n振荡培养5h后获得菌液，将菌液与65%的甘油按照3:1的比例充分混合后，置于-80°C保存，即可用于微生物复合菌群的保存:
[0041]在锥形瓶中，将上述步骤5)获得的微生物复合菌群按体积百分数为1%的接种量接种至1000mg/l的无机盐培养基，使用招箔封口后置于恒温摇床，30°C，150r/min振荡培养5h后获得菌液。在灭菌的试管中，将菌液与65%的甘油按照3:1的比例加入混合，用铝箔将试管封口后，保存于-80°C冰箱，即为微生物复合菌群的保存。保存后的微生物复合菌群置于30°C的水浴中快速解冻即可重新使用；其中，无机盐培养基为:K2HP04:1.2g/l，KH2P04:
1.2g/l，NH4Cl:0.4g/l，MgCl2:0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO 3:2g/l，Na2S2O3.5H20:3.875g/l，使用灭菌的陈海水进行配制。
[0042]步骤I)和步骤5)中的灭菌的陈海水由陈海水通过121°C灭菌20min后冷却至室温制得。
[0043](2)微生物复合菌群的菌种鉴定
[0044]I)将实施例1中步骤6)得到的微生物复合菌群使用离心管于4°C，6000r/min离心lOmin，倒掉上清液，收集沉淀，使用环境微生物样品总群落基因组DNA提取试剂盒(美国MOB1公司)提取菌剂总DNA，DNA提取方法参考DNA提取试剂盒说明书。
[0045]2)以上述步骤I)得到的DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物BSF8/20:5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ;BSR1541/20:5' -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'进行PCR扩增。PCR反应程序设定为:先94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，59°C退火Imin，72°C延伸1.5min，循环30个周期；然后72°C延伸1min ;最后4°C保存。
[0046]3)将PCR产物电泳，采用胶回收试剂盒(大连宝生物公司)切胶回收，回收方法参考胶回收试剂盒说明书。采用T载体试剂盒(大连宝生物公司)，将切胶回收产物与PMD19-T载体连接，并转化DH5a，37 °C培养过夜，次日进行阳性菌落的PCR检测。菌落 PCR 检测时，采用 pUC 载体通用引物:M13R(-26):CAGGAAACAGCTATGAC ；M13F (-40):GTTTTCCCAGTCACGAC ;直接以菌落为模板进行PCR扩增，反应程序中，预变性温度和时间改为95°C lOmin，其它不变。挑取25个阳性克隆菌落委托测序公司进行测序。
[0047]4)将测得的序列去除载体。通过RDP(https://rdp.cme.msu.edu/)中序列分类程序classifier对序列进行分类，即可得到微生物复合菌群的菌种组成为:芽孢杆菌(Bacillus spp.)、弧菌(Vibr1 spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibr1 spp.)，其数量比例为10:6:5:2。弧菌(Vibr1 spp.)是海洋微生物中常见的兼性厌氧细菌，广泛存在于河口入海处、近海岸的海水、海底沉积物以及近海水产养殖生物体内。假单胞菌(Pseudomonas spp.)功能和存在范围十分广泛，从植物根系到水体环境均有分布，能够氧化利用多种类型的有机物。脱硫弧菌(Desulfovibr1 spp.)是硫酸盐还原菌，细菌生长时能够代谢硫酸盐，广泛分布于含水量高，有机质丰富的土壤或污泥中。芽孢杆菌(Bacillus spp.)分布广泛，常见于土壤、空气、水体和灰尘中，能利用多种类型的有机物，是一种在厌氧环境下也能很好的生长的革兰氏阳性菌。
[0048](3)复合菌群的群落稳定性
[0049]I)将实施例1中步骤I)中用于接种的沉积物，步骤2)、3)、4)中_20°C保存的离心后的培养液沉淀，实施例2步骤3)中离心后的培养基沉淀，共9个样品，使用环境微生物总DNA提取试剂盒(美国MOB1公司)提取菌剂总DNA，得到9个DNA样品，DNA提取方法参考DNA提取试剂盒说明书。
[0050]2)以上述步骤I)中得到的9个DNA样品，以及实施例2步骤I)中得到的DNA，共10个DNA样品为模板，采用细菌 16S rDNA通用引物BAlOlF:5' -TGGCGGACGGGTGAGTAA-3r ；BA534R-GC:5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3 '，进行PCR扩增。PCR反应程序为:预变性94°C，5min ;并接以30个循环包括，94°C变性40s, 55°C退火40s,每一循环降0.1°C , 72°C延伸lmin,循环完毕,72°C延伸5min。
[0051]3)将上述步骤2)中的PCR产物采用B1-Rad公司DcodeTM基因突变检测系统进行DGGE分析。使用梯度混合装置制备30 %至60 %的变性梯度胶，其中变性剂的浓度自上而下依次递增。待胶凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取15 μ L上述步骤
2)中的PCR产物和10 μ L 1X加样缓冲液混合后加入上样孔。在135V的电压下，60°C电泳 Ilh0
[0052]4)电泳结束后，剥胶银染，并获取胶的扫描图，见图2，通过对比分析DGGE图谱中群落的结构变化，揭示微生物复合菌群的群落结构的稳定性。根据图2发现，驯化成功的微生物复合菌群，经过多次应用、长期保存后，菌群的群落结构基本保持不变，表现了很好的遗传稳定性。
[0053]实施例2:本研究微生物复合菌剂对硫化物去除效果
[0054]I)将实施例1中确定的用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选”步骤6)的-80°C保存的微生物复合菌群于30°C水浴快速解冻；
[0055]2)分别将步骤I)中解冻后的微生物复合菌群按体积百分数为10%的接种量接种于硫化物起始浓度为1000mg/l的无机盐培养基中，于厌氧瓶中，30°C，150r/min恒温振荡培养。其中，无机盐培养基为=K2HPO4:1.2g/l，KH2PO4-L 2g/l，NH4Cl1.4g/l，MgCl2=0.2g/1，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHC03:2g/l，Na2S203.5Η20:3.875g/l，使用灭菌的陈海水进行配制。
[0056]同时，将实施例1中确定的微生物选取具体的菌种进行(拟态弧菌、脱硫弧菌、嗜盐假单胞菌、枯草芽孢杆菌)分别用无机盐培养基扩大培养后，按照10:6:5:2的数量比进行复配。
[0057]3)每隔2小时使用碘量法检测厌氧瓶中硫化物的浓度，并计算硫化物的去除率，结果表明，菌剂在2小时以内开始发挥作用，在10小时对起始浓度为1000mg/l的硫化物的去除率达到90%，结果表明本发明的复合微生物菌群具有高效去除沉积物中硫化物的能力。而复配的菌群，其在10小时对起始浓度为1000mg/l的硫化物的去除率达到95%，效果更好。推测原因是去除了菌群中的其它杂菌后，更好的发挥了复配菌中的协同效应。
【主权项】
1.一种用于消除沉积物中硫化物的复合菌群的筛选方法，其特征在于，所述的方法步骤如下: 1)采集近海养殖区的表层沉积物为接种源制成菌悬液， 2)将上述步骤I)的菌悬液按比例接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养后得到一级培养液； 3)将上述步骤2)的接种用的一级培养液按比例接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养后得到二级培养液； 4)将上述步骤3)的接种用的二级培养液按比例接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养后得到三级培养液； 5)将上述步骤4)的接种用的三级培养液按比例接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于沉积物中硫化物消除的复合菌剂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一级选择培养基的组成如下:K2HP04:1.2g/l，KH2PO4:1.2g/l，NH4Cl:0.4g/l，MgCl2=0.2g/l，柠檬酸铁:0.01g/l，NaHCO 3:2g/l，Na2S:1.5g/l ;二级、三级选择培养基组成中Na2S浓度分别提升至2.0g/Ι和2.5g/L,其它不变；使用灭菌的陈海水进行配制。3.由权利要求1所述的方法筛选的复合菌群，其特征在于，所述的复合菌群包含芽孢杆菌、弧菌、假单胞菌和脱硫弧菌。4.如权利要求3所述的复合菌群，其特征在于，所述的芽孢杆菌、弧菌、假单胞菌和脱硫弧菌的数量比例为10:6:5:2o5.权利要求4所述的复合菌群用于生物消除沉积物中硫化物。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的沉积物为海水沉积物。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群，能够解决纯菌生态位狭窄、无法适应沉积物环境、容易在较短时间内被淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。本发明的复合菌群，包含芽孢杆菌(Bacillus？spp.)、弧菌(Vibrio？spp.)、假单胞菌(Pseudomonas？spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibrio？spp.)。本发明的微生物复合菌群的菌种来源于硫化物含量丰富的近海养殖区沉积物，经过驯化获得，避免了在应用时由于环境差异较大而导致的适应过程；且在去除硫化物的过程中，菌群结构能够保持较好的稳定性。
【IPC分类】C12R1/01, C12R1/63, C02F11/02, C12R1/38, C12N1/36, C12R1/07, C12N1/20
【公开号】CN105039234
【申请号】CN201510405484
【发明人】赵阳国, 郑宇 , 白洁, 田伟君, 胡泓, 佘宗莲, 高孟春, 郭亮
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月10日