生防菌株x1发酵培养基及小型发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌XI的发酵培养基及利用该 培养基进行发酵的工艺。
【背景技术】
[0002] 拮抗能力强且抗菌谱广的优良菌种是中草药土传病害生物防治研究和微生物菌 剂研制的关键，而适宜的生产方法和培养条件则是发挥优良菌种性能的保证。在筛选获得 高效广谱生防菌株后，为最终达到产业开发目的，需要对目的菌株进行液体深层发酵研究， 包括适合工业化生产的培养基筛选、液体发酵条件的优化和中试生产工艺的确定。
[0003] 摇瓶发酵与发酵罐发酵对微生物的生长存在很大差异，将摇瓶发酵的实验条件直 接放大到生产罐，菌株的生长往往不相一致。为了能够适应工业生产的需要，消除这两种规 模发酵结果的差异，将摇瓶发酵的实验结果有效的应用到大型生产当中去，就必须经过实 验室小型发酵罐发酵条件研究。在了解菌株在发酵罐中的代谢规律的情况下，合理建立小 型发酵罐的发酵工艺后，才能进行中试规模的发酵研究或工厂规模的发酵研究。
[0004] 中间试验是小试完成后，在概念设计基础上进行的，介于实验室装置与工业装置 之间的研究型试验，是工程研究的基础，也是过程开发的一个重要环节。通过中试后，可使 工业装置获取相对较大的安全系数，及早发现实验室工作无法观察到的现象，纠正设计中 可能出现的失误。中试工作必须按工业化条件进行，其目的和作用如下：（1)建立一定规模 的工业模拟装置，对新工艺过程进行全面模拟考察，明确操作条件和控制方法。（2)考察实 验室研究结果在工业规模下实现的技术及经济可行性。（3)考察工业因素对工艺过程和设 备的影响，发现和解决实际生产条件下可能发生的各种问题。
[0005] -般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的 深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不 同所致。发酵罐的规模变化，无论是绝对值还是相对值都会引起许多物理和生物参数的改 变，从而很难使大、小规模过程中菌体所处的外界环境保持一致，在放大生产时就会常常出 现发酵生产水平不稳定或者发酵产率太低，最终导致研究成果长期停留在实验室的研究阶 段，无法进行大规模生产应用。要将实验室研究中的优化培养或发酵结果转移到工业规模 的发酵生产过程中去，保证规模放大后能够在大规模的工业化生产中同样取得成功的效 果，则需要进行规模更大一些的发酵条件的研究或工厂规模的中间试验，以验证在实验室 研究阶段的发酵工艺，然后才能放大到工厂规模的发酵生产。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种生防菌株XI发酵培养基及小型发酵工艺，为进行该菌 株的工业化生产提供实验基础和依据。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种生防菌株XI发酵培养基，包括如下成分：葡萄糖1. 0~1. 5%，酵母膏0. 5~ 0.8%，淀粉0? 1~0.3%，磷酸氢二钠0.2~0.4%，磷酸二氢钠0? 10~0.20%，硫酸镁 0. 04~0.06 %，碳酸钙0.05~0. 15 %，硫酸锰0.05~0. 15%，加蒸馏水至1000毫升，调 节pH7. 5-8. 0,115°C灭菌 25 分钟。
[0009] -种利用上述培养基对生防菌株XI进行小型发酵的工艺，包括如下步骤：
[0010] (1)用4~6mLNYD培养基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后转接入装有 80~120mL种子培养基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min条件下培养16~ 18h，制成种子发酵液。
[0011] (2)将种子发酵液接种到装有60~80L培养基的100L发酵罐中通气搅拌培养，保 持发酵温度28~30°C;搅拌速度100~120r/min;通气量0. 8~1. 0 (V/V?min);接种量 1. 5~2. 0% ;发酵时间36~40h。
[0012] 本发明具有如下优点：
[0013] 1、培养基简单易得且成本低，所有成分可溶解，为生产后期处理方便可行；
[0014] 2、本发明对生防菌株XI进行小型发酵罐的生产发酵，确定菌株自控发酵工艺，为 大规模的工业化生产提供了技术依据。
【附图说明】
[0015] 图1为菌株XI生长曲线（100L);
[0016] 图2为不同培养时间菌液的pH值（100L)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，
[0018] 凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神 和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0019] 本发明提供了一种生防菌株XI的小型发酵工艺，包括以下内容：
[0020] 1材料与方法
[0021] 1. 1 菌株
[0022]生防菌株 XI:CGMCCN0. 4037。
[0023] 1. 2培养基
[0024] 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氢二钠0.3%，磷酸二氢钠0. 15%， 硫酸镁0. 05%，碳酸钙0. 01 %，硫酸锰0. 01 %。调节PH7. 5-8. 0,115°C灭菌25分钟。
[0025]1. 3生防菌株XI的100L自控罐液体深层发酵研究
[0026] 采用发酵罐（江苏镇江MCGS-100L)进行发酵培养，其操作如下：
[0027] (1)培养前的发酵罐要做好准备工作，确保电源供应，检查冷却水水源，检查空气 气源；在发酵罐内注入培养基，培养基必须浸没搅拌桨叶；打开排气过滤器顶部的排气阀；
[0028](2)在温度控制器上设定发酵温度和灭菌温度；
[0029] (3)选择控制模式中的"灭菌"项，灭菌开始；
[0030] (4)灭菌结束后，待温度冷却到发酵温度后，在接种口上方点燃缠酒精棉的铁圈， 打开接种口，接入培养好的种子液；选择控制模式中的"发酵"项，发酵开始；
[0031](5)定时取发酵液，检测菌浓度和芽孢形成状况，确定最佳的培养时间。
[0032] 用5mLNYD培养基活化存于-70 °C冰柜中枯草芽孢杆菌菌种，然后转接入装有 100mL种子培养基的500mL三角瓶中，于30°C，150r/min条件下培养18h，制成种子发酵液。 将种子发酵液按1.5%的接种量接种到装有751培养基的（1?1^-1001)发酵罐中，在30 1€ 的条件下，保持通氧量在50%的水平，通气搅拌培养。在发酵过程中，每隔6h取样测定发酵 液的〇D6。。值，绘制菌株生长曲线。另外每隔8h取样测定发酵液的pH值。
[0033] 2结果与分析
[0034] 在生防菌株XI的中试发酵中，为了降低生产成本，提高芽孢形成率，用酵母膏替 代培养基中的牛肉膏，同时增加了MgS04、CaC03和、MnS0 43种无机盐成分，以优化的培养条 件（培养温度30°(：，初始？11值7.5，接种龄16~1811)为基本条件，在751装液量，1.5%接 种量下以转速180r/min，通气量1:1VVM进行XI菌株100L罐的自控发酵。
[0035] 2. 1菌株生长曲线的测定
[0036] 在液体发酵过程中，菌体形态和菌液浓度直接反映菌株的生长情况。菌体形态可 通过显微镜观察；菌液浓度的测定是衡量生产菌在整个培养过程中菌体量的变化。一般发 酵前期菌浓度增长很快，中期菌浓度基本恒定。在本发明中菌体生长延滞期很短，之后进入 对数生长期，经过24h对数生长期结束，菌体的生长转入平稳期（见图1)，菌体在30h左右 开始形成芽孢，40h达到最大值，芽孢形成率达95%以上。
[0037] 2. 2发酵液pH值的测定
[0038] 发酵液pH值是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参 数。在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然会发 生变化，通过观察pH值变化规律可以了解发酵的正常与否。
[0039] pH值的变化是微生物代谢状况的综合反映一一基质代谢、产物合成、细胞状态、营 养状况、供氧状况。在XI菌株100L自控罐发酵过程中，培养液初始pH值调为7. 5,发酵 前期随着菌体的生长和繁殖，发酵液的pH值逐渐下降，说明菌体大量利用糖产生了酸性物 质。当发酵至20h时，发酵液的pH值下降至6. 5,而后开始逐步回升，此时芽孢开始逐渐形 成，发酵至30h时，发酵液的pH值已升至7. 8,持续至下罐时，发酵液的pH值保持在8. 0左 右（见图2)。
[0040] 2. 3发酵液活芽孢数的测定
[0041] 在XI菌株每一批100L自控罐发酵结束后，取菌液测定发酵液中的活芽孢数。结 果5批次发酵菌液的活芽孢数为14. 1~16. 3亿/mL，平均为14. 9亿/mL(见表1)。
[0042] 表1 XI菌株100L自控罐发酵结果
[0043]
【主权项】
1. 一种生防菌株Xl发酵培养基，其特征在于所述培养基配方如下：葡萄糖1.0 ~ 1. 5%，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氢二钠0. 2~0. 4%，磷酸二氢钠 0? 10~0.20%，硫酸镁0.04~0.06%，碳酸钙0.05~0? 15%，硫酸锰0.05~0? 15%，加 蒸馏水至1000毫升。2. 根据权利要求1所述的生防菌株Xl发酵培养基，其特征在于所述培养基配方如下： 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氢二钠0.3%，磷酸二氢钠0. 15%，硫酸镁 0. 05%，碳酸钙0. 01 %，硫酸锰0. 01 %。3. -种生防菌株Xl小型发酵工艺，其特征在于所述工艺步骤如下： (1) 用4~6mLNYD培养基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后转接入装有80~ 120mL种子培养基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min条件下培养16~18h， 制成种子发酵液。 (2) 将种子发酵液接种到装有60~80L培养基的100L发酵罐中通气搅拌培养，培养基 配方如下：葡萄糖I. 〇~1. 5 %，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氢二钠0. 2~ 0. 4 %，磷酸二氢钠0. 10~0. 20 %，硫酸镁0. 04~0. 06 %，碳酸钙0. 05~0. 15 %，硫酸锰 0. 05~0. 15 %，加蒸馏水至1000毫升，保持发酵温度28~30°C;搅拌速度100~120r/ min;通气量0? 8~I. 0V/V?min;接种量L5~2. 0% ;发酵时间36~40h。4. 根据权利要求3所述的生防菌株Xl小型发酵工艺，其特征在于所述培养温度30°C， 装液量75L，接种量1. 5%，转速180r/min，通气量I. 0V/V ? min。
【专利摘要】本发明公开了一种生防菌株X1发酵培养基及小型发酵工艺，所述培养基包括如下成分：葡萄糖1.0～1.5％，酵母膏0.5～0.8％，淀粉0.1～0.3％，磷酸氢二钠0.2～0.4％，磷酸二氢钠0.10～0.20％，硫酸镁0.04～0.06％，碳酸钙0.05～0.15％，硫酸锰0.05～0.15％，加蒸馏水至1000毫升，调节pH7.5-8.0，115℃灭菌25分钟。小型发酵工艺如下：(1)用4～6mLNYD培养基活化存于-70℃冰柜中生防菌株X1，然后转接入装有80～120mL种子培养基的500mL三角瓶中，于20～40℃，100～200r/min条件下培养16～18h，制成种子发酵液。(2)将种子发酵液接种到装有60～80L培养基的100L发酵罐中通气搅拌培养。本发明可为进行该菌株的工业化生产提供实验基础和依据。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/125
【公开号】CN105039230
【申请号】CN201510599801
【发明人】李晶, 于丽萍, 姜竹, 张淑梅, 孟利强, 陈静宇, 曹旭, 姜威, 刘宇帅, 胡基华
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年9月18日