食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体设及食管癌顺销耐药性细胞株及其构建方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 食管癌是一种常见的食道恶性肿瘤，其中食管腺癌和食管鱗癌是最常见的食管 癌，食管腺癌主要发生在食管下部和食管与胃连接的部位，而食管鱗癌主要发生于食管的 上部和食管的中部。我国的食管癌患者大多为食管鱗状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，占了食管癌患者的90%W上，而在西方国家，食管腺癌的发病率较 高。无论是食管腺癌还是食管鱗癌，其早期一般无发病症状，直到晚期病症才会凸显，因此， 人们很容易忽略早期食管腺癌和食管鱗癌的存在，待发现时已经错过了治疗食管癌的最佳 时机。
[0003] 临床上用于治疗食管癌的主要方式有：手术治疗、化疗治疗、放疗治疗和药物治 疗。手术切除后辅助化学疗法是早期食管癌患者的主要治疗方式，但是上述方法对末期食 管癌患者治疗效果不理想，而且副作用大。目前，临床上主要采用药物治疗食管癌，主要治 疗食管癌的药物有:顺销、五氣尿喀晚、紫杉醇等，但是上述药物在治疗食管癌的过程中存 在选择性差，易出现耐药性的缺点。因此，研究食管癌耐药机制并且有效预防或逆转食管癌 耐药现象是目前亟需解决的难题。
[0004] 近年来，肿瘤耐药细胞株已成为肿瘤细胞耐药机制研究、开发新型抗肿瘤药物及 评价新的肿瘤治疗方法的重要工具。目前，国内外已经建立了很多肿瘤的耐药细胞株。中国 专利申请201410161660.8公开了 一种肝细胞癌索拉菲尼耐药细胞株及其构建方法，中国专 利申请201410183516.4公开了一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株及其构 建方法和应用，中国专利申请201510187748.1公开了曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株及 其制备方法和应用。但目前尚无食管癌对顺销的耐药细胞株。因此，建立食管癌对顺销的耐 药细胞株具有重要的临床价值。
【发明内容】
[000引为了解决现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供食管癌顺销耐药性的细 胞株。
[0006]本发明提供了食管癌顺销耐药性细胞株，通过W下步骤构建得到： S1将食管癌细胞株放置在36-38°C、4-6%0)2、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养； S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺销的培养 液，所述顺销的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2 ml 膜蛋白酶-EDTA消化液，接着W1 X lOVml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38°C、4-6%0)2、 湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺销处理，24小时后换 新鲜的培养液，维持顺销的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株； S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺销的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺销的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.化g/ml顺销的培 养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。
[0007] 进一步地，所述的食管癌顺销耐药性细胞株通过W下步骤构建得到： S1将食管癌细胞株放置在37°C、5%0)2、湿度为96%条件下的培养箱中培养； S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺销的培养液， 所述顺销的作用浓度为0. 〇3μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5 ml膜蛋白酶-邸TA消化液，接着X lOVml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37°C、5%0)2、湿度为96%的条 件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺销处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺 销的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株； S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺销的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺销的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.扣g/ml顺销的培养体系中 稳定生长、传代的细胞株，即得。
[0008] 进一步地，所述步骤S1的食管癌细胞为食管癌细胞Eca-109和食管癌细胞EC-9706;所述食管癌细胞Eca-109的培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液;所述食管癌 细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。
[0009] 进一步地，所述步骤S3中适当增加顺销的作用浓度是采用0.02-0.04μg/ml、 0.05-0.07μg/ml、0.12-0.1 ：3μg/ml、0.2-0.3yg/m巧日0.4-0.6μg/ml 5个浓度梯度，优选地， 所述步骤S3中适当增加顺销的作用浓度是采用0.03μg/ml、0.06μg/ml、0.12扣g/ml、0.2扣 g/ml和0.化g/ml 5个浓度梯度。
[0010]进一步地，所述食管癌细胞Eca-109细胞株对顺销的耐药倍数为11.46倍;所述食 管癌细胞EC-9706细胞株对顺销的耐药倍数为11.15倍。
[0011] 另外，本发明的目的之二在于提供一种食管癌顺销耐药性细胞株的构建方法，包 括W下步骤： S1将食管癌细胞株放置在36-38°C、4-6%0)2、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养； S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺销的培养 液，所述顺销的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2 ml 膜蛋白酶-EDTA消化液，接着W1 X lOVml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38°C、4-6%0)2、 湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺销处理，24小时后换 新鲜的培养液，维持顺销的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株； S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺销的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺销的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.化g/ml顺销的培 养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。
[0012] 进一步地，所述步骤S1的食管癌细胞为食管癌细胞Eca-109和食管癌细胞EC-9706; 所述食管癌细胞 Eca-109 的培养液为含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液; 所述食管癌 细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。
[0013] 进一步地，所述步骤S3中适当增加顺销的作用浓度是采用0.02-0.04μg/ml、 0.05-0.07μg/ml、0.12-0.1 ：3μg/ml、0.2-0. ：3μg/ml和0.4-0.化g/ml 5个浓度梯度。
[0014] 此外，本发明的目的之Ξ在于提供食管癌顺销耐药性细胞株在筛选逆转肿瘤耐药 性药物中的应用。
[0015] 本发明的目的之四在于提供食管癌顺销耐药性细胞株在制备抗肿瘤药物中的应 用。
[0016] 顺销（(^3-0;[油101'0山日111；[]1日91日1:;[]111111(11)，。00?)是^二价销同两个氯原子和两 个氨分子结合的重金属络合物，其化学名为顺式二氨基二氯络销，分子式为Pt(NH3)2Cb， CAS号为15663-27-1。顺销是细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复 制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的抗癌作用。临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、 肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋己瘤、头颈部鱗癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能 显不疗效。
[0017] 本发明构建得到的食管癌顺销耐药性细胞株为研究耐药肿瘤细胞形态血及生物 血特点、研究食管癌顺销耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发食管癌耐药 逆转药物、研发更有效的食管癌治疗方法提供了有效的耐药食管癌细胞模型，可W有效的 促进食管癌耐药机制的研究，提高食管癌患者的治疗效果。
[0018] 本发明通过细胞形态学观察、生长曲线、药物敏感试验和药物耐药性试验，评价食 管癌顺销耐药性细胞株的生物学特性，成功构建了食管癌Eca-109/cDDP和食管癌EC-9706/ 〇00口耐药株。其中，食管癌细胞6〇曰-109细胞株对顺销的耐药倍数(31)为11.46倍，食管癌细 胞EC-9706细胞株对顺销的耐药倍数(RI)为11.15倍，对研究食管癌耐药机制、寻找克服食 管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药方面具有重要的作用。
【附图说明】： 图1为Eca-109细胞和Eca-109/cDD巧舌细胞光学显微镜图； 图2为EC-9706细胞和EC-9706/c孤P活细胞光学显微镜图； 图3为食管癌细胞Eca-109及Eca-109/cDDP的生长曲线图； 图4为食管癌细胞EC-9706细胞和EC-9706/d)DP的生长曲线图； 图5为顺销对食管癌细胞Eca-109及Eca-109/cDDP的抑制作用图； 图6为顺销对食管癌细胞EC-9706细胞和EC-9706/d)DP的抑制作用图； 图7为顺销对食管癌细胞Eca-109及Eca-109/cDDP的耐药指数图； 图8为顺销对食管癌细胞EC-9706细胞和EC-9706/c孤P的耐药指数图。
【具体实施方式】
[0019] W下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但运并非是对本发明的限 审IJ，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可W做出各种修改或改进，但是只要不脱离本 发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明的各组分均为常规市售产品，顺销购于美 国sigma,货号为P4394;RPMI-1640购于美国GIBC0,货号31800-105;DMEM化igh glucose)购 于美国GIBC0,货号为12100;DMS0购于上海久亿化学试剂有限公司，货号为20120322;膜蛋 白酶-邸TA消化液购于南京凯基生物科技发展有限公司，货号为KGY001。
[0020] 实施例1、食管癌细胞Eca-109细胞株的构建 S1将食管癌细胞Eca-109在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，放置37°C、5%0)2、 湿度为96%条件下的培养箱中培养； S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺销的培养液， 所述顺销的作用浓度为ο. 〇3μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5 ml膜蛋白酶-邸TA消化液，接着X lOVml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37°C、5%0)2、湿度为96%的条 件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺销处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺 销的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株； S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺销的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺销的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.扣g/ml顺销的培养体系中 稳定生长、传代的细胞株，即得。
[0021 ]实施例2、食管癌细胞EC-9706细胞株的构建 S1将食管癌细胞EC-9706在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置37°C、5%0)2、湿度 为96%条件下