r>[0035]S32、将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养；
[0036]所述肝细胞无血清培养液包括以下组分:
[0037]基础培养基500mL、胰岛素1.lyg/mL、亚砸酸钠10yg/L、表皮生长因子110ng/mL、肝细胞生长因子110ng/mL、纤粘连蛋白1.3yg/mL、地塞米松10.3nmol/mL和奶蓟草提取物110mg/L；
[0038]所述肝细胞无血清培养基包括以下组分:
[0039]DMEM/F12高糖培养基500mL、表皮再生丝素蛋白纤维0.5%、地塞米松IlOOnmol/mL、葛仙米提取物110mg/L、肝细胞生长因子25ng/mL、青链霉素100U/mL，胰高血糖素5yg/mL、海藻酸钠lOyg/L、去端肽胶原0.5%，所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡;所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为50ng/mL，所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的4.3 X 1(Γ3 %。
[0040]实施例3
[0041]S1、将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，160g离心7min，去除微孔培养板表面多余细胞悬液后，置于肝细胞无血清培养液培养30h;
[0042]S2、培养完成后，收集步骤SI所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；
[0043]S32、将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养；
[0044]所述肝细胞无血清培养液包括以下组分:
[0045]基础培养基500mL、胰岛素0.8yg/mL、亚砸酸钠8yg/L、表皮生长因子57.5ng/mL、肝细胞生长因子57.5ng/mL、纤粘连蛋白0.8yg/mL、地塞米松5.3nmol/mL和奶蓟草提取物80mg/L；
[0046]所述肝细胞无血清培养基包括以下组分:
[0047]DMEM/F12高糖培养基500mL、表皮再生丝素蛋白纤维0.275 %、地塞米松550.05nmol/mL、葛仙米提取物80mg/L、肝细胞生长因子17.5ng/mL、青链霉素75U/mL，胰高血糖素2.525yg/mL、海藻酸钠7.5yg/L、去端肽胶原0.275%,所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡;所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为30ng/mL，所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的2.8Χ1(Γ3%。
[0048]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于稳定增殖的同时保持肝细胞的特性，包括如下步骤: 51、将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，60g-260g离心3-1Imin，去除微孔培养板表面多余细胞悬液后，置于肝细胞无血清培养液培养； 52、培养完成后，收集步骤SI所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞； S32、将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养； 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分: 基础培养基500mL、胰岛素0.5?l.lyg/mL、亚砸酸钠6?10yg/L、表皮生长因子5?110ng/mL、肝细胞生长因子5?110ng/mL、纤粘连蛋白0.3?1.3yg/mL、地塞米松0.3?10.3nmol/mL和奶蓟草提取物50?110mg/L; 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分: 01^1邝12高糖培养基50011^、表皮再生丝素蛋白纤维0.05?0.5%、地塞米松0.1?1100nmol/mL、葛仙米提取物50?110mg/L、肝细胞生长因子10?25ng/mL、青链霉素50?100U/mL，胰高血糖素0.05?5yg/mL、海藻酸钠5?10yg/L、去端肽胶原0.05?0.5%。2.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡。3.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为10?50ng/mL。4.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的1.3Χ1(Γ3?4.3X 1(Γ3%。5.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为350nm?7μηι。6.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述原代肝细胞的培养时间为12-48h。7.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，其特征在于，所述步骤S2按照SV40Tag与原代细胞数比为I X 10—5?I X 10—4yg/个的转染量进行转染;和/或按照所述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为I X 10—5?I X 10—Vg/个的转染量进行转染。
【专利摘要】本发明公开了一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法，包括如下步骤：将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板，离心后置于肝细胞无血清培养液培养；培养完成后，收集原代肝细胞，并转染成改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养；所述肝细胞无血清培养液包括基础培养基、胰岛素、亚硒酸钠、表皮生长因子、肝细胞生长因子、纤粘连蛋白、地塞米松和奶蓟草提取物；所述肝细胞无血清培养基包括高糖培养基、表皮再生丝素蛋白纤维、地塞米松、葛仙米提取物等。本发明利用力学紧凑种植原代肝细胞，可以使肝细胞间排列紧凑，形成紧密接触，肝细胞可以快速形成高密度培养；采用无血清培养基配方，使其更适合肝细胞的生长及功能发挥，从而实现了体外肝细胞的大量培养。
【IPC分类】C12N5/10, C12N5/071
【公开号】CN105505883
【申请号】CN201610038988
【发明人】杨献光, 王棋文, 靳伟, 常翠芳, 朱琳, 和春翠
【申请人】河南师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月12日