一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于功能微生物复合菌群筛选技术领域，具体涉及一种海水养殖沉积物中硫化物治理的微生物复合菌群、菌群组成、菌群遗传稳定性以及其制备方法。
技术背景
[0002]我国是海水养殖大国，在近海养殖区，人们为了提高海水养殖的产量，往往向养殖区投加大量的有机饵料，造成养殖区水体的有机质污染严重。在近海养殖区沉积物-水界面环境中，有机质的有氧降解导致水体中溶解氧大量消耗，造成水体的氧化-还原电位(Eh)降低。在此条件下，沉积物中的硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria，简称SRB)将通过硫酸盐呼吸过程产生大量的硫化物，硫化物在沉积物-水界面大量累积并向上层水体扩散，高浓度硫化物的毒害作用严重威胁着海水中，尤其是底栖的生物，导致养殖区沉积物的“老化”现象，影响海水养殖产业的健康发展。
[0003]目前，针对海水养殖区“老化”现象，尤其是硫化物浓度过高的问题，人们多采取物理或化学的方法进行治理，某些物理方法作用不能够持久，而部分化学治理措施二次污染严重，相比而言，选择适合的微生物菌剂用于硫化物消除具有效果持久、环境相容性好、无二次污染等优点。研究发现，利用纯菌去除环境中的污染物，往往存在环境适应性差、生物量低、代谢缓慢等缺点。基于此，研发针对沉积物中高浓度硫化物污染治理的微生物复合菌群具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群，能够解决纯菌生态位狭窄、无法适应沉积物环境、容易在较短时间内被淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。
[0005]本发明的复合菌群，包含芽孢杆菌(Bacillus spp.)、弧菌(Vibr1 spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibr1 spp.)，作为实施例的一种优选，上述菌群的数量比例为10:6:5:2o
[0006]上述的复合菌群用于消除沉积物中的硫化物，优选为海水沉积物。
[0007]上述用于消除沉积物中硫化物的复合菌群的筛选方法如下:
[0008]I)采集近海养殖区的表层沉积物制成菌悬液；
[0009]2)将上述步骤I)的菌悬液按比例接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养后得到一级培养液；一级培养液分为两份，一份用于下一步选择培养基的接种，另一份离心后收集沉淀保存于_20°C，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定;
[0010]一级选择培养基的配制比例为=K2HPO4:1.2g/l, KH2PO4-L 2g/l，NH4Cl1.4g/l,MgCl2=0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO 3:2g/l, Na2S:1.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。
[0011]3)将上述步骤2)的一级培养液按比例接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养后得到二级培养液。二级培养液同样分为两份，其他操作与上述步骤I)中相同；
[0012]二级选择培养基的配制比例为=K2HPO4:1.2g/l, KH2PO4-L 2g/l，NH4Cl1.4g/l,MgCl2=0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO 3:2g/l, Na2S:2.0g/1,使用灭菌的陈海水进行配制。
[0013]4)将上述步骤3)的二级培养液按比例接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养后得到三级培养液。三级培养液同样分为两份，其他操作与上述步骤I)中相同；
[0014]三级选择培养基的配制比例为=K2HPO4:1.2g/l, KH2PO4-L 2g/l，NH4Cl1.4g/l,MgCl2=0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO 3:2g/l, Na2S:2.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。
[0015]5)将上述步骤4)的三级培养液按比例接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于沉积物中硫化物消除的复合菌剂。
[0016]本发明用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群具有以下优点:
[0017]1、本发明的微生物复合菌群，解决了纯菌生态位狭窄、易淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。
[0018]2、本发明的微生物复合菌群，菌种来源于硫化物含量丰富的近海养殖区沉积物，经过驯化获得，降低了由于环境差异而导致的应用时的适应过程。
[0019]3、本发明的微生物复合菌群在去除硫化物的过程中，菌群结构能够保持结构和组成稳定。
【附图说明】
[0020]图1:本发明中用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群组成。
[0021]图2:本发明中用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的稳定性DGGE群落结构分析。
[0022]其中，M为近海养殖区1cm内表层沉积物；A1，A2和A3分别为一级、二级、三级培养液；P为保存30天后的菌剂；T1-T5分别为菌剂在硫化物初始浓度200、400、600、800、100mg/1的无机盐培养基上培养后的群落结构。
[0023]图3:本发明用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群对硫化物的去除率随时间的变化图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
[0025]实施例1:用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选、鉴定及遗传稳定性
[0026](I)用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选
[0027]I)采集近海养殖区深度1cm以内的表层沉积物，按10 %的体积百分数接种制成菌悬液:
[0028]在锥形瓶中，将采集的近海养殖区深度1cm以内的表层沉积物按照10%的体积百分数接种于灭菌的陈海水。将锥形瓶用铝箔封口后置于恒温摇床，30°C，120r/min振荡30min，使沉积物中的细菌充分释放出来。振荡结束后静置30min，待沉积物重新沉淀，上清液即为菌悬液；
[0029]2)将上述步骤I)的菌悬液按体积百分数为10%的接种量接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养6d后得到一级培养液。一级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20°C，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定:
[0030]在厌氧瓶中，将上述步骤I)的菌悬液按体积百分数为10%的接种量接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，使用N2吹脱lmin，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30°C，150r/min振荡培养6d后得到一级培养液；其中，一级选择培养基的配制比例为:K2HPO4:1.2g/l，KH2PO4:1.2g/l，NH4Cl1.4g/l，MgCl2:0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO3:2g/l，Na2S:1.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。
[0031]将一份一级培养液使用离心管于4°C，6000r/min离心lOmin，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，_20°C保存。
[0032]3)将上述步骤2)的一级培养液按体积百分数为10 %的接种量接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养6d后得到二级培养液。二级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20°C，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定:
[0033]在厌氧瓶中，将上述步骤2)的一级培养液按体积百分数为10%的接种量接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，使用N2吹脱lmin，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，300C，140r/min振荡培养6d后得到二级培养液；其中，二级选择培养基中Na2S的配制比例为2.0g/Ι,其他成分的配制比例以及配制方法与一级培养基相同。
[0034]将一份二级培养液使用离心管于4°C，6000r/min离心min，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，_20°C保存。
[0035]4)将上述步骤3)的二级培养液按体积百分数为10 %的接种量接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养6d后得到三级培养液。三级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20°C，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定:
[0036]在厌氧瓶中，将上述步骤3)的二级培养液按体积百分数为10%的接种量接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，使用N2吹脱lmin，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，300C，130r/min振荡培养6d后得到三级培养液；其中，三级选择培养基中Na2S的配制比例为2.5g/l,其他成分的配制比例以及配制方法与一级培养基相同。
[0037]将一份三级培养液使用离心管于4°C，6000r/min离心min，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，_20°C保存。
[0038]5)将上述步骤4)的三级培养液按体积百分数为10 %的接种量接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于硫化物消除的微生物复合菌群:
[0039]在厌氧瓶中，将上述步骤4)的三级培养液按体积百分数为10%的接种量接种到无机盐培养基，使用N2吹脱lmin，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30°C，150r/min振荡培养4d后得到用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群。其中，无机盐培养基为:K2HPO4:1.2g/l，KH2PO4:1.2g/l，NH4Cl1.4g/l，MgCl2:0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO3:2g/l，Na2S2O3.5H20:2g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。
[0040]6)将上述步骤5)获得的微生物复合菌群按体积百分数为I %的接种量接种至起始浓度为1000mg/l的无机盐培养基中，30°C，150r/mi