞中产生所述复合物的步骤。
宿主细胞可以是原核的，并且尤其是选自大肠杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、葡萄球菌和链球菌；它也可以是酵母。
根据另一个方面，宿主细胞是真核细胞，比如哺乳动物细胞或昆虫细胞(Sf9)。
编码免疫原性复合物的融合核酸尤其能通过病毒载体引入宿主细胞。
所用免疫原优选来自细菌、寄生生物、病毒或与肿瘤相关的抗原，比如与黑素瘤相关或源自β-hCG的抗原。
根据本发明的方法特别适合于病原体的表面多肽。当所述多肽通过重组DNA技术以融合蛋白的形式表达时，融合蛋白有利地被表达、锚定并暴露于宿主细胞膜的表面。所用核酸分子能在宿主细胞中指导抗原合成。
所述分子包含启动子序列、以功能性方式连接的分泌信号序列和编码膜锚定区的序列，它们都可以被本领域技术人员进行适应性修改。
所述免疫原尤其可以源自A或B型人RSV或者牛RSV表面糖蛋白，尤其是选自F和G蛋白。
使用人RSV G蛋白、A或B亚组、或者牛RSV能获得特别有利的结果。
在一种优选方式中，免疫原由RSV G蛋白肽序列的130-230位残基之间序列编码的多肽组成，或者由与所述肽序列有至少80％一致性的任何序列编码的多肽组成，其中优选与所述G蛋白肽序列的130-230位残基之间序列具有85％、90％、95％或98％的一致性，或者其至少10个连续氨基酸、优选至少15、20、25、30或50个氨基酸的片段，其能够在其施用于哺乳动物后诱导产生抗所述片段的特异性抗体。
在本发明中，两个核酸或氨基酸序列之间的“一致性百分比”或“同源性百分比”(在本说明书中这两种表述可以互换)表示，经过最佳比对(最优匹配)后，进行比较的两个序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分比，这种百分比是纯统计学的并且两个序列间的差异在它们的长度上随机分布。典型地在它们最佳比对后通过比较这些序列来实施两个核酸或氨基酸序列间的序列比较，所述的比较是通过区段(segment)或“比较窗”来实施的。用于比较的序列的最优比对可以手动进行或通过Smith-Waterman局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2482]、Needleman-Wunsch局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48443]、Pearson和Lipman相似性搜索方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444]实施或通过应用这些算法的计算机软件(Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，或者BLAST N或BLASTP比较软件)实施。
通过最优化比较两个比对序列来确定两个核酸或氨基酸序列间的一致性百分比，其中对于这两个序列间的最优匹配，待比较的核酸或氨基酸序列与参考序列相比可以包括添加或缺失。一致性百分比如下计算通过确定两个序列间具有相同核苷酸或氨基酸的相同位置的数目，并将相同位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100，从而获得这两个序列之间的一致性百分比。
例如，可以在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html获得BLAST程序，“BLAST 2 sequences”(Tatusova et al.，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，”FEMSMicrobiol Lett.174247-250)并使用，所用参数使用缺省参数(尤其对于参数“open gap penalty”5，和“extension gap penalty”2；例如所选矩阵是程序建议的矩阵“BLOSUM 62”)，待比较两序列间的一致性百分比直接由程序计算。
对于与参考氨基酸序列具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的氨基酸序列，优选与参考序列相比具有某些修饰的序列，尤其是至少一个氨基酸的缺失、添加或替换、截短或延长。在替换一或多个连续或非连续氨基酸的情况下，其中被取代的氨基酸由“等同”氨基酸代替是优选的取代。表述“等同氨基酸”在此表示可能取代为基本结构氨基酸之一的任何氨基酸，但是基本上并没有改变相应抗体的生物活性。这些等同氨基酸可以基于它们与将被它们取代的氨基酸的结构同源性来确定，或者基于可能产生的各种抗体间生物活性的对比试验的结果来确定。
根据另外一个优选实施方案，根据本发明的方法的特征在于这种事实免疫原是SEQ ID NO 3序列的多肽，或与SEQ ID NO 3序列具有至少80％一致性的序列，优选与所述G蛋白的肽序列的130-230残基之间的序列具有85％、90％、95％或98％一致性的序列，或SEQ ID NO 3序列的一个至少10个连续氨基酸的片段，优选至少15、20、25、30或50个氨基酸，其能在施用于哺乳动物后，诱导产生抗所述片段的特异性抗体。
适于实施本发明方法的其它免疫原包括甲、乙和丙型肝炎病毒表面蛋白的衍生物、麻疹病毒表面蛋白、副流感病毒表面蛋白，尤其是表面糖蛋白比如血凝素、神经氨酸酶、血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)蛋白。
根据另一个实施方案，本发明涉及根据实施本发明方法获得的免疫原性复合物。
更具体地说，本发明的另一个目的是提供包含免疫原、抗原或半抗原的免疫原性复合物，其中所述免疫原与少于10个氨基酸的支持肽相结合，所述支持肽至少包含SEQ ID NO 2序列的3氨基酸残基肽片段。
优选的是，在所述根据本发明的免疫原性复合物中，至少包含由SEQ ID NO 2编码的肽的所述支持肽由至多8个氨基酸组成，优选至多5个氨基酸，和更优选4个氨基酸。
根据一个优选实施方案，根据本发明的免疫原性复合物的所述支持肽由SEQ ID NO 2编码的肽组成。
根据一个优选实施方案，根据本发明的免疫原性复合物的所述支持肽的特征在于所述结合由所述支持肽和所述免疫原之间的共价偶联组成。
根据一个优选实施方案，根据本发明的所述免疫原性复合物的特征在于，当所述免疫原是肽时，所述支持肽偶联在所述免疫原的N或C末端，优选N末端。
根据一个优选实施方案，根据本发明的所述免疫原性复合物的特征在于免疫原是源于细菌、寄生生物和/或病毒的抗原。
根据一个优选实施方案，根据本发明的所述免疫原性复合物的特征在于免疫原是呼吸道合胞体病毒(RSV)的表面蛋白或糖蛋白，尤其是F或G，或者与所述F或G蛋白序列具有至少80％一致性的序列，优选与所述F或G蛋白序列具有85％、90％、95％或98％一致性，或其至少10个连续氨基酸、优选至少15、20、25、30或50个氨基酸的其片段，其在施用于哺乳动物后能够诱导产生抗所述片段的特异性抗体。
根据一个优选实施方案，根据本发明的所述免疫原性复合物的特征在于免疫原是A或B型人RSV G蛋白或牛RSV G蛋白。
根据一个优选实施方案，根据本发明的所述免疫原性复合物的特征在于免疫原是RSV G蛋白130-230位残基之间序列的多肽，其中包括端点，或者与所述130-230位之间序列具有至少80％一致性的序列的多肽、或者RSV G蛋白的130-230位之间所述序列的至少10个氨基酸的片段。
优选的是，根据本发明的所述免疫原性复合物的免疫原是SEQ IDNO 3序列的多肽。
仍然根据另一个优选实施方案，根据本发明的复合物是SEQ ID NO4序列的MEFG2Na复合物，或者其序列在1-3位中具有SEQ ID NO 2序列所示MEF序列的类似免疫原性复合物，随后是-或者与SEQ ID NO 3序列具有至少80％一致性的序列，优选与SEQ ID NO 3序列具有至少85％、90％、95％或98％一致性；-或者至少10个连续氨基酸的SEQ ID NO 3序列的片段的序列，优选至少15、20、25、30或50个氨基酸，其在施用于哺乳动物后能够诱导产生抗所述片段的特异性抗体。
在另一个方面，本发明的一个目的是提供一种编码根据本发明免疫原性复合物的核酸，尤其是编码SEQ ID NO 4序列的MEFG2Na免疫原性复合物，所述核酸优选是分离和/或纯化的。
在本说明书中术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，表示无论修饰与否的特异性核苷酸序列，其限定核酸的片段或区域，可含有非天然核苷酸或不含，并且其对应双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。
仍然在另一方面中，本发明的目的是提供用作药物的根据本发明的免疫原性复合物或编码根据本发明的免疫原性复合物的核酸，尤其是SEQ ID NO 4序列的MEFG2Na免疫原性复合物或核酸，比如DNA或RNA，其编码所述MEFG2Na复合物。
包含与生理可接受的赋形剂结合的、根据本发明或如前定义的免疫原性复合物、或编码这些免疫原性复合物的核酸、RNA或DNA的药物组合物也是本发明的目的。所述组合物特别适合制备疫苗。
通过单独或通过包含一种这类多核苷酸的病毒载体施用编码如所述定义的免疫原性复合物的所述多核苷酸可以获得免疫接种。也可以使用宿主细胞，尤其是杀死的细菌，其用根据本发明的一种这类多核苷酸转化。
本发明的另一个目的也包括根据本发明的免疫原性复合物的用途，其中所述免疫原性复合物是源自如前面定义的RSV G或F蛋白质的蛋白质或肽，尤其是MEFG2Na复合物或一种根据本发明的其类似物，或者编码所述免疫原性复合物的根据本发明的核酸，用于制备意图预防或治疗RSV相关呼吸道感染的药用组合物。
本发明的优点将通过以下实施例和附图来举例说明，其中-
图1表示用BBG2Na或MEFG2Na免疫的小鼠中抗-RSV-AIgG的浓度；-图2也以补充的方式表示用BBG2Na或MEFG2Na免疫的小鼠中在二次免疫后的抗-RSV-AIgG的浓度；-图3表示用BBG2Na或MEFG2Na免疫的小鼠中抗-G2NaIgG的浓度；和-图4也以补充的方式表示用BBG2Na或MEFG2Na免疫的小鼠中抗-G2NaIgG的浓度。
实施例1用BB载体蛋白或MEF支持肽所诱导的体内活性的比较在20天时通过鼻途径用RSV-ALong株(105pfu)感染8周龄IOPS雌性BALB/c小鼠。在0天时，在确认RSV-A血清转化之后，小鼠接受吸附在Adju-Phos上20μg BBG2Na(6μg G2Na当量)或吸附在Adju-Phos上6μg MEFG2Na的单次肌肉注射。通过ELISA分析抗-RSV-AIgG(纯化的病毒抗原)和抗-MEFG2Na的浓度。
图1和2显示在动力学的任何点上，在由6μg MEFG2Na或20μgBBG2Na引发的抗-RSV-AIgG的浓度之间没有显著差异。对于抗-G2NaIgG的浓度同样也是如此(图3和4)。
实施例2BBG2Na和MEFG2Na复合物的制备BBG2Na的制备通过用Escherichia coli RV308作为宿主细胞和由色氨酸启动子控制感兴趣基因转录的质粒来生产BBG2Na蛋白质。发酵步骤是使用半确定合成培养基和甘油作为碳源和能量的分批方法。对于制备用于生产发酵罐的接种物，两个培养步骤是必需的。在此发酵罐中，微生物生长到620nm处光密度为50，然后通过添加色氨酸类似物(IAA)来诱导表达。生长继续直到发酵罐中O2分压突然增加，其指示碳源已经耗尽。在此阶段，平均细胞密度是40g干细胞/升，并有9.5％的表达率，其代表3.8gBBG2Na/升培养物的生产率。该培养物冷却至+4℃并且通过离心收集微生物并在-15℃至-25℃冷却。
BBG2Na的提取物需要用含胍、盐酸和1，4-二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液溶解解冻的微生物团块，从而还原二硫键。通过稀释变性悬液并在开放反应器中在室温下振荡过夜来获得蛋白质的复性和二硫桥的氧化。通过离心并随后过滤来澄清含复性蛋白的悬液。接下来，将PEG6000加到滤出物中并且通过离心收集所得沉淀物。含BBG2Na的沉淀物被再次溶解于含尿素的缓冲液中。所得提取物在0.22μm支持物上过滤并在-15℃至-25℃下保存。
从解冻提取物纯化BBG2Na由5步组成(1)在SP-Sepharose FastFlow柱上的阳离子交换色谱；(2)在Macro-Prep Methyl柱上的疏水相互作用色谱；(3)在Superdex S200柱上的凝胶过滤；(4)在DEAE-Sepharose Fast Flow柱上的阴离子交换色谱；和最后(5)在Sephadex G25柱上的脱盐步骤。无菌过滤纯化蛋白的溶液并且分配在无菌无热源的小袋中。
MEFG2Na的制备通过用大肠杆菌Escherichia coli ICONE 200作为宿主细胞和由色氨酸启动子控制感兴趣基因转录的质粒来生产MEFG2Na蛋白。大肠杆菌Escherichia coli ICONE 200是大肠杆菌Escherichia coli RV308的突变体并且为了改进生长阶段中表达调控而开发。发酵步骤是使用化学确定培养基和甘油作为碳源和能量的流加(fed-batch)方法。对于制备用于生产发酵罐的接种物，两个培养步骤是必需的。在此发酵罐中，微生物生长到620am处光密度为110，然后通过添加色氨酸类似物(IAA)来诱导表达。生长继续直到发酵罐中O2分压突然增加，其指示碳源已经耗尽。在此阶段，平均细胞密度是56g干细胞/升，并有5.4％的表达率，其代表3g MEFG2Na/升培养物的生产率。培养物冷却至+4℃并且通过离心收集微生物并在-15℃至-25℃冷却。
MEFG2Na的提取物需要用含胍和盐酸的缓冲液溶解解冻的微生物团块。通过离心并随后过滤来澄清含复性蛋白的悬液。因为胍与随后的纯化步骤相容，使用在具有10kDa截留阈值的聚醚砜超滤支持物上进行透析浓缩的步骤来实施缓冲液交换。所得提取物在0.22μm支持物上过滤然后纯化。
MEFG2Na的纯化由3步组成(1)在Fractogel EMD SE Hicap柱上的阳离子交换色谱；(2)在Superdex 75 Prep Grade柱上的凝胶过滤；和(3)在DEAE-Sepharose Fast Flow柱上的阴离子交换色谱。无菌过滤大批量纯化蛋白质并分配入无菌无热源的小袋中。
表达产率MEFG2Na和BBG2Na表达的数据总结于下表1中。
表1所得MEFG2Na和BBG2Na蛋白质的量，以mol/100g干细胞表示mol蛋白质/100g干细胞BBG2Na2.46×10-4MEFG2Na 4.54×10-4它显示出MEFG2Na复合物的表达率是BBG2Na复合物表达率的约2倍。
尽管本说明书、以及实施例只是基于抗原G2Na，但是应当理解任何免疫原也可以偶联到根据本发明的支持肽上。
序列表<110>皮埃尔法布尔制药公司<120>免疫原性复合物，其制备方法及其在药物组合物中的应用<130>D22398<140>PCT/FR2005/001913<141>2005-07-25<150>FR0408175<151>2004-07-23<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>246<212>PRT<213>链球菌<400>1Met Lys Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala1 5 10 15Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn20 25 30Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala35 40 45Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp50 55 60Gly Leu Ser Asp Phe Leu Gln Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val65 70 75 80Lys SerIle Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu85 90 95Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala100 105 110Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser115 120 125Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp Phe130 135 140Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu145 150 155 160Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val165 170 175
Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly180 185 190Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp195 200 205Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr210 215 220Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile225 230 235 240Leu Glu Asn Ser Arg Gly245<210>2<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>支持肽<400>2Met Glu Phe1<210>3<211>101<212>PRT<213>呼吸道合胞体病毒<400>3Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys1 5 10 15Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn20 25 30Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser35 40 45Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys50 55 60Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys65 70 75 80Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val85 90 95Pro Thr Thr Lys Pro100
<210>4<211>104<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MEFG2Na肽<400>4Met Glu Phe Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln1 5 10 15Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys20 25 30Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser35 40 45Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro50 55 60Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro65 70 75 80Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro85 90 95Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro100
权利要求
1.一种制备免疫原性复合物的方法，其中免疫原、抗原或半抗原与支持肽结合形成所述免疫原性复合物，其中所述支持肽由至少包含SEQ IDNO2序列所示肽的少于10个氨基酸的肽组成。
2.根据权利要求1的方法，其中所述少于10个氨基酸的支持肽由SEQID NO2编码的肽组成。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述结合由所述支持肽和所述免疫原之间的共价偶联组成。
4.根据权利要求3的方法，其中当所述免疫原是肽时，所述支持肽被偶联至所述免疫原的N末端。
5.根据权利要求4的方法，其中通过重组DNA技术实施所述共价偶联。
6.根据权利要求3或4的方法，其中通过化学途径实施所述共价偶联。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中免疫原是源自细菌、寄生生物和/或病毒的抗原。
8.根据权利要求7的方法，其中免疫原是呼吸道合胞体病毒(RSV)的表面蛋白或糖蛋白、具有与所述RSV表面蛋白之序列有至少80％一致性的序列的蛋白质、或者所述RSV表面蛋白的至少10个连续氨基酸的片段，具有至少80％一致性的序列的所述蛋白质或所述片段能在施用于哺乳动物后诱导产生抗所述蛋白质或所述片段的特异性抗体。
9.根据权利要求8的方法，其中免疫原是A或B型人RSVG蛋白或牛RSVG蛋白、与所述G蛋白的序列具有至少80％一致性的序列的蛋白质、或所述G蛋白的至少10个氨基酸的片段。
10.根据权利要求9的方法，其中免疫原是RSVG蛋白的130-230位残基之间、包括其端点、的序列的多肽、或与所述130-230位残基之间序列具有至少80％一致性的序列的多肽、或所述G蛋白的至少10个氢基酸的片段。
11.根据权利要求10的方法，其中免疫原是SEQ ID NO3序列的多肽。
12.通过实施根据权利要求8-11中任一项的方法获得的免疫原性复合物。
13.一种包含与支持肽结合的免疫原、抗原或半抗原的免疫原性复合物，其中-所述免疫原结合至、优选以共价连接偶联至包含至少SEQ ID NO2序列的肽的少于10个氨基酸的支持肽；并且其中-免疫原是呼吸道合胞体病毒(RSV)的表面蛋白或糖蛋白，更特别的是F或G，或者是与所述RSV表面蛋白序列具有至少80％一致性的序列，其能在施用于哺乳动物后诱导产生抗具有至少80％一致性的序列的所述蛋白质的特异性抗体。
14.根据权利要求13的复合物，其中所述支持肽是SEQ ID NO2序列的肽。
15.根据权利要求12或13的复合物，其中它是SEQ ID NO4序列的MEFG2Na复合物，或者是这样的免疫原性复合物，其序列在1-3位中具有SEQ ID NO2序列，随后是-与SEQ ID NO3序列具有至少80％一致性的序列，优选与SEQ IDNO3序列具有至少85％、90％、95％或98％一致性。
16.根据权利要求15的复合物，其具有SEQ ID NO4序列。
17.编码根据权利要求13-16中任一项的免疫原性复合物的核酸。
18.根据权利要求17的核酸，其编码SEQ ID NO4序列的免疫原性复合物。
19.根据权利要求12-16中任一项的复合物、或者根据权利要求17或18的核酸，用作药物。
20.根据权利要求12-16中任一项的免疫原性复合物、或者根据权利要求17或18的核酸的用途，用于制备目的在于治疗或预防RSV相关呼吸道感染的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及通过用小支持肽偶联来提高免疫原、抗原或半抗原免疫原性的方法。更具体地说，本发明涉及制备免疫原性复合物的方法，以及使用这种方法能获得的复合物，还涉及所述复合物作为用于增加免疫原的免疫原性的药物的用途。例如，本发明包含与呼吸道合胞体病毒(RSV)的G蛋白偶联的支持肽，并涉及其作为疫苗用于治疗与RSV相关呼吸道感染的用途。
文档编号C07K1/00GK1989150SQ200580024323
公开日2007年6月27日 申请日期2005年7月25日 优先权日2004年7月23日
发明者克里斯蒂娜·利博, 蒂恩·恩古延 申请人:皮埃尔法布尔制药公司