一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法。
【背景技术】
[0002]肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。目前肝衰竭治疗手段中，生物人工肝系统是最佳的选择。生物型人工肝是指将同种或异种动物的器官、组织和细胞等与特殊材料、装置结合，构成的人工肝支持系统，暂时替代肝脏功能，从而协助治疗。
[0003]生物型人工肝包括以往的离体肝灌流、人-哺乳类动物交叉灌流等等，主要的决定修复体性质的关键是其中采用的人工细胞的材料。但是，目前所构建的各种细胞材料都有其各自的优缺点。比如，动物源性肝细胞来源比较广，可大量获得，但是其带有动物源性疾病，容易产生异种蛋白的免疫排斥和免疫致病。另一种能够大量获得的就是肿瘤来源的肝细胞系，其可大量增殖并规模培养，但具有肿瘤性状，肝细胞的功能不如正常肝细胞，且有致瘤的风险。而相比上两种，胎肝细胞虽较理想，且缺陷比较少，但本身来源受限，且培养和制备的过程中条件非常严格控制，制备难度高且产量也较少，不易大量获得。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，实现了体外肝细胞的大量培养。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0006]—种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，包括如下步骤:
[0007]S1、将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，60g-260g离心3-1 Imin，去除微孔培养板表面多余细胞悬液后，置于肝细胞无血清培养液培养；
[0008]S2、培养完成后，收集步骤SI所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；
[0009]S32、将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养；
[0010]所述肝细胞无血清培养液包括以下组分:
[0011]基础培养基500mL、胰岛素0.5?l.lyg/mL、亚砸酸钠6?10yg/L、表皮生长因子5?110ng/mL、肝细胞生长因子5?110ng/mL、纤粘连蛋白0.3?1.3yg/mL、地塞米松0.3?10.3nmol/mL和奶蓟草提取物50?110mg/L;
[0012]所述肝细胞无血清培养基包括以下组分:
[0013]01^1作12高糖培养基5001^、表皮再生丝素蛋白纤维0.05?0.5%、地塞米松0.1?1100nmol/mL、葛仙米提取物50?110mg/L、肝细胞生长因子10?25ng/mL、青链霉素50?100U/mL，胰高血糖素0.05?5yg/mL、海藻酸钠5?10yg/L、去端肽胶原0.05?0.5%。
[0014]优选地，所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡
[0015]优选地，所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为10?50ng/mL。
[0016]优选地，所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的1.3Χ1(Γ3?4.3Χ1(Γ3%0
[0017]优选地，所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为350nm?7μηι。
[0018]优选地，所述原代肝细胞的培养时间为12_48h。
[0019]优选地，所述步骤S2按照SV40Tag与原代细胞数比为1x10—5?1x10—4yg/个的转染量进行转染;和/或按照所述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为1x10—5?1x10—Vg/个的转染量进行转染。
[0020]本发明具有以下有益效果:
[0021 ]利用力学紧凑种植原代肝细胞，可以使肝细胞间排列紧凑，形成紧密接触，肝细胞可以快速形成高密度培养;采用无血清培养基配方，使其更适合肝细胞的生长及功能发挥，从而实现了体外肝细胞的大量培养。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]本具体实施中按照SV40Tag与原代细胞数比为1x10—5?1x10—4yg/个的转染量进行转染;和/或按照所述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为1x10—5?1x10—Vg/个的转染量进行转染，所使用的再生丝素蛋白纤维的直径范围为350nm?7μηι。
[0024]实施例1
[0025]S1、将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，60g离心llmin，去除微孔培养板表面多余细胞悬液后，置于肝细胞无血清培养液培养12h;
[0026]S2、培养完成后，收集步骤SI所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；
[0027]S32、将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养；
[0028]所述肝细胞无血清培养液包括以下组分:
[0029]基础培养基500mL、胰岛素0.5yg/mL、亚砸酸钠6yg/L、表皮生长因子5ng/mL、肝细胞生长因子5ng/mL、纤粘连蛋白0.3yg/mL、地塞米松0.3nmol/mL和奶蓟草提取物50mg/L;
[0030]所述肝细胞无血清培养基包括以下组分:
[0031]0腿1作12高糖培养基50011^、表皮再生丝素蛋白纤维0.05%、地塞米松0.1醒01/mL、葛仙米提取物50mg/L、肝细胞生长因子10ng/mL、青链霉素50U/mL，胰高血糖素0.05yg/mL、海藻酸钠5yg/L、去端肽胶原0.05%，所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡;所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为10ng/mL，所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的1.3Χ1(Γ3。
[0032]实施例2
[0033]S1、将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，260g离心3min，去除微孔培养板表面多余细胞悬液后，置于肝细胞无血清培养液培养48h;
[0034]S2、培养完成后，收集步骤SI所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；